Name: Abordagens experimentais para análise bioquímica da proteína ácida fibrilar glial e suas variantes associadas a doenças (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Aprenda métodos experimentais para caracterização bioquímica da proteína GFAP e suas mutações associadas à doença de Alexander. Este protocolo padronizado facilita o estudo da montagem de filamentos e agregação proteica.

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<table><tbody><tr><td>Solução 30% de Acrilamida/Bis 37,5:1</td><td>Biorad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de Amônio (APS)</td><td>Biorad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>USB</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFAP</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>12389</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ubiquitina</td><td>Millipore</td><td>ST 1200</td><td>Clone FK2</td></tr><tr><td>Centrífuga Avanti J-26S XP</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroanfenicol</td><td>USB</td><td>23660</td><td></td></tr><tr><td>CM-Sephrose</td><td>Cytiva</td><td>1707 1901</td><td></td></tr><tr><td>Corante azul Coomassie</td><td>USB</td><td>32826</td><td></td></tr><tr><td>Grade de cobre</td><td>Ted Pella</td><td>01753-F</td><td></td></tr><tr><td>CS 150 NX Micro ultra-centrfuga</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de dounce</td><td>Wheaton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>UR</td><td>DTT</td><td></td></tr><tr><td>Cepa pLysS de E. coli BL21(DE3)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasiGlow</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL 105001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15699</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18312</td><td></td></tr><tr><td>Coluna S do HiRes</td><td>Cytiva</td><td>2927 5877</td><td></td></tr><tr><td>Coluna Q do HiTrap</td><td>Cytiva</td><td>1711 5301</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>UR</td><td>IPTG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>LB médio (LB Agar)</td><td>USB</td><td>75851</td><td></td></tr><tr><td>Médio LB (LB Broth)</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Honeywell</td><td>31434S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cromatografia NGC</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>215740050</td><td></td></tr><tr><td>Polietileeneimina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S55S Rotor</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S80AT3 Rotor</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>USB</td><td>75819</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 520 cabras anti-camundongo IgG&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>12005867</td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 700 cabras anti-coelho IgG&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>12004161</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>USB</td><td>76320</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão H-7700)</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranila</td><td>Ciências do Microscópio Eletrônico &nbsp;</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>ureia</td><td>Honeywell</td><td>15604H</td><td></td></tr></tbody></table>

abordagens experimentais para análise bioquímica da proteína ácida fibrilar glial e suas variantes associadas a doenças

Experimental Approaches for Biochemical Analysis of Glial Fibrillary Acidic Protein and Its Disease-associated Variants

Para investigar como mutações causadoras de AxD afetam as propriedades de montagem do GFAP, produzimos proteínas recombinantes em bactérias usando um sistema de expressão baseado em PET. Detalhamos os protocolos para expressar e purificar GFAP, usando o GFAP WT como exemplo. Após a indução do IPTG (Figura 1A, pista 2), o GFAP foi purificado por meio de um processo em três etapas envolvendo preparação do corpo de inclusão (Figura 1B) e cromatografia de troca iôni...

Abordagens experimentais para análise bioquímica da proteína ácida fibrilar glial e suas variantes associadas a doenças

Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) is a key intermediate filament protein critical for maintaining the structural integrity and function of astrocytes ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Nós descrevemos uma técnica para a preparação de esclarecer humanos homogeneizados cortical, separação de proteínas por SDS-PAGE, recuperação antigênica e immunoblotting com um anticorpo para o peptídeo Aâ. Usando este protocolo, que consistentemente detectar Aâ monomérica e multimérica no tecido cortical dos seres humanos com a patologia de Alzheimer.

SDS-PAGE/Immunoblot Detecção de multímeros Aâ no tecido cortical Humanos homogeneizados utilizando antígeno Epitope-Retrieval

Um protocolo de extração de proteínas comum utilizando tampão uréia / tiouréia / SDS para tecido cerebral humano e camundongos permite indentification de proteínas por 2D-DIGE e sua posterior caracterização por mini-immunoblotting 2DE. Este método permite a obtenção de resultados mais reprodutíveis e confiáveis ​​a partir de biópsias humanos e modelos experimentais.

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Usando microscopia de força atômica em combinação com a tecnologia de biopanning, criamos um sistema de biopanning negativo e positivo para adquirir anticorpos contra variantes proteicas específicas da doença presentes em qualquer material biológico, mesmo em baixas concentrações.  Obtivemos sucesso na obtenção de anticorpos para variantes da proteína TDP-43 envolvidas na Esclerose Lateral Amiotrófica.

Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

Um ELISA que oferece uma nova abordagem quantitativa é descrito. Ele detecta especificamente a α-sinucleína associada à doença (αSD) em um modelo de camundongo transgênico (M83) de sinucleinopatia usando vários anticorpos contra a forma fosforilada de αS na Ser129 ou a parte C-terminal da proteína.

Detecção de doença associada α-sinucleína por ELISA reforçada no cérebro de ratinhos transgénicos que sobre-expressam A53T Humano Mutante α-sinucleína

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de alfa-sinucleína (α-syn) cada vez mais insolúvel/agregada do tecido cerebral humano post-mortem. Através da utilização de tampões com aumento da força do detergente e técnicas de ultracentrifugação de alta velocidade, as propriedades variáveis da agregação de α-syn em tecidos doentes e não doentes podem ser examinadas.

Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos

Aqui apresentados são dois métodos que podem ser usados individualmente ou em combinação para analisar o efeito da beta-amiloide na estrutura do coágulo de fibrina. Incluído é um protocolo para criar um em vitro coágulo de fibrina, seguido pelo coágulo turbidez e microscopia eletrônica métodos.

Análise de β-amiloide-induzida de anormalidades na estrutura do coágulo de fibrina por espectroscopia e microscopia eletrônica

Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio indireto deflutuação da imunofluorescência em seções da biópsia da pele que permita a identificação de variações específicas da conformação da doença do sinucleína alfa envolvido na doença de Parkinson e nas proteínas múltiplas do sistema nervoso periférico.

Segmentação de agregados Alpha synuclein em fibras nervosas periféricas cutâneas por ensaio de imunofluorescência livre-flutuante

Este protocolo descreve um método para rastrear trajetórias individuais de envelhecimento cerebral através de um programa de doação cerebral e caracterização adequada de cérebros. Doadores cerebrais estão envolvidos em um estudo longitudinal de longo prazo, incluindo avaliações multidimensionais em série. O protocolo contém uma descrição detalhada do processamento cerebral e uma metodologia de diagnóstico precisa.

Protocolo do Banco Cerebral Abbiategrasso para coleta, processamento e caracterização de cérebros envelhecidos

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Apresentamos aqui um protocolo sobre como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglias de córtices de ratos para imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca2+ intracelular para pesquisa sobre fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica no modelo de rato hSOD1G93A .

Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

Este método de purificação bioquímica com análise proteômica baseada em espectrometria de massa facilita a caracterização robusta de núcleos fibril amiloides, o que pode acelerar a identificação de alvos para prevenir a doença de Alzheimer.

Purificação Bioquímica e Caracterização Proteômica de Núcleos de Fibril Amiloides do Cérebro

Aprenda métodos experimentais para caracterização bioquímica da proteína GFAP e suas mutações associadas à doença de Alexander. Este protocolo padronizado facilita o estudo da montagem de filamentos e agregação proteica.

Abordagens experimentais para análise bioquímica da proteína ácida fibrilar glial e suas variantes associadas a doenças

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