Fluxo de Trabalho Padronizado SDS-PAGE para Perfil Personalizado de Corona de Proteínas na Detecção Precoce de Câncer

Estudamos como as nanopartículas interagem com o sangue para revelar sinais precoces de câncer, visando um teste diagnóstico simples e reproduzível e, em sua maioria, não invasivo. Para começar, dilua a solução padrão de quatro miligramas por mililitro de nano folhas de óxido de grafeno em água ultrapura até a concentração desejada. Sonice a solução diluída por dois minutos a 28% de amplitude, com um pulso de oito segundos ligado e seis segundos desligado para garantir dispersão uniforme.

Quantifique a concentração da solução dispersa usando espectroscopia visível ultravioleta. Em seguida, meça o tamanho hidrodinâmico e o potencial zeta da solução usando espalhamento dinâmico da luz com um laser de néon de hélio de 633 nanômetros. Dilua a amostra em água ultrapura de acordo com os limites de detecção QVet.

Em seguida, dilua o plasma humano liofilizado comercial com água ultrapura conforme necessário. Centrifuge o plasma reconstituído a 18.620 G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Colete o sobrenadante e armazene-o a menos 80 graus Celsius até novo uso.

Agora, quantifique a concentração de proteínas usando o ensaio de ácido bicinconínico para ajustar a diluição do plasma e determinar a proporção ideal de nanopartículas para plasma. Misture o volume selecionado de nanopartículas com plasma para alcançar a proporção alvo entre os dois. Incube a mistura a 37 graus Celsius por uma hora.

Para isolar a coroa proteica, centrifuge as amostras de plasma de nanopartículas a 18, 620 G a quatro graus Celsius por 15 minutos. Lave o pellet resultante com 200 microlitros de água ultrapura. Depois resuspenda e centrifuge novamente.

Após a lavagem final, confirme a presença de um pellet compacto como evidência de isolamento de complexo proteico de nanopartículas. Em seguida, misture o agente redutor, o tampão de carga e a água para alcançar o volume tampão de carga calculado. Ressalte o pellet no buffer de carregamento preparado.

Depois, ferva a suspensão a 100 graus Celsius por 10 minutos. Centrifuge a amostra fervida a 18.620 G a quatro graus Celsius por 15 minutos. Colete o sobrenadante em um novo tubo.

Agora, prepare a escada de proteínas diluindo o padrão de peso molecular em um tampão não corado com o tampão corado. Dilua 10 x Tris-Glicina-SDS de corrida do buffer até uma concentração x. Montar a câmara de eletroforese usando um gel de gradiente livre de coloração de quatro a 20%.

Depois, despeje o buffer de funcionamento até atingir o nível recomendado indicado pelo fabricante. Carregue 10 microlitros de amostra em cada poço. Depois, pipete sete microlitros de escada em cada poço.

Deixe o gel funcionar a 150 volts por aproximadamente 90 minutos em temperatura ambiente. Armazene a imagem gel como um arquivo tiff na mesma pasta dos scripts. Depois, processamento de gel aberto.

M em MATLAB. Insira o nome da imagem do gel como nome da imagem. Depois, insira o índice de uma faixa de escada como marcador de índice.

Execute o roteiro. A conclusão das etapas será indicada na janela de comandos e quatro janelas aparecerão na tela. Agora, abra a figura um com a imagem original do gel em cima e sua correção para o efeito da faixa oblíqua na parte inferior.

Modificar os valores da correção à esquerda e à direita para ajustar os parâmetros da correção. Abra a Figura Dois. Ele contém a imagem corrigida para o efeito de faixa oblíqua no topo e a imagem removida do fundo na parte inferior.

Ajuste o valor de BKG par X no script para ajustar a remoção de fundo. Observe que todas as faixas identificadas são indicadas como linhas brancas verticais na Figura Dois. Agora, abra a Figura Três contendo o perfil de intensidade da faixa marcadora com os picos detectados à esquerda e um ajuste não linear com o valor de R ao quadrado à direita.

Verifique duas vezes se o número de bandas esperadas na faixa da escada corresponde ao número de picos detectados usados no procedimento de ajuste. Depois, abra a Figura Quatro, contendo os perfis de intensidade normalizados para todas as faixas detectadas no gel. Defina o parâmetro de exportação para um para exportar os perfis de intensidade em função dos pesos moleculares em um arquivo Excel.

Execute o roteiro. Após a conclusão, uma planilha Excel será gerada na pasta de trabalho contendo os perfis absoluto e normalizado como funções do peso molecular na primeira coluna. Depois, abra o gel profiles pro m e execute o script.

Quatro janelas aparecem na tela. Abra a Figura Cinco contendo os perfis de intensidade absoluta no topo e as intensidades totais correspondentes na parte inferior para cada pista. E a Figura Seis contendo os perfis de intensidade normalizados para cada faixa.

Com o eixo do peso molecular subdividido de acordo com os intervalos especificados como reg no roteiro. Defina os dados de exportação para um para exportar as áreas integrais absolutas e normalizadas. Execute o roteiro.

Após a conclusão, uma planilha será gerada na pasta de trabalho contendo as áreas absolutas e normalizadas exportadas dentro das faixas de peso molecular especificadas. Por fim, abra as Figuras Sete e Oito. Eles contêm o histograma das áreas absoluta e normalizada para cada faixa, agrupadas por faixa e por área, respectivamente.

O protocolo apresentado aqui estabelece um fluxo de trabalho padronizado e reprodutível para isolar e caracterizar a coroa proteica formada em nanopartículas após incubação com plasma. Esse método gera perfis de página SDS altamente consistentes, capazes de capturar características biologicamente significativas e diagnosticamente relevantes de cada coroa personalizada. Os perfis de página SDS obtidos em todas as condições eram altamente reproduzíveis.

O aumento das concentrações plasmáticas de 5% para 50% resultou em intensidades de sinal mais fortes na região de 30 a 80 kilodaltons dos perfis de página do SDS. O fluxo de trabalho automatizado de pipetagem gerou perfis eletroforéticos quase idênticos. O óxido de grafeno produziu consistentemente perfis de coroa estáveis bem resolvidos, atribuídos à sua alta área superficial e propriedades carregadas.

As distribuições de tamanho das amostras pequenas, médias e grandes de óxido de grafeno eram estreitas, não sobrepostas e centradas em torno de 100, 300 e 750 nanômetros, respectivamente. Os perfis da página SDS das Coronas proteicas formadas no óxido de grafeno foram semelhantes em diferentes tamanhos. Embora diferenças distintas tenham sido observadas entre diferentes diluições, concentrações plasmáticas mais baixas produziram bandas mais intensas em faixas específicas de peso molecular, indicando enriquecimento seletivo de proteínas.

Em diluições plasmáticas intermediárias, os perfis da métrica de densidade revelaram diferenças específicas da doença, especialmente na região de 20 a 30 kilodaltons, onde amostras de PDAC apresentaram redução da intensidade do sinal. O modelo de perfilamento baseado em páginas SDS identificou corretamente tanto as amostras PDAC quanto as de controle com 83% de precisão e sensibilidade e especificidade balanceadas. O modelo diagnóstico combinado, incorporando perfis de corona SDS e CA 19 a 9 níveis, alcança a maior precisão, sensibilidade e especificidade na classificação dos pacientes com PDAC.

Utilizamos fluxos de trabalho automatizados, técnicas não baseadas em tecnologia e ferramentas baseadas em IA para avançar na pesquisa diagnóstica do câncer. Nosso protocolo é rápido, fácil de usar, compatível com a OMS, garantindo impressões digitais reprodutíveis de proteínas padronizadas com forte relevância diagnóstica.