Name: Melhorando as telas CRISPR-Cas9 em células CAR T: Um método refinado para preparação de bibliotecas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprenda a otimizar telas CRISPR-Cas9 em células CAR T humanas primárias usando digestão enzimática e pulldown seletivo. Este método supera barreiras na recuperação de cassettes sgRNA para identificar reguladores genéticos que modulam a função celular.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>4200 TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2991A</td><td></td></tr><tr><td>Laranja Acridina</td><td>Invitrogen</td><td>A1301</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Separador NEO autoMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-120-327</td><td>Classificador de células magnéticas de alta velocidade</td></tr><tr><td>Oligos biotinilados</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Fluorescentes K2 do Violoncêmetro</td><td>Revvity</td><td>CMT-K2-MX-150</td><td>Contador de células fluorescentes</td></tr><tr><td>Câmaras de Contagem CHT4</td><td>Revvity</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>Nanoesferas CD4 CytoSinct</td><td>GenScript</td><td>L00863-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoesferas CD8 CytoSinct</td><td>GenScript</td><td>L00864-1</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Agilent</td><td>200418-51</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>11206D</td><td></td></tr><tr><td>Ímã DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1,00,98,31,000</td><td></td></tr><tr><td>Eletroporador ExPERT ATX</td><td>MaxCyte</td><td>ExPERT ATx</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Cytiva</td><td>17544203</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2 & micro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83,18,26,001</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-Research</td><td>GenScript</td><td>Z03621-1</td><td></td></tr><tr><td>Herculase Buffer 5X</td><td>Agilent</td><td>600675-52</td><td>Buffer 5X</td></tr><tr><td>Enzima de Fusão Herculase II</td><td>Agilent</td><td>600679-51</td><td>DNA polimerase</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-765</td><td></td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-362</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler X50a</td><td>Eppendorf</td><td>6313HG006059</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de Eletroporação MaxCyte</td><td>Cytiva</td><td>EPB1</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>Biolaboratórios da Nova Inglaterra</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>Tecido Nucleospin</td><td>Macherey-Nagel</td><td>74,09,52,250</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck</td><td>TR-1003-6</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propídio iodo</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>PspXI</td><td>Biolaboratórios da Nova Inglaterra</td><td>R0656S</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Fluorômetro Qubit 3.0</td><td>Invitrogen</td><td>P33216</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de DNA Qubit HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Montagem de Processamento de Poço Estéril R-50x3</td><td>MaxCyte</td><td>LM243882</td><td></td></tr><tr><td>Células T TransAct humano</td><td>Miltenyi</td><td>130-111-160</td><td>Reagente de estimulação das células T</td></tr><tr><td>Estação de Fita HSD1000</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>TEXMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-196</td><td>Meio de crescimento de células T</td></tr><tr><td>Tris Buffer, 1,0 m, pH 8,0, Grau em Biologia Molecular</td><td>EMD Milipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>Água, para biologia molecular, livre de DNAse, RNAse e protease</td><td>ThermoScientific</td><td>327390010</td><td></td></tr></tbody></table>

melhorando as telas crispr-cas9 em células car t: um método refinado para preparação de bibliotecas

Improving CRISPR-Cas9 Screens in CAR T Cells: A Refined Method for Library Preparation

Melhorando as telas CRISPR-Cas9 em células CAR T: Um método refinado para preparação de bibliotecas

Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have demonstrated remarkable efficacy in several hematological malignancies, yet their success has not ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O vídeo descreve um processo para criar células CAR T geneticamente modificadas por meio do Sistema CRISPR-Cas9. Infectar células T com lentivírus CRISPR e CAR resulta em modificações no gene alvo e na síntese de um receptor de antígeno quimérico ou CAR, levando à formação de células T CAR geneticamente modificadas.

Células T CAR geneticamente modificadas usando um sistema CRISPR-Cas9

Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas é uma tecnologia poderosa para projetar os genomas complexos de plantas e animais. Aqui, detalhamos um protocolo eficiente editar o genoma humano usando diferentes endonucleases de Cas. Destacamos importantes considerações e parâmetros de projeto para otimizar a eficiência de edição.

Edição do genoma em linhas de células de mamíferos usando CRISPR-Cas

Aqui, apresentamos um protocolo para otimizar CRISPR-Cas9 para alcançar uma maior especificidade sem perda de atividade no alvo. Usamos uma abordagem de evolução dirigida chamada Sniper-tela para encontrar um mutante Cas9 com as características desejadas. Franco-atirador-Cas9 é compatível com truncado RNAs single-guia e entrega em um formato ribonucleoprotein, conhecidas estratégias para atingir maiores especificidades.

Usando o Sniper-Cas9 para minimizar efeitos fora do alvo de CRISPR-Cas9 sem perda de atividade no alvo através de evolução dirigida

Uma biblioteca CRISPR/sgRNA aplicou-se para interrogar os genes codificantes de proteínas. No entanto, a viabilidade de uma biblioteca de sgRNA para descobrir a função de um limite CTCF na regulação gênica permanece inexplorada. Aqui, descrevemos uma biblioteca de sgRNA específico de loci HOX para elucidar a função dos limites CTCF HOX loci.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca rastreio identificando crítico CTCF limites

A tecnologia CRISPR-Cas9 fornece um método eficiente para editar precisamente o genoma dos mamíferos em qualquer tipo de célula e representa um novo meio para realizar telas genéticas de todo o genoma. Um protocolo detalhado que discute as etapas necessárias para o desempenho bem-sucedido de telas de CRISPR-Cas9 agrupadas em todo o genoma é fornecido aqui.

Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos

Este manuscrito descreve uma abordagem de triagem baseada em células em escala de genoma para identificar interações receptor-ligantes extracelulares.

Identificação do receptor de superfície celular usando telas genéticas CRISPR/Cas9 em escala de genoma

Aqui descrevemos uma metodologia rápida e direta de triagem in vivo CRISPR/Cas9 utilizando ultrassom guiado em injeções lentiviras embrionárias uterobrionárias para avaliar simultaneamente funções de vários genes na pele e cavidade oral de camundongos imunocompetrente.

Triagem In Vivo CRISPR/Cas9 para avaliar simultaneamente a função genética na pele do rato e na cavidade oral

Aqui, apresentamos um protocolo para edição de genes em células T humanas primárias usando a tecnologia CRISPR Cas para modificar células CAR-T.

Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

O artigo descreve um protocolo para a aplicação de um modelo in vitro de exaustão para completar uma triagem de nocaute CRISPR em todo o genoma em células T receptoras de antígeno quimérico de doadores saudáveis.

Realizando uma triagem nocaute CRISPR em todo o genoma in vitro em células T receptoras de antígeno quimérico

Aprenda a otimizar telas CRISPR-Cas9 em células CAR T humanas primárias usando digestão enzimática e pulldown seletivo. Este método supera barreiras na recuperação de cassettes sgRNA para identificar reguladores genéticos que modulam a função celular.

Melhorando as telas CRISPR-Cas9 em células CAR T: Um método refinado para preparação de bibliotecas

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