In vitro Reconstituição da Ubiquitinação Bacteriana e Eliminação Mediada por VCP/p97

Nosso trabalho revela como o VCP ou p97 atua como um defensor citosólico contra múltiplos patógenos diferentes. Isso desbloqueia o potencial do VCP ou p97 para aplicações terapêuticas e estratégias de bioengenharia. Além da bioquímica rotineira, microscopia de super resolução, crio-EM, crio-ET são utilizados para descobrir como esses efetores do hospedeiro se organizam sobre o patógeno para destruí-los.

Para começar, cultive a pneumonia de estreptococo em seis cepas do sorotipo dois durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono no meio levedurado Todd Hewitt. Inocule uma parte da cultura durante a noite em 10 partes do meio fresco de levedura Todd Hewitt e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja 0,4. Depois, misture 900 microlitros da cultura de pneumonia estreptococo com 600 microlitros de glicerol a 50% e armazene o estoque de glicerol a menos 80 graus Celsius.

Depois, descongele um novo estoque de pneumonia por streptococcus de menos 80 graus Celsius e inocule completamente em cinco mililitros de meio de levedura Todd Hewitt. Absorva aproximadamente 10 células de pneumonia de estreptococo. Para lavar bem as células, ressuspenda as bactérias no tampão de reação e centrifuge a 21.000 G por cinco minutos em temperatura ambiente.

Ressuspenda a pelota com um lisado de células de mamífero de 549. Depois, adicione ubiquitina purificada e um trifosfato de adenosina milimolar e incube a mistura por uma a duas horas a 27 graus Celsius. Depois, lave as bactérias uma vez com um tampão de reação contendo uma ureia molar, seguido de duas lavagens adicionais apenas com o tampão de reação.

Fixe as bactérias com 1% de paraformaldeído. Após a fixação, incube as células com PBS, contendo um miligrama por mililitro de glicina, por 15 minutos. Depois lave duas vezes com PBS.

Prepare uma mistura de reação combinando ubiquitina com outros componentes necessários no tampão de reação. Ajuste o volume total da mistura de reação para 100 a 150 microlitros. Resuspenda as bactérias na mistura de reação contendo a ubiquitina e incube a suspensão por duas horas a 27 graus Celsius.

Após lavar as bactérias três vezes com tampão de reação, contendo ureia, fixe-as com 1% de paraformaldeído. Após a fixação, incube as células com PBS, contendo um miligrama por mililitro de glicina, por 15 minutos. Depois, incube a amostra em 3% BSA por uma hora a 27 graus Celsius e lave a amostra duas vezes com PBS.

Ressuspenda as bactérias ubiquitinadas em uma solução primária de anticorpos, preparada em concentrações mais altas do que as normalmente usadas em ensaios de imunofluorescência. Depois, incube por uma hora a 27 graus Celsius. Após lavar as bactérias duas vezes com PBS, ressuspenda-as no anticorpo secundário correspondente conjugado com Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 555.

Agora, faça drop cast de aproximadamente 10 a 20 microlitros da amostra bacteriana rotulada em uma lâmina de vidro e misture de cinco a dez microlitros de meio de montagem com ou sem DAPI. Coloque uma capa sobre a amostra e use papel de seda para remover o excesso de líquido. Combine seis micromolares VCP p97 com um micromolar NPLOC4 e um micromolar UFD-1.

Ajuste o volume da mistura de reação para aproximadamente 90 microlitros, usando tampão de reação, e incube no gelo por duas horas. Em seguida, adicione de um a dois milimolares de adenosina trifosfato à mistura de reação contendo p97 UFD-1, NPLOC4. Depois, combine isso com 10 à potência de sete células ubiquitinadas de pneumonia de estreptococo, e incube por duas horas a 37 graus Celsius.

Imediatamente após o tratamento, retire uma alíquota de 10 microlitros da mistura de reação e realize uma diluição em série. Coloque de 10 a 20 microlitros de cada diluição nas placas de infusão cerebral cardíaca. Avalie as unidades de formação de colônias entre os pontos de hora zero e duas horas.

Calcule a porcentagem de viabilidade bacteriana dividindo a contagem de UFC de duas horas pela contagem de UFC de uma hora zero e multiplicando por 100. Ubiquitinação significativa de streptococcus pneumoniae foi observada quando tratada com lisado celular de mamífero ou com um sistema enzimático E-1, E-2, E-3 reconstituído. O sinal de ubiquitinação estava ausente no controle e diminuiu significativamente quando o estreptococo ubiquitinado pneumoniae foi exposto ao OTUB1, confirmando a modificação de poliubiquitina ligada ao K48.

Uma análise do perfil linear mostrou sobreposição total entre ubiquitina e sinais bacterianos, confirmando sua co-localização espacial. A reconstrução tridimensional confirmou a sobreposição espacial dos sinais de ubiquitina e streptococcus pneumoniae. O tipo selvagem p97, quando combinado com seus co-fatores, UFD1 e NPLOC4, reduziu a viabilidade bacteriana para 10 a 20% após duas horas, independentemente de a ubiquitinação ter sido realizada com lisado celular ou com sistema enzimático purificado.

Nenhuma redução na viabilidade bacteriana foi observada quando a ubiquitinação foi omitida, quando o p97 foi inativado por calor ou ao usar o mutante catalíticamente inativo p97, E57 8Q, confirmando que tanto a ubiquitinação quanto o p97 ativo são essenciais para a morte bacteriana. Nosso estudo abre a porta para como as ligases de ubiquitina E3 do hospedeiro modificam diferentes patógenos e investigam os mecanismos efetores para eliminar as ameaças infecciosas. Em seguida, nosso objetivo é explorar como o p97 ou VCP é regulado e ainda desenvolvê-lo para aumentar sua atividade antibacteriana.