Purificação de Trofoblastos Extravillosos HLA-G⁺ de Tecidos Placentários Humanos para Fenotipagem e Análise Funcional

Esse protocolo foi desenvolvido para purificar trofoblastos humanos primários dos tecidos placentários humanos para estudar suas propriedades funcionais e imunológicas em gravidez saudável e sob condições patológicas. Portanto, esse protocolo fornece uma plataforma reprodutível para superar algumas limitações anteriores ao trabalhar com trofoblastos extravilos humanos primários, ou seja, sua viabilidade. Então, esse protocolo é realmente otimizado para aumentar a viabilidade e pureza deles.

Para começar, obtenha uma amostra de placenta humana. Coloque a placenta com o lado fetal voltado para cima para que o local de inserção do cordão fique visível. Descolar manualmente o amnião da membrana lateral em direção ao local de inserção do cordão umbilical e removê-lo.

Depois, use tesoura para cortar e descartar o amnion. Corte a membrana coriodecidual em tiras de dois centímetros, começando da base da placenta para cima, mantendo cada tira presa à placenta. Coloque a faixa de membrana coriodecidual sobre dois dedos, com o lado decidual voltado para cima.

Com um par de pinças curvas e estéreis na ponta, raspe suavemente a decídua parietal materna do córion. Colete a decídua parietal em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 20 mililitros de PBS para isolamento linfócito. Depois, colete a membrana coriônica em um tubo cônico separado de 50 mililitros contendo 20 mililitros de meio de lavagem A. Usando tesouras, corte a membrana coriônica dentro do tubo de 50 mililitros em pedaços menores que dois milímetros quadrados.

Descarte o meio de lavagem A do tubo. Lave o tecido repetidamente com PBS até que o sobrenadante fique transparente. Para a dissecção placentária, coloque a placenta com o lado materno voltado para cima e remova os coágulos sanguíneos.

Usando tesoura estéreis, corte pedaços da placa basal da placenta evitando áreas necróticas, calcificadas ou isquêmicas. Coloque a peça basal da decídua nos dedos com as vilosidades voltadas para cima. Depois, use tesouras para remover cuidadosamente as vilosidades e obter uma membrana de dois a três milímetros com apenas uma fina camada de vilosidade restante.

Colete o tecido da decídua basal em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 20 mililitros de PBS. Depois, corte o papel em pedaços menores que dois milímetros quadrados. Em seguida, descarte o PBS do tubo.

Lave a decídua basal repetidamente com PBS até que o sobrenadante fique limpo, sem sangue visível. Depois, dividi 15 mililitros de suspensão de tecido em dois tubos cônicos de 50 mililitros. Encha todos os tubos com PBS.

Centrifuge os tubos a 200G por um minuto e despeja o sobrenadante. Adicione 150 mililitros de coquetel de enzimas de digestão de tecidos quentes em uma garrafa de vidro de 300 mililitros. Adicione 30 mililitros de membrana coriônica ao frasco.

Adicione 20 mililitros de DMEM/F-20 morno e 80 mililitros de coquetel de enzimas de digestão de tecidos quentes em duas garrafas de vidro separadas de 300 mililitros. Depois, adicione 7,5 mililitros de decidua basalis em cada garrafa. Incube as garrafas em banho-maria.

Agite todas as garrafas a cada três a quatro minutos durante os 15 minutos de incubação. Após a digestão, filtre o tecido por peneiras metálicas com uma malha de tamanho 40. Depois, adicione o médio B para enxaguar os tecidos e dissolver o material gelatinoso.

Transfira o tecido não digerido de volta para as garrafas de vidro e repita a digestão. Depois, filtre as suspensões celulares através de um filtro de 100 micrômetros em tubos cônicos de 50 mililitros rotulados. Mantenha as células da primeira e segunda digestão separadas.

Depois, centrifuge a suspensão da célula a 650G por oito minutos. Descarte o supernadante. Combine pellets do mesmo tipo de tecido e número de digestão em um único tubo.

Depois, compense o volume com o meio de lavagem B até 25 mililitros. Adicione 12 mililitros de ficoll a quatro tubos cônicos de 50 mililitros rotulados com o tipo de tecido e o número de digestão. Cuidadosamente sobrepone a suspensão da célula sobre o ficol.

Depois, centrifuge a 800G por 20 minutos em temperatura ambiente sem quebrar. Aspire cuidadosamente a camada celular na interface do meio ficol e transfira-a para tubos limpos e rotulados. Depois, encha os tubos com o meio de lavagem B, centrifuge a 650G por oito minutos e ressuspenda os pellets.

Coloque os pellets ressuspensos em tubos de separação celular estéreis ativados por fluorescência, marcados com tipo de tecido e número de digestão. Adicione anticorpos anti-CD45 BV785, anti-HLA GAPC e anti-EGFR1 BV711. Incube por 20 minutos em temperatura ambiente, no escuro.

Após lavar e ressuspender as células no meio de lavagem B, passe-as imediatamente por um filtro de células de 40 micrômetros. Separe trofoblastos extravillosos positivos positivos em HLAG CD45 negativos em tubos contendo meio A de cultura EVT de um mililitro. A análise de citometria de fluxo dos marcadores de linhagem mostrou cultura primária viável de trofoblastos extravillosos até o quarto dia. Imagens representativas de microscopia óptica do trofoblasto extraviloso positivo em HLAG coriónico primário e da base decídua basal foram capturadas após 24 horas, 48 horas e 72 horas de cultura.

Extravillosamente trofoblastos expressaram HLAC polimórfico e moléculas coinibitórias imunossupressoras. Trofoblastos extravilosos aumentaram a expressão de HLAC, PD-L1, PD-L2 e HLA-E, mas não aumentaram a expressão de PVR e B7H3 quando co-cultivados com linfócitos ativados por 72 horas. Não foi observado aumento na morte por trofoblasto extraviloso após co-cultura com linfócitos ativados.

Esse protocolo permite que pessoas, cientistas, usem trofoblastos extravilos primários para uma grande variedade de ensaios. O benefício é a alta viabilidade que permite análises usando cultura celular, cultura a frio, citometria de fluxo, proteômica, transcriptômica, utilizando esses trofoblastos extravilosos de alto rendimento e muito viáveis. Um dos aspectos mais importantes do nosso protocolo é que você precisa usar materiais placentários frescos.

Você não pode refrigerá-los. Trofoblastos adoram morrer, então, por favor, compre os tecidos placentários o mais rápido possível após o parto, de preferência dentro de duas horas após o parto, e mantenha-os em temperatura ambiente o tempo todo. Isso é crucial para obter um trofoblasto extraviloso altamente viável.

Então, alguns dos métodos mais adicionais e inovadores que você pode usar esses trofoblastos primários são a cultura celular de longo prazo. Assim, você pode usá-los para estabelecer culturas celulares primárias de quatro dias. Assim, as células serão viáveis por até 96 horas, o que é bem tempo e permite fazer culturas a frio com células imunes, como células T e células NK.

Outra inovação também é que você pode usá-las para estabelecer linhas celulares semelhantes a trofoblastos usando os métodos descritos inicialmente por Aoki, e que também usamos para aplicar nessas culturas para realmente estabelecer tipos celulares proliferantes de longo prazo que podem ser usados para edição genômica e outros ensaios de cultura de longo prazo. Então, usando esses métodos inovadores, incluindo a cultura celular de longo prazo, acho que pode realmente ajudar a projetar culturas mecanicistas de longo prazo onde você pode aplicar edição do genoma, knock-out, genes knock-in, proteínas, sobreexpressar alguns desses trofoblastos para obter muito mais detalhes mecanicistas sobre como esses trofoblastos impõem tolerância, ou permitir imunidade e mais citotoxicidade ao interagirem com populações imunes.