Name: Imagem de células vivas da permeabilização da membrana lisossômica durante a necroptose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Aprenda a monitorar a permeabilização da membrana lisossômica durante a necroptose usando imagem de células vivas com LysoTracker e contas de dextran. Este método permite observar em tempo real as alterações de pH e a liberação de carga.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Células HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Células do Câncer de Cólon</td></tr><tr><td>Prato de fundo de vidro de 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C-GRD</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVL</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Leica</td><td>SP8WLL</td><td></td></tr><tr><td>Contas verdes Dextrano</td><td>ThermoFisher</td><td>D1820</td><td>Dextran, Fluoresceína, 10.000 MW, Aniônica, Lisina Fixável</td></tr><tr><td>Eagle Médio Modificado (DMEM) de Dulbecco</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal (FBS)</td><td>Cytiva & nbsp;</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Vermelho DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Tipo de imersão em óleo HF</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica</td><td>16915-01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina e estreptomicina (P/S)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Soro Tamponado com Fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Smac mimético (S)</td><td>BV6, ApexBio, Catálogo</td><td>B4653</td><td>Concentração final, 1 mM</td></tr><tr><td>O Tijolo&nbsp;</td><td>Serviços de imagem de vida</td><td>13685</td><td>Controlador de CO2 do Misturador de Gás</td></tr><tr><td>O Cubo</td><td>Serviços de imagem de vida</td><td>CBO2A</td><td>Microscópios de câmara de controle de temperatura</td></tr><tr><td>Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-&alfa; - T)</td><td>Peprotech</td><td>30001A100UG</td><td>Concentração final, 20 ng/ml</td></tr><tr><td>z-VAD-FMK (Z)</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>Concentração final, 20 mM</td></tr></tbody></table>

imagem de células vivas da permeabilização da membrana lisossômica durante a necroptose

Live-cell Imaging of Lysosomal Membrane Permeabilization During Necroptosis

Os procedimentos descritos neste protocolo permitem a aquisição de imagens de células vivas por meio de microscopia confocal para monitorar a DUM em tempo real. A Figura 1 ilustra uma representação esquemática do protocolo experimental, desde o plaqueamento celular até a aquisição da imagem. No Dia 0, 5.000 células HT-29 foram plaqueadas e incubadas por 24 h a 37 °C e 5% de CO2. Após 24 h (Dia 1), as células foram incubadas com esferas de dextrano marcadas com fluoresceína (25 μg/mL) por mais 24 h nas mesmas condições. Essas esferas são internalizadas por endocitose e tráfego para os lisossomos, onde se acumulam e aparecem como pontos brilhantes. No Dia 2 (Dia do Experimento), as células foram tratadas com corante LysoTracker sensível ao pH (1 μM) por 2 h a 37 ° C e 5% de CO2. O LysoTracker concentra e exibe forte fluorescência dentro de compartimentos ácidos, como endossomos tardios e lisossomos. Trinta minutos antes da imagem, o sistema de microscópio confocal foi ligado e estabilizado, incluindo controladores de temperatura, gás e umidade, conforme descrito na etapa 4 do protocolo. A câmara de imagem foi montada, conforme demonstrado na Figura 2. Foram utilizados os lasers de 488 nm (verde) e 555 nm (vermelho).
Após a incubação com LysoTracker, as células foram cuidadosamente lavadas três vezes com PBS, e 2 mL de DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 1% de P/S foram adicionados. A placa foi transferida para o microscópio e uma gota de óleo de imersão foi aplicada na objetiva de imersão em óleo 63x/1,40 NA. A intensidade do laser e os níveis de fundo foram então ajustados para otimizar as condições de imagem, conforme descrito na etapa 5.5. do protocolo. Nossas imagens iniciais confirmaram a presença de pontos estáveis do Lysotracker e dextrana marcada com fluoresceína, indicando lisossomos intactos (Figura 3). As imagens basais foram adquiridas antes de T/S/Z e utilizadas como controle. Nenhum veículo foi aplicado.
Após estabelecer as configurações iniciais de imagem e microscopia, a placa foi devolvida à capela de fluxo laminar e 1 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de P/S, contendo 100 ng/mL de TNF-α (T), 500 nM de SMAC mimético (S) e 100 μM Z-VAD-FMK (Z) foi adicionado. A imagem continuou no microscópio confocal usando o parâmetro de aquisição de imagem descrito na etapa 6 do protocolo. Conforme mostrado na Figura 3, Filme suplementar S1 e Filme suplementar S2, a diminuição progressiva na fluorescência do LysoTracker em células tratadas com T / S / Z serviu como um indicador precoce de alteração lisossômica. Essa perda foi seguida e ocasionalmente ocorreu simultaneamente com o efluxo de dextrano marcado com fluoresceína dos lisossomos para o citosol (mudança puntiforme para difusa), indicando LMP. Às 8 h, quase todo o sinal do Lysotracker desapareceu, no entanto, muitas células ainda retinham pontos verdes com sinal verde citosólico, sugerindo que a perda do gradiente de pH lisossômico precede a LMP completa e a liberação de carga.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1: Representação esquemática do protocolo experimental. (Criado em BioRender.com) Inicialmente, 5.000 células foram plaqueadas (0 h) e incubadas por 24 h; em seguida, grânulos de dextrano (25 μg/mL) foram adicionados e incubados por mais 24 h. Às 48 h, o LysoTracker (1 μM) foi adicionado e incubado por 2 h. As células foram lavadas três vezes com PBS (etapa 1), seguida da adição de 2 mL de DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 1% de P/S (etapa 2). As configurações de microscopia foram ajustadas (etapa 3) e as células foram tratadas com TNF-α (T), mimético de SMAC (S) e inibidor de pan-caspase Z-VAD-FMZ (Z) (etapa 4), antes da aquisição da imagem de células vivas (etapa 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Diagrama da configuração da câmara de imagem. (A) O suporte da amostra, (B) a câmara de incubação de gás e (C) a tampa superior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig3.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3: Imagens representativas de células HT29 antes e depois do tratamento T / S / Z. As células foram coradas com grânulos vermelhos de Lysotracker e verdes de Dextran e tratadas com TNF-α (T), mimético de SMAC (S) e inibidor de pan-caspase Z-VAD-FMZ (Z). Barra de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
Filme suplementar S1: Lapso de tempo de células HT29 incubadas com grânulos verdes de dextrano e tratadas com T / S / Z. As células foram monitoradas por mais de 6 h para avaliar a resposta celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S1_Dextran%20Green%20Beads.mp4" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este filme.</a>
Filme suplementar S2: Lapso de tempo de células HT29 incubadas com LysoTracker vermelho e tratadas com T / S / Z. As células foram monitoradas por mais de 6 h para avaliar a resposta celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S2_LysoTracker%20red.mp4" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este filme.</a>

Imagem de células vivas da permeabilização da membrana lisossômica durante a necroptose

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Microscopia Eletrônica e de Luz Correlativa de Duas Cores para a Visualização de Interações entre Mitocôndrias e Lisossomos

Aprenda a monitorar a permeabilização da membrana lisossômica durante a necroptose usando imagem de células vivas com LysoTracker e contas de dextran. Este método permite observar em tempo real as alterações de pH e a liberação de carga.

Imagem de células vivas da permeabilização da membrana lisossômica durante a necroptose

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