Desenvolvimento de um Novo Modelo de Fixação Interna para Fraturas do Rádio de Rato: Avaliação da Cicatrização de Fraturas e Isolamento do Gânglio da Raiz Dorsal

Fraturas radiais são altamente prevalentes globalmente e uma das principais causas de fraturas do osso longo dos membros. O modelo de fratura radial em ratos é crucial para estudar a cicatrização de fraturas, triagem de medicamentos e avaliação de biomateriais em pesquisa ortopédica. Como o raio dos ratos é relativamente fino, as placas e parafusos de aço atualmente usados na prática clínica não são adequados para o tratamento de fraturas do rádio em ratos.

Para superar essa limitação, o protocolo combina de forma inovadora sutura e fixação por agulha de titânio, estabelecendo um modelo estável de fratura radial para pesquisa em fixação interna. No protocolo, também apresentamos o uso do sistema de micro-TC de animais vivos para esclarecer a cicatrização de fraturas em ratos. Também mostramos a extração e cultura da DRG no modelo de fratura de rato, que será usado para estudar o mecanismo de lesão e reparo nervoso em fraturas.

Os instrumentos cirúrgicos para fraturas de rato incluem lâmina de bisturi, cabo de bisturi, tesoura cirúrgica, suporte para agulha, pinças hemostáticas e pinças de tecido dentado. O rato Sprague Dawley macho, aproximadamente 8 semanas de idade e pesando cerca de 200 gramas. Anestesie o rato usando uma máquina de anestesia com gás isoflurano e mantenha anestesia ventilatória durante todo o procedimento cirúrgico.

Mantenha a temperatura da sala de cirurgia em 28°C. Coloque o rato na posição lateral. Exponha o membro dianteiro direito e raspe o pelo usando um aparador de cabelo. Coloque uma folha estéril e enrole um torniquete ao redor do membro anterior direito proximal para reduzir o sangramento cirúrgico.

Prepare a pele alternando álcool e esfoliante betadine três vezes. Faça uma incisão longitudinal de 1,5 cm no lado dorsal radial do antebraço direito. Separe os espaços musculares e exponha totalmente o raio do membro anterior direito.

Use tesouras de operação para cortar o rádio e criar uma fratura transversal. A direção da tesoura forma um ângulo de 90 graus com o raio. Pegue uma agulha de titânio de 0,8 mm de diâmetro e 10 mm de comprimento e insira-a na fratura radial ao longo de seu eixo longitudinal.

Fixe o raio e a agulha de titânio com sutura. O ponto era amarrado com três nós consecutivos, e a agulha de titânio era fixada ao raio por meio de quatro pontos interrompidos. Suture a cor da pele do excesso de sutura e feche a madeira.

Desinfete a pele com esfoliantes betadina. Cubra a ferida com gaze estéril e prenda-a com bandagens. O rato recuperou a consciência após anestesia e sua condição se recuperou bem.

Anestesie o rato usando uma máquina de anestesia com gás isoflurano. Coloque o rato em posição deitada dentro da câmara de varredura. Ajuste a posição dos membros e da cabeça para centralizar a área de varredura alvo no campo de visão e mantenha ventilação e anestesia contínuas durante todo o procedimento.

Empurre a cama fixa para dentro da câmara de escaneamento e feche a porta da câmara. Os parâmetros de varredura micro-CT foram definidos da seguinte forma: modo de varredura: padrão, tempo de exposição: dois minutos, campo de visão: 72 mm, tamanho voxel: 144 m, kilovolt: 90; micro-amperes: 88, filtro: 3D-soft. Os dados da varredura são transmitidos automaticamente para o software, e uma imagem de tomografia tridimensional é gerada.

Separe os tecidos alvo. Exporte as imagens processadas. Corte a coluna, remova os corpos vertebrais de C1 a C7.

Corte a coluna cervical ao longo das linhas médias anteriores e posteriores, divididas em metades esquerda e direita. Use pinças de tecido dentado para pegar a DRG, levante-a suavemente e depois use tesoura para cortar as fibras nervosas. Transfira DRGs extraídos para um tubo centrífugo de 1,5 mL com meio de extração.

Coloque no gelo. Aspire lentamente e descarte o meio de extração. Adicione 1 mL de solução mista digestiva e enzimática de trabalho.

Didiga em banho-maria de 37°C por 60 a 70 minutos. Pipete a quantidade adequada da solução de trabalho de fibronectina em uma placa de Petri e cubra-a em uma incubadora a 37°C por uma hora. Após a digestão, aspire e descarte a solução mista de enzimas digestivas que funcionam rapidamente.

Colete filtrado, centrifuge a 70 x g por 8,5 minutos. Após a centrifugação, aspire e descarte o sobrenadante no tubo da centrífuga. Adicione 1 mL de meio completo para ressuspender o precipitado.

Tire a placa de Petri. Descarte a solução de efeito da fibronectina e lave com PBS duas vezes. Inocule as células em uma placa de Petri, adicione 1 mL de meio completo.

Coloque-os em uma incubadora de temperatura constante a 37°C com 5% de dióxido de carbono por 8-12 horas. A micro-TC confirmou o estabelecimento bem-sucedido de modelos de ratos de fratura radial e modelo de fixação interna para fraturas radiais em ratos. 20 dias após a modelagem, a análise micro-CT de ratos SD no grupo modelo de fratura revelou prognóstico favorável.

A formação de calos foi observada fazendo a ponte entre as extremidades da fratura, com fusão progressiva e obliteração gradual da linha de fratura, o que é consistente com a fase inicial da união óssea. As imagens mostraram uma linha de fratura borrada na região modelada, sugerindo que o tecido ósseo no local da fratura já havia cicatrizado em grande parte. No 5º ao 6º dia após o isolamento com DRG, as células neuronais apresentam exposição citoplasmática extensa.

Neste estágio, todo o corpo celular neuronal e suas sinapses ao redor são claramente distinguíveis. A microscopia de imunofluorescência foi usada para fotografar células neuronais no sexto dia de cultivo. Como mostrado na Figura 9, a Beta III-tubulina foi apresentada como fluorescência verde.

Células positivas para beta-III-tubulina, incluindo corpos celulares e axônios de DRG, foram tingidas de verde, e a fluorescência azul representa os núcleos dos neurônios corados por DAPI. Ratos são um modelo clássico para estudar o mecanismo de cicatrização de fraturas devido ao seu claro histórico genético e curto ciclo reprodutivo. No entanto, o pequeno diâmetro do raio, cerca de 1-1,5 mm, torna impossível igualar o dispositivo de fixação interna de grau clínico, restringindo severamente sua utilidade na pesquisa de cicatrização nervosa-osso.

Em resposta a esse problema, este estudo propôs de forma inovadora o método combinado de sutura e agulha de titânio e fixação interna. A lógica central é substituir a fixação rígida dos parafusos pela ligadura flexível dos pontos, que pode reduzir a lesão nervosa iatrogênica e proporcionar um ambiente mecânico estável. Esse protocolo proporcionava repetibilidade e padronização para a construção do modelo.

Os pontos e agulhas de titânio são usados para fixação interna em modelos de fratura radial em ratos. A cicatrização das fraturas é avaliada por meio de microtomografia. Os neurônios primários da DRG são isolados e cultivados após exames de cicatrização de fraturas.

No protocolo, combinamos de forma inovadora suturas e agulhas de titânio para fixação interna estável no modelo de fratura radial em ratos. A cicatrização da fratura foi avaliada por micro-CT, e neurônios primários da DRG foram isolados e cultivados para investigação adicional.