O ensaio de hemostase de Nijmegen: Medição Simultânea de Geração de Trombina e Plasmina em um Único Poço

Minha pesquisa foca em medir a hemostásia secundária e a fibrinólise juntas para medir o equilíbrio hemostático geral. A maioria dos ensaios atuais avalia componentes isolados de coagulação ou fibrinólise. Esse ensaio mede ambos os processos simultaneamente em um único ensaio.

Para começar, ligue o leitor de placas de fluorescência e permita que ele se equilibre até 37 graus Celsius. Configure as configurações do filtro no software definindo o número de pares de comprimentos de onda para dois. Ajuste o comprimento de onda da excitação para 355 nanômetros para trombina e 485 nanômetros para plasmina.

Depois, ajuste o comprimento de onda de emissão para 460 nanômetros para trombina e 525 nanômetros para plasmina. Em seguida, ajuste o tipo de placa para uma microplaca preta Greiner flat bottom de 96 poços. Navegue até a Área de Leitura e defina o layout da placa usando um máximo de 20 poços por placa.

Configure as configurações de PMT e óptica definindo o ganho do PMT para 200 volts e o número de flashes por leitura para seis. Depois, navegue até Temporização para confirmar as Configurações de Tempo com um tempo total de execução de uma hora, nove minutos e 30 segundos, um intervalo de 30 segundos. Navegue até o Shake para confirmar um shake de três segundos antes da primeira leitura.

Navegue até Mais Configurações para garantir que a Ordem de Leitura esteja definida como Coluna. Configure as configurações de Transferência Composta antes da Leitura definindo o número de Transferências Compostas para um e o Volume Inicial para 120 microlitros. Verifique se a altura da pipeta é 130 microlitros, o volume é 20 microlitros, a taxa é de um microlitro por segundo e o ponto de tempo é de 14 segundos.

Em Fonte Composta, confirme o formato de Placa Composta de 96 Poços e escolha especificamente a opção Beckman 96 2,3 mililitros. Confirme as configurações de layout das ponteiras de pipeta selecionando as colunas corretas. Agora navegue até as Colunas de Dicas Compostas e selecione as colunas corretas.

Ajuste a temperatura do agitador de microplacas para 37 graus Celsius e verifique a temperatura antes de usar. Depois, ajuste a intensidade do tremor para 1.100 rotações por minuto. Em seguida, descongele o plasma do paciente e o plasma normal acumulado em banho-maria a 37 graus Celsius por até 10 minutos.

Misture as amostras de plasma cuidadosamente e verifique o descongelamento completo sem crioprecipitado visível. Usando uma pipeta, adicione 80 microlitros de plasma do paciente ou plasma normal agrupado aos poços pré-selecionados, usando uma ponta nova de pipeta para cada amostra. Depois, prepare a mistura do substrato misturando 48 microlitros de cefalina com 48 microlitros de fator tecidicular.

A isso, adicione um tampão de cloreto trissódico de 240 microlitros, depois pipete substrato de trombina de 96 microlitros e substrato de plasmina de 48 microlitros. Pipete 20 microlitros da mistura de substrato em cada poço. Aperte depois.

Agora insira a microplaca no leitor de placas de fluorescência e deixe-a se equilibrar a 37 graus Celsius por vários minutos. Combine o tampão de cloreto trissódico, o tampão de cloreto de cálcio trissódico e o ativador de plasminogênio tecidual para preparar o reagente inicial. Faça um vórtice minucioso para misturar.

Pipete a mistura inicial de reagentes em todas as linhas da coluna composta. Insira a placa contendo a mistura inicial do reagente na gaveta de fonte e inicie a medição de fluorescência. Grave sinais de fluorescência a cada 30 segundos por 70 minutos.

Mantenha a placa a 37 graus Celsius durante toda a medição. Para análise de dados, exporte os dados de fluorescência cinética como uma tabela contendo pontos de tempo e valores de fluorescência por poço. Calcule a primeira derivada e plote as curvas de geração enzimática de cada poço para visualizar a geração de trombona ou plasmina ao longo do tempo.

O ensaio de hemostasia permitiu a medição simultânea, com resolução temporal, da geração de trombina e plasmina, proporcionando uma avaliação integrada da coagulação e fibrinólise. Vários parâmetros podem ser derivados da curva de geração de trombina, incluindo tempo de atraso, altura de pico e potencial de trombona. Tempos de atraso mais longos, picos mais baixos e potenciais de trombina reduzidos indicam uma geração de trombina comprometida.

A curva de geração da plasmina também fornece múltiplos parâmetros, incluindo o tempo de lise da fibrina e a altura do pico da plasmina. Tempos de lise da fibrina mais curtos e picos mais altos refletem maior geração de plasma. Curvas de geração de trombona e plasma de três controles saudáveis e plasma normal agrupado mostraram picos reprodutíveis de altura e extremidade de altura, servindo como perfis de referência para a função hemostática normal.

Em um paciente com Fator V de 3%, a geração de trombina estava completamente ausente. No entanto, a geração de plasma aumentou marginalmente. O paciente com atividade do Fator V de 44% apresentou redução da geração de trombina com tempo de atraso prolongado e diminuição da altura máxima, enquanto a geração plasmática permaneceu dentro da faixa normal.

Na deficiência de Alfa-2-antiplasmina, a geração de plasma aumentou com a diminuição da atividade da Alfa-2-antiplasmina. O paciente homozigótico com 23% de atividade apresentou início precoce da geração de plasmina, tempo de lise de fibrina mais curto e pico plasmático mais alto. Essas alterações também foram observadas no paciente heterozigótico com 73% de atividade, embora não tão pronunciadas.

O ensaio de hemostaste é bem adequado para pesquisas sobre deficiências raras de fatores de coagulação, distúrbios fibrinolíticos e efeitos de medicamentos hemostáticos. Os principais desafios são a padronização da técnica e a normalização dos resultados para melhorar a comparabilidade entre salas e laboratórios. Trabalhos futuros podem focar na automação do ensaio e no desenvolvimento de adaptações para compatibilidade com sangue total ou plasma rico em placas.