Amyloide e a Arquitetura Cross-Beta

Nossa pesquisa utiliza difração de fibras de raios X para investigar a estrutura da fibrila amiloide cruzada beta e sua organização molecular. Esse protocolo utiliza difração de fibras de raios X para confirmar padrões cross-beta e elucidar arquiteturas de fibrilas. Esse protocolo permite a análise estrutural das fibrilas amiloides, desde a confirmação da organização cruzada beta até a elucidação de detalhes moleculares adicionais.

Para começar, alinhe as fibrilas proteicas ou peptídicas para produzir um feixe cujos eixos das fibras são idealmente todos paralelos. Derreta a cera de vela com uma placa quente até que ela liquefique. Usando um cortador de vidro, corte capilares de vidro borosilicato de 1 milímetro com cerca de 2-3 centímetros de comprimento.

Mergulhe brevemente os capilares cortados na cera líquida. Depois, puxe a cera da vela para cima por ação capilar até aproximadamente 1-2 milímetros dentro do capilar. Agora use plasticina para fixar os capilares selados horizontalmente dentro de uma placa de Petri.

Mantenha um espaço de 0,5 a 2 milímetros entre as extremidades preenchidas com cera dos capilares. Com uma pipeta, suspenda cuidadosamente uma gota de 10 microlitros de solução de fibrila entre as extremidades preenchidas com cera dos dois capilares. Cubra a placa de Petri para proteger a amostra da poeira e deixe evaporar durante a noite.

Depois, veda a placa para ajudar a manter um ambiente de secagem controlado. Para alinhar as fibrilas amiloides em um capilar de vidro, fixe uma seringa de 1 mililitro com tubo de borracha na extremidade larga de um capilar de vidro siliconado de 0,7 milímetros de diâmetro. Aspire 2-3 centímetros de suspensão de fibrilas no capilar.

Sele uma extremidade do capilar usando cera derretida e deixe a outra extremidade aberta para permitir a evaporação. Organize o capilar verticalmente e deixe secar até que um disco seco se forme. Para alinhar as fibrilas como um tapete ou filme fino, coloque uma amostra de fibrila de alta concentração em uma lâmina de vidro e cubra antes de secar ao ar por 24 horas.

Monte cuidadosamente o feixe de fibrilas em uma cabeça goniômica e oriente-o de modo que o feixe de raios X passe pelo feixe. Se estiver usando uma amostra de tapete de fibrila, oriente-a de modo que o feixe de raios X passe pela borda do tapete. Examine a amostra sob um microscópio óptico equipado com polarizador cruzado para observar birrefringência.

Posicione a amostra no feixe de raios X com base em se é um fibrado, tapete ou disco. Colete um padrão de difração usando equipamentos de raios X internos ou radiação de síncrotron. Para realizar a análise de dados, faça upload do arquivo no software de análise de padrões de difração CLEARER.

Navegue até Padrão de Difração e Configuração de Difração para inserir as configurações de difração, incluindo tamanho do pixel, fonte de raios X e distância da amostra ao detector. Clique em Processamento de Imagem e Gire para girar a imagem de difração de modo que o meridiano fique vertical. Use o módulo de centralização navegando até o Padrão de Difração e clicando em Imagem Central para centralizar a imagem.

Defina os eixos meridiano e equador. Salve a imagem centralizada para análise posterior. Em seguida, especifique um ângulo apropriado ao longo do meridiano e do equador.

Clique em Padrão de Difração e depois no módulo Média Radial para gerar um gráfico da posição do sinal de difração. versus intensidade. Navegue até o módulo Peak Find a partir do menu Padrão de Difração para medir e enviar automaticamente o sinal de difração.

Ajuste a largura máxima de busca para detectar sinais verdadeiros sem ruído. Use a opção de zoom e medir para verificar a saída da posição do sinal de difração usando o pico de encontro. Explore possíveis dimensões de células unitárias usando o módulo de Otimização de Célula Unideira.

Insira estimativas iniciais baseadas em sinais equatoriais fortes e defina os índices mínimo e máximo para busca celular. Calcule as dimensões potenciais da célula unitária e compare as posições previstas dos sinais de difração com as reflexões observadas. Selecione a célula unitária que melhor se encaixa nos dados e na amostra.

Para construir modelos moleculares, construa arranjos 3D dos peptídeos em uma configuração de folha beta que se ajuste à célula unitária determinada. Certifique-se de que todos os componentes relacionados à simetria estejam incluídos. Em seguida, clique em Simulação de Difração seguida de Estruturas e Gerador de Cadeia de Estruturas e carregue o modelo PDB.

Atribua o eixo da fibra e o eixo da viga, insira as dimensões da célula unitária e depois verifique se há conflitos estéricos. Navegue até Simulação de Difração e clique em Simulação de Difração de Fibra para enviar as coordenadas do PDB no módulo de Simulação de Difração de Fibra. Insira a direção do eixo da fibra, orientação do feixe, dimensões da célula unitária, fonte de raios X e configurações do detector, depois clique em Simular para executar a simulação.

Certifique-se de que o eixo do feixe seja perpendicular ao eixo da fibra. Depois, navegue até Arquivo e clique em Salvar Como para salvar as configurações de simulação como arquivos html para edição posterior. Salve o padrão de difração simulado em formato RAW ou como arquivo TIFF.

Compare o padrão simulado com o padrão experimental de difração. Meça sinais simulados de difração usando o mesmo fluxo de trabalho de análise. Registre e compare esses valores com dados experimentais.

Micrografias eletrônicas mostraram uma alta densidade de fibrilas amiloides na grade, adequadas para a preparação de uma amostra de fibra de raios X. Fibras alinhadas com armação estretch produziam um padrão característico de difração cross-beta com reflexão meridianal em 4,76 angstroms e reflexões equatoriais resultantes do comprimento da cadeia, espaçamento das folhas e tamanho do protofilamento. Um padrão idealizado de difração cruzada beta demonstrou que reflexões meridianas e equatoriais correspondem a espaçamentos repetitivos ao longo dos eixos das fibras.

Um padrão de difração bem centrado era simétrico, com picos equatoriais e meridiais sobrepondo-se em posição. Os picos de difração foram automaticamente detectados e listados usando análise de busca de picos. Os picos de difração detectados foram usados para identificar dimensões plausíveis de células unitárias.

Um modelo estrutural foi preparado usando a célula unitária identificada e visualizado antes da simulação de difração. Os dados simulados de difração gerados pelo modelo estrutural proposto mostraram concordância razoável com o padrão experimental de difração tanto nas posições de reflexão quanto nas intensidades relativas. A sobreposição de padrões de difração simulados e experimentais demonstrou ainda mais o alinhamento das reflexões correspondentes.

O alinhamento correto da amostra é fundamental porque determina a qualidade dos dados de difração e as informações obtidas deles. Esse trabalho possibilita modelagem estrutural de resolução atômica e integração com outras técnicas estruturais, como a AFM, para possibilitar estruturas moleculares detalhadas.