Teste de biodegradação aeróbica de materiais usando um inóculo natural de água do mar marinho e respirômetro de circuito fechado

Nossa pesquisa quantifica a taxa de biodegradação aeróbica e o grau de materiais naturais no ambiente marinho utilizando o inoculo natural da água do mar para comparação de dados. Nossos desafios experimentais atuais incluem capacidade limitada de testes e falta de infraestrutura para atender à crescente demanda por testes de biodegradação, garantindo métodos uniformes e transparentes entre os laboratórios. Para começar, colete de 10 a 20 litros de água do mar em um garrafão de 20 litros lixiviado com ácido usando uma grande garrafa de Niskin.

Transporte o garrafão cheio de volta ao laboratório. Transfira um litro de água do mar total do garrafão de HDPE âmbar de um litro lixiviado por ácido para análise de partículas de carbono e nitrogênio. Filtre-a por uma membrana de acetato de celulose de 0,2 micrômetro, baixa em nitrogênio.

Agora, encha um frasco volumétrico de um, dois ou quatro litros até a metade com água do mar. Se a água do mar tiver matéria orgânica com alto teor de partículas, peneira-a através de uma malha de 20 micrômetros para remover partículas grandes e heterogêneas. Em seguida, colete 60 mililitros de filtrado em uma garrafa de polietileno lixiviado com ácido para análise dissolvida de nitrogênio e fósforo inorgânicos e orgânicos.

Cubra frouxamente a abertura do galão para permitir condições aeróbicas. Armazene no escuro a 30 graus Celsius por até sete dias. Em seguida, coloque de 10 a 15 gramas do substrato experimental em um pote de aço inoxidável de 50 mililitros.

Com uma bola de aço de 20 milímetros. Mergulhe o pote de moagem em nitrogênio líquido por 15 minutos para fragilizá-lo. Prenda o pote de fresagem no acessório do moinho de bolas.

Depois, ajuste o instrumento para 30 hertz e dois minutos e 30 segundos, e pressione start. Realize a moagem quatro vezes com 30 segundos de resfriamento em nitrogênio líquido entre cada ciclo. Moa o substrato até um tamanho de partícula uniforme entre 0,10 e 0,25 milímetros antes do início do teste.

Usando uma balança de precisão com sensibilidade de 0,001 gramas, pese 0,5 gramas por litro de cloreto de amônio e 0,1 grama por litro de fosfato de potássio monobásico. Adicione os nutrientes inorgânicos ao frasco. Leve o volume para marcar usando água do mar.

Depois, coloque uma barra de mexer e mexa em um prato até que todos os sais se dissolvam. Em uma balança analítica, pesar 20 miligramas do substrato experimental ou controle. Registre o peso total da leitura e deixe o frasco de lado.

Para montar os vasos do reator, utilize uma pipeta volumétrica de 75 mililitros lixiviada por ácido, com controlador motorizado e aspire a água do mar para dispensar 75 mililitros da água do mar suplementada com nutrientes em cada embarcação do reator. Remova aproximadamente três mililitros de água do mar de cada embarcação. Depois, coloque-o em uma superfície limpa ao lado do recipiente para enxaguar o substrato moído do frasco rasgado.

Agora transfira o substrato moído para o vaso correspondente do reator a partir do frasco rasgado. Coloque um anel de vedação na borda do vaso do reator. Depois, coloque uma tampa de duas portas sobre o anel de vedação e prenda com uma tampa de rosca.

Conecte cada vaso do reator às suas linhas de gás ou condensação correspondentes. Insira firmemente as linhas de gás nas entradas e saídas apropriadas da tampa. Ligue a plataforma shaker para 0,05G em modo contínuo.

Verifique visualmente que todos os recipientes estejam seguros e depois feche a porta da incubadora. No software do instrumento, navegue até Experimento e clique em Configurar. Insira os números dos canais de início e fim nos menus suspensos correspondentes aos canais ocupados.

Defina o limite de atualização para 0,50. Intervalo de atualização para NA e janela de atualização para Auto. Depois, marque a caixa para sensores de purga em Configuração Diversa.

Certifique-se de que as opções de Medição Automática de Volume, Consumo de Oxigênio Positivo e Ativar o Modo de Fluxo Aberto não estejam selecionadas. Defina o intervalo de amostragem para 8,00. Depois, ajuste as unidades de gás e tempo conforme necessário.

Se estiver usando uma sonda de temperatura primária para correção da temperatura da incubação, certifique-se de que não esteja selecionado o modo Manualmente Introdução das Temperaturas da Câmara. Marque a caixa para Modo Ventilação e certifique-se de que o Modo Drenagem não está selecionado. Agora, selecione Configuração de Câmara e insira os rótulos descritivos dos canais.

Se houver um vazamento, certifique-se de que o anel de vedação esteja limpo, assente e livre de partículas ou fibras. Aperte a tampa do rosca. Inspecione as conexões dos tubos na entrada e saída.

O corte de tubos gastos ou deformados termina com uma lâmina afiada para produzir cortes limpos. No menu, selecione Ferramentas, depois clique no Menu de Serviço e confirme que a sonda de temperatura primária mede 30 graus Celsius com variações de dois graus e está estável. Clique em Executar para iniciar o experimento.

Salve o arquivo do experimento sob um nome descritivo, incluindo a data, e registre o nome do arquivo na ficha técnica. A produção acumulada de dióxido de carbono ao longo de 84 dias confirmou o desempenho esperado. Ao longo de 84 dias, a celulose apresentou rápida produção de dióxido de carbono após um curto intervalo, atingindo cerca de 700 micromoles.

O PHA mostrou uma taxa inicial mais lenta ao longo de três dias. E o controle da água do mar permaneceu baixo, em 150 micromol. As réplicas individuais negativas do controle mostraram baixa variabilidade, com todas as curvas permanecendo próximas umas das outras.

As réplicas controle positivas de celulose apresentaram consistentemente baixa variabilidade, confirmando desempenho estável em todas as quatro réplicas. No conjunto de dados de resultados negativos, o réplica cinco apresentou um pico anômalo na taxa de produção de dióxido de carbono, provavelmente devido à matéria orgânica lábil, mas sua produção acumulada começou a estabilizar em 100 micromoles. Réplicas de uma em cada seis tiveram menor produção acumulada de dióxido de carbono em comparação com outras, sugerindo possíveis problemas técnicos.

O erro padrão da produção média acumulada de dióxido de carbono no controle negativo foi de 2,5%, indicando baixa variabilidade entre os replicados. O erro padrão para o controle positivo da celulose foi de 0,83%, confirmando ainda mais a alta reprodutibilidade do ensaio de biodegradação. PHA apresenta alta mineralização próxima ao controle positivo, com erro padrão comparável ao controle.

Esse protocolo aborda a lacuna nos métodos padronizados acessíveis para a triagem da biodegradabilidade de materiais no ambiente marinho para a indústria, a academia e órgãos reguladores. O protocolo oferece uma forma padronizada mais rápida de medir diretamente essa biodegradação, com duração de teste menor na avaliação simultânea da amostra. O protocolo permite testes padronizados de alta taxa para comparabilidade de materiais e laboratórios para aprendizado de máquina e modelagem preditiva do desempenho dos materiais.