Procedimento de Amostragem Baseada em Fio Vermelho de Fenol para Lipidômicos de Fluido Lagrimal Não Alvo na Descoberta de Biomarcadores

Estabelecemos um método mais padronizado e fácil de operar, baseado em fio vermelho de fenol, para ajudar a alcançar perfis lipidômicos de lágrimas reproduzíveis para futuras descobertas de biomarcadores de lágrima. O desafio atual é que tiras de Schirmer irritam, enquanto capilares apresentam variáveis de operadores na coleta de lágrimas. Isso dificulta a reportabilidade experimental e as comparações entre estudos.

Para começar, use luvas e desinfete cuidadosamente a estação de trabalho para evitar qualquer contaminação da amostra. Segure a linha vermelha fenólica pela ponta oposta ao gancho dobrado, tomando cuidado para não tocar na região do gancho dobrado. Peça ao sujeito que direcione o olhar para a direção nasal superior.

Em seguida, puxe suavemente a pálpebra inferior do sujeito para baixo e insira o fio vermelho fenol com o gancho dobrado colocado na conjuntiva palpebral temporal inferior, próximo ao canto externo do olho. Agora, peça ao sujeito para fechar os olhos suavemente e inclinar levemente a cabeça para frente para evitar que o fio vermelho fenólico toque a pele do rosto. Puxe novamente a pálpebra inferior do sujeito para baixo e remova suavemente o fio vermelho fenol, evitando contato com a região amostrada.

Registre o comprimento da região vermelha amostrada. E usando pinças estéreis, transfira a PRT para um novo tubo de amostra. Agora rotule e tampone o tubo da amostra corretamente.

Se o comprimento amostrado for inferior a 50 milímetros, peça ao sujeito para descansar de um a três minutos e depois repita a coleta do fluido lacrimal usando o mesmo olho. Coloque cada PRT recém-amostrado em um tubo de amostra separado. Usando metanol e lenços de papel limpos, limpe bem as luvas e pinças para eliminar resíduos de lágrimas ou contaminantes.

Depois, deixe-os secarem completamente ao ar. Vede todos os tubos da amostra com parafilme e armazene-os imediatamente a menos 20 graus Celsius para armazenamento temporário ou menos 80 graus Celsius para armazenamento a longo prazo. Pré-lave as microtesouras e as pinças com metanol antes de processar os fios vermelhos de fenol.

Corte a ponta curvada do gancho aproximadamente os primeiros três milímetros de cada fio vermelho fenol. Corte a região amostrada até a frente do corante vermelho fenólico em pedaços de dois milímetros e colete esses segmentos com um tubo de microcentrífuga orgânico limpo de 1,5 mililitro tolerante a solvente. Descarte a extremidade do gancho dobrada e a região indesejada do PRT.

Coloque as amostras sobre gelo para manter uma temperatura baixa antes da extração. Agora, adicione 232 microlitros de metanol grau espectrometria de massa gelado a cada amostra e faça vórtice por 15 segundos para misturar completamente. Sonice as amostras em um limpador ultrassônico pré-resfriado por 15 minutos.

Depois, adicione 774 microlitros de metil-tert-butil grau HPLC e 194 microlitros de água deionizada a cada amostra. Faça vórtice novamente por 15 segundos para misturar bem os solventes. Sonice as amostras novamente em um limpador ultrassônico pré-resfriado por mais 15 minutos.

Após a sonicação, incube as amostras em um ThermoMixer ajustado a quatro graus Celsius com agitação a 1.200 rotações por minuto durante oito horas. Depois, deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 10 minutos. Centrifuge as misturas a 10.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, certifique-se de que as misturas estejam visivelmente separadas em duas fases líquidas distintas. Colete cuidadosamente 700 microlitros da fase orgânica superior contendo lipídios e transfira-os para um novo tubo microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mililitro de 1,5 mililitros. Descarte a fase aquosa inferior, que contém éter metil-tert-butil residual e metanol como resíduos químicos perigosos.

Seque os extratos lipídicos usando um concentrador refrigerado SpeedVac ajustado a quatro graus Celsius por quatro horas. Depois, armazene os extratos lipídicos secos a menos 20 graus Celsius para armazenamento de curto prazo ou menos 80 graus Celsius para armazenamento a longo prazo. Prepare a mistura de metanol-clorofórmio misturando metanol com clorofórmio em uma proporção de volume um-para-um.

Reconstitua os extratos lipídicos secos usando 50 microlitros da mistura de solvente metanol-clorofórmio gelada. Sonice a solução reconstituída em um limpador ultrassônico pré-resfriado por 15 minutos. Agora, centrifuge os extratos lipídicos reconstituídos a 14.000 G e quatro graus Celsius por 10 minutos.

Transfira cuidadosamente 40 microlitros do sobrenadante resultante para um frasco de vidro autoamostrador equipado com um inserto de vidro. Tampe firmemente o frasco com uma tampa aberta do septo sem fenda para prepará-lo para cromatografia líquida e análise de espectrometria de massa em tandem. Usando critérios rigorosos, 773, 890 e 1.025 espécies lipídicas únicas foram identificadas nos grupos de amostras replicar um, replicar dois e replicar três, respectivamente.

O modo iônico positivo identificou 1.302 espécies lipídicas com 26% de grau A, 13,2% de grau B e 60,8% de grau C. O modo de íons negativos identificou 257 espécies lipídicas com cerca de 8,2% de grau A, 22,9% de grau B e 68,9% de grau C. Apesar das variações relacionadas ao armazenamento, 394 espécies lipídicas únicas foram consistentemente identificadas em todos os três conjuntos de amostras.

O coeficiente de variação entre sujeitos em três consultas foi de 21,5% no modo positivo e 31,3% no modo negativo. Esse protocolo aborda a ausência de um fluxo de trabalho padronizado para análise lipidômica de lágrimas reprodutíveis e pode aprimorar a comparabilidade entre estudos. Nosso método baseado em PRT minimiza irritações, permite a rápida coleta de lágrimas e reduz a variabilidade do operador.

Nossas pesquisas futuras validarão biomarcadores lipidômicos de rasgo em grandes coortes e integrarão multiômicas para diagnósticos personalizados.