Avaliando intervenções terapêuticas no modelo de camundongo deficiente em SHIP de ileíte e fibrose semelhantes à doença de Crohn

Utilizamos camundongos deficientes em SHIP para estudar os mecanismos que impulsionam a inflamação intestinal e a fibrose na doença de Crohn e para avaliar novos medicamentos ou estratégias terapêuticas para tratar a doença de Crohn. Por isso, usamos esse modelo em estudos pré-clínicos para mostrar a eficácia dos medicamentos para DII de glicogênio na administração direcionada de medicamentos. Nosso protocolo utiliza camundongos deficientes em SHIP, que naturalmente desenvolvem inflamação ileal e fibrose, fornecendo um modelo fisiologicamente mais relevante do que os modelos tradicionais induzidos quimicamente ou baseados em lesões.

Nossos achados estabelecem camundongos deficientes em SHIP como um modelo robusto de inflamação e fibrose ileal, possibilitando estudos mecanicistas e testes pré-clínicos de terapias para a doença de Crohn. Para começar, jejue os camundongos por quatro horas antes de realizar o ensaio. Dissolva quatro kilodalton de FITC-dextran em PBS estéril para atingir uma concentração final de 80 miligramas por mililitro.

Em seguida, prenda delicadamente cada camundongo e administre 150 microlitros da solução de FITC-dextrano via gávage oral, depois mantenha os camundongos sem comida por mais quatro horas após o gavage. Após a eutanasia do rato, realize a punção cardíaca usando uma agulha calibre 25 e uma seringa de um mililitro para coletar sangue. Adicione imediatamente 10 microlitros de solução ácido-citrato-dextrose a cada 100 microlitros de sangue coletado como anticoagulante.

Misture bem invertendo o tubo várias vezes. Centrifuge as amostras de sangue coletadas a 1.500 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira cuidadosamente o plasma para tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro rotulados.

Mantenha todas as amostras no gelo e protegidas da luz até que estejam prontas para análise. Agora, dilua cada amostra de plasma em proporções de um a dois e um a dez usando PBS. Adicione 100 microlitros de cada diluição de plasma em uma placa opaca de 96 poços, colocando-os em poços duplicados.

Realize uma a duas diluições seriadas do material original de 80 miligramas por mililitro de FITC-dextrano usando PBS para preparar diferentes concentrações da solução. Adicione 100 microlitros de cada diluição em poços duplicados da placa de 96 poços. Depois, meça a fluorescência usando um leitor de microplacas ajustado para 485 nanômetros para excitação e 535 nanômetros para emissão.

Após a coleta de sangue Para o ensaio FITC-dextrano, excise cuidadosamente todo o intestino delgado do camundongo. Remova suavemente qualquer gordura e tecido conjuntivo anexados do intestino. Deite o intestino limpo plano sobre uma folha de papel branco em branco para realçar o contraste visual.

Examine o tecido visualmente em busca de sinais macroscópicos de doença, prestando atenção especial aos 10 centímetros distais em camundongos knockout SHIP, onde a inflamação ocorre comumente. Alinhe o intestino junto a uma régua para fornecer escala e fotografe todo o espécime para documentar quaisquer achados patológicos graves. Lave suavemente o lúmen intestinal com PBS usando uma seringa para remover qualquer conteúdo intestinal, evitando força excessiva para evitar distorção da vilosidade e da arquitetura criptográfica.

Identificar a região do íleo distal mais representativa da patologia macroscópica e retirar aproximadamente um centímetro de tecido. Coloque o tecido excisado plano em uma fita histológica e o coloque entre duas esponjas para evitar dobras durante a fixação. Para a coloração por hematoxilina e eosina e a coloração tricroma de Masson, fixe o tecido em formalina tamponada 10% neutra, usando de 10 a 20 vezes o volume do tecido durante a noite, a quatro graus Celsius.

Após a fixação, transfira as fitas para 70% de etanol para armazenamento e certifique-se de que permaneçam completamente submersas até o processamento. Para a coloração de azul alciano e ácido-Schiff periódica, fixe o tecido na solução de Carnoy durante a noite a quatro graus Celsius. Após a fixação, transfira as fitas para 100% de etanol para armazenamento até o processamento.

Depois, infunda os tecidos fixos em parafina e seção-os em fatias de cinco micrômetros para a coloração subsequente. Avalie as seções ileais coloridas com hematoxilina e eosina usando uma escala de 16 pontos de acordo com critérios histopatológicos definidos. Avalie as seções transversais tingidas tricromado de Masson usando uma escala de seis pontos baseada em critérios pré-definidos.

Calcule a pontuação final de fibrose como a mediana das pontuações atribuídas por dois revisores independentes que não têm conhecimento das condições experimentais. Após a dissecação e remoção da amostra histológica, colete a porção restante dos 10 centímetros distais do íleo. Seque o lenço coletado com papel toalha ou lenço sem fiapos, depois registre o peso do tecido usando uma balança calibrada.

Congele rapidamente o tecido em nitrogênio líquido antes de armazená-lo a menos 80 graus Celsius para processamento futuro. Quando estiver pronto para processamento, retire o tecido congelado e sempre mantenha-o no gelo. Depois, pese novamente as amostras de tecido para confirmar a massa precisa.

Prepare o tampão de homogeneização adicionando inibidor de protease ao PBS. Use 10 microlitros de tampão por miligrama de tecido. Utilizando um homogeneizador de bancada, homogeneize o tecido ileal de espessura total em um tampão de homogeneização gelado.

Continue até que o homogeneado seja uniforme e livre de fragmentos visíveis de tecido. Enxágue a ponta do homogeneizador cuidadosamente com PBS entre as amostras para evitar contaminação cruzada. Centrifuge o tecido homogena a 10.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Aliquota os supernadantes clarificados em volumes menores para evitar ciclos de congelamento e descongelamento, e então armazene-os a menos 80 graus Celsius para análises futuras. A análise histológica revelou danos intestinais significativamente maiores em camundongos deficientes em SHIP em comparação com controles SHIP. O tratamento com dexametasona reduziu o dano histológico em camundongos deficientes em SHIP, embora a diminuição não tenha sido estatisticamente significativa.

A coloração tricromática de Masson mostrou um aumento significativo na deposição de colágeno em camundongos deficientes em SHIP em relação aos controles SHIP, indicando escores mais altos de fibrose. O tratamento com dexametasona reduziu significativamente a fibrose em camundongos deficientes em SHIP, aproximando os escores dos controles positivos para SHIP. A coloração com azul alciano e PAS confirmou hiperplasia de células caliciformes em camundongos deficientes em SHIP, que foi visivelmente reduzida após o tratamento com dexametasona.

As concentrações de beta de IL-1 foram significativamente elevadas em camundongos deficientes em SHIP em comparação com controles de SHIP. A dexametasona reduziu significativamente as concentrações de IL-1beta em camundongos deficientes em SHIP. As concentrações de MPO foram significativamente elevadas em camundongos deficientes em SHIP em comparação com controles SHIP, e esse aumento foi reduzido pela dexametasona, sem alcançar significância estatística.

As concentrações de LCN-2 também foram elevadas em camundongos deficientes em SHIP, mas valores altos não foram consistentemente reduzidos pela dexametasona. As concentrações de IL-1 beta se correlacionaram positivamente com os escores de dano histológico e fibrose, indicando uma ligação entre inflamação e lesão tecidual. As pontuações de dano histológico se correlacionaram positivamente com as de fibrose, sugerindo que o dano tecidal e a remodelação fibrótica progrediram em paralelo.