Modelo de camundongo com embolia microvascular para microscopia in vivo de dois fótons usando microesferas fluorescentes de poliestireno
21 de novembro de 2025
Este protocolo contém uma descrição detalhada de uma abordagem passo a passo para um modelo de camundongo crônico de janela craniana e embolia microvascular, otimizado para imagens in vivo por microscopia de dois fótons usando microsferas fluorescentes de poliestireno.
Usando esse método de injeção de microsferas, buscamos desvendar as consequências de curto e longo prazo do tampão capilar para investigar possíveis mecanismos de eliminação do êmbolo na rede capilar cerebral. Ele permite imagens in vivo em tempo real e o rastreamento de partículas fluorescentes na rede capilar cortical. As microsferas e as consequências locais podem ser acompanhadas por semanas após a injeção.
Nossos estudos ajudam a entender danos teciduais locais causados por oclusões microvasculares. Esses resultados podem, esperamos, levar a novas estratégias de tratamento. Agora podemos estudar, dia após dia e por semanas, como o bloqueio capilar altera vasos, ativa células, altera o fluxo sanguíneo e danifica a barreira hematoencefálica.
Para começar, belisque o dedo do pé de um camundongo anestesiado para verificar a profundidade da anestesia. Faça uma incisão na linha média de aproximadamente 0,5 centímetro sobre a traqueia abaixo da mandíbula usando tesoura cirúrgica e pinças dissecantes. Dissecar o tecido conjuntivo superficial à fáscia cervical usando pinças de microsutura para expor os músculos hióides esternais subjacentes.
Agora, separe os músculos hióides esternais esquerdo e direito rasgando suavemente o tecido conjuntivo entre eles. Retraa o músculo omohióide direito caudal lateralmente com um gancho de tecido. Certifique-se de que o triângulo carótido direito, incluindo a artéria carótida comum, a artéria carótida interna e a artéria carótida externa, esteja claramente visível.
Em seguida, remova qualquer fascia e tecido adiposo remanescente ao redor da artéria carótida comum. Separe cuidadosamente a artéria carótida comum do nervo vago. Coloque dois fios 4/0 1,5 ao redor da artéria carótida comum e amarre-os frouxamente, garantindo que os nós não atrapalhem o fluxo sanguíneo.
Remover a fáscia e o tecido adiposo da artéria carótida interna e da artéria parietal posterior. Em seguida, liga temporariamente a artéria parietal posterior e todos os ramos internos do lado carótido, incluindo a artéria occipital, amarrando um nó com um fio 4/0 1,5. Remova a fáscia e o tecido adiposo da artéria carótida externa e da artéria temporal.
Coloque dois nós soltos ao redor da artéria carótida externa e da artéria temporal usando fios tamanho 4/0 1.5. Posicione o fio mais distal possível o mais longe possível da bifurcação em forma de Y e use-o para ligar permanentemente a artéria carótida externa e a temporal. Deixe o nó proximal solto.
Homogeneize e sonicize as microesferas de 10 micrômetros para obter uma suspensão uniforme das partículas individuais. Adicione 20 microlitros de microesferas homogeneizadas a 140 microlitros de FITC-Dextrano para obter um volume final de 160 microlitros de mistura contendo 1,44 vezes 10 para a potência de cinco microsferas. Retrai brevemente a seringa conectada ao cateter para criar uma câmara de ar.
Depois, mergulhe a ponta do cateter na mistura preparada de FITC-Dextran/Tween20/microsfera e puxe lentamente a seringa até que a mistura fique no cateter. Certifique-se de que não haja bolhas de ar no cateter. Coloque a seringa com o cateter carregado na bomba da seringa.
Ajuste a bomba para 10 microlitros por minuto e funcione até que uma pequena gota de mistura de microesferas apareça na ponta do cateter. Agora, coloque um clipe de vaso na artéria carótida interna e aperte um dos nós proximais previamente preparados ao redor da artéria carótida comum. Usando microtesoura, faça uma pequena incisão diagonal na artéria carótida externa aproximadamente 0,5 milímetros distal do fio de ligadura, garantindo que o tamanho da incisão seja um pouco menor que o diâmetro do cateter.
Absorva qualquer sangue com um pano estéril. Ligue brevemente a bomba da seringa para formar uma gota de mistura de microesferas na ponta do cateter, confirmando que não resta ar na ponta do cateter. Abra a incisão da artéria carótida externa e insira o cateter usando micropinças finas.
Em seguida, fixa o cateter na artéria carótida externa apertando o ponto proximal ao redor da artéria carótida externa. Bombee gradualmente a 10 microlitros por minuto até que a artéria aumente visivelmente e o corante verde FITC preencha a artéria carótida externa, confirmando a injeção bem-sucedida. Em seguida, remova o clipe do vaso da artéria carótida interna.
Depois, aumente a vazão da bomba da seringa para 20 microlitros por minuto. Confirme a injeção bem-sucedida da microsfera verificando que a bifurcação da artéria carótida interna, distal à artéria parietal posterior, está preenchida com o corante FITT. Após o sucesso da injeção, remova o fio que ligava a artéria carótida comum para permitir que a mistura da microsfera flua para a artéria carótida interna.
Durante a injeção, o contraste FITC ainda pode ser observado na artéria carótida externa. Desligue a bomba da seringa assim que a mistura no cateter atingir a marca de 80 microlitros para interromper a injeção. Depois, ligue a artéria carótida comum, prenda a carótida interna e remova suavemente o cateter, mantendo o fio de fixação no lugar.
Ligue permanentemente a artéria carótida externa apertando a rosca que havia fixado o cateter. Remova o clipe do vaso e os fios ao redor da artéria carótida comum, da artéria carótida interna e da artéria parietal posterior para restaurar o fluxo sanguíneo. O sucesso da cirurgia de embolia microvascular foi confirmado por imagens in situ post mortem do corpo e do cérebro completo quatro dias após a cirurgia.
Uma fatia cerebral sagital mostrou alojamento de microesferas no cérebro. Cérebros de camundongos extraídos em um dia após a cirurgia mostraram que microesferas estavam predominantemente alojadas no hemisfério ipsilateral, dentro do território de fluxo das artérias cerebrais média e anterior. A contagem de microsferas em fatias cerebrais aumentou significativamente quando Tween20 foi adicionada à mistura de microsferas.
Os camundongos perderam menos peso e se recuperaram mais rápido após a cirurgia quando injetados com uma mistura de microesferas que continha Tween20. Imagens de microscopia de fluorescência do córtex cerebral tiradas 0,5 horas após a cirurgia mostraram pontos brancos individuais, representando microesferas que obstruem capilares. Imagens de projeção z-stack de dois fótons mostraram microesferas causando embolias microvasculares cerebrais com perfusão comprometida.
Embolias também causam rompimento da barreira hematoencefálica com vazamento visível de corante pelos vasos.
Visão Geral
Este protocolo descreve uma abordagem detalhada, passo a passo, para a criação de uma janela craniana crônica e de um modelo de embolismo microvascular em camundongos, otimizado para imagem in vivo por microscopia de dois fótons. O método utiliza microesferas de poliestireno fluorescentes para investigar os efeitos do bloqueio capilar.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa microvascular
- Técnicas de imagem in vivo
Contexto
- Compreender as consequências das oclusões microvasculares é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento.
- A imagem em tempo real permite o rastreamento de partículas fluorescentes na rede capilar cerebral.
- Estudos anteriores demonstraram que o entupimento capilar pode levar a danos teciduais locais.
- Esta pesquisa tem como objetivo elucidar os mecanismos de eliminação de êmbolos no cérebro.
Objetivo do Estudo
- Investigar os efeitos de curto e longo prazo do entupimento capilar.
- Compreender como as oclusões microvasculares afetam o fluxo sanguíneo e a barreira hematoencefálica.
- Explorar estratégias terapêuticas potenciais para condições relacionadas a danos microvasculares.
Métodos Utilizados
- Criação de uma janela craniana crônica em camundongos para imagem.
- Injeção de microesferas fluorescentes para induzir embolismo microvascular.
- Utilização de microscopia de dois fótons para imagem em tempo real.
- Imagem pós-cirúrgica para confirmar o alojamento das microesferas no cérebro.
Resultados Principais
- As microesferas foram predominantemente alojadas no hemisfério ipsilateral.
- Foram observados aumentos nas contagens de microesferas com a adição de Tween20.
- Camundongos injetados com Tween20 apresentaram recuperação mais rápida após a cirurgia.
- A microscopia de fluorescência revelou obstrução de capilares pelas microesferas.
Conclusões
- Este método permite o estudo detalhado de oclusões microvasculares in vivo.
- Os achados podem levar a novas perspectivas sobre estratégias de tratamento para condições microvasculares cerebrais.
- O estudo aprimora a compreensão da dinâmica do fluxo sanguíneo e do dano tecidual no cérebro.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Modelos de embolismo microvascular utilizando microesferas fluorescentes e microscopia de dois fótons in vivo fornecem uma plataforma robusta para dissecar os mecanismos e consequências das micro-oclusões cerebrais. Essa abordagem permite o rastreamento longitudinal com alta resolução de eventos vasculares e respostas teciduais, reforçando a confiança preditiva na validação precoce de alvos neurovasculares. A reprodutibilidade do modelo e suas saídas quantitativas de imagem o posicionam como um ativo valioso para triagem de portfólio e redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos neurovasculares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação de hipóteses de lesão neurovascular mediante indução controlada de micro-oclusões.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao visualizar respostas vasculares, celulares e da barreira hematoencefálica ao longo do tempo.
- Facilita a validação funcional de alvos ao associar eventos de embolia a danos teciduais downstream e à dinâmica de eliminação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um sistema in vivo validado para avaliação quantitativa da oclusão microvascular e da reperfusão.
- Fornece imagens com alta reprodutibilidade e grande conteúdo informativo, adequadas para padronização de ensaios e comparações entre estudos.
- Permite a triagem de intervenções candidatas direcionadas à eliminação de êmbolos ou à proteção neurovascular.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para doenças de lesão microvascular cerebral para a exploração translacional de biomarcadores.
- Permite a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, possibilitando o monitoramento longitudinal de desfechos.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a quantificação das respostas teciduais e vasculares às micro-oclusões.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico, conectando estudos mecanicistas e pesquisas translacionais na biologia neurovascular.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses sobre lesão microvascular e mecanismos de eliminação utilizando imagem em tempo real.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para avaliação de terapêuticas candidatas in vivo.
- Análises: Permite comparação estatística da carga de embolismo, dano tecidual e recuperação entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas a desfechos relevantes para doenças e ao desenvolvimento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e reutilizável para pesquisa neurovascular e testagem de intervenções.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos neurovasculares e na redução de riscos mecanicistas.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade por meio de protocolos padronizados de imagem e injeção.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de prosseguir ou interromper projetos ao fornecer dados quantitativos e longitudinais sobre desfechos vasculares e teciduais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas neurovasculares com base em evidências robustas in vivo.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microcirurgia, imagem in vivo e análise quantitativa de eventos vasculares.
- Requer acesso à microscopia de dois fótons e à infraestrutura de imagem 3D pós-mortem.
- Necessita padronização entre equipes das misturas de injeção e dos protocolos de imagem para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diversos modelos de camundongos, mas pode exigir otimização para diferentes territórios vasculares.
- Limitações potenciais incluem a complexidade técnica e a necessidade de monitoramento longitudinal dos animais.
