Ensaio de Imunofluorescência Multiplexada para Avaliação Espacial de Marcadores de Senescência in vivo

A análise espacial das células senescentes é importante para entender sua contribuição em processos como envelhecimento, câncer, imunidade e homeostase dos tecidos normais. A detecção de células senescentes depende do perfil de múltiplos biomarcadores. A imagem imunofluorescente multiplex permite o perfil de alto débito desses dentro de uma única seção de tecido.

Para começar, verifique se as seções de tecido fixadas em formalina, embedidas em parafina ou FFPE, com 5 micrômetros de espessura, com tamanho máximo de 4 x 2 centímetros quadrados, estão montadas centralmente em lâminas de microscopia carregadas positivamente e são claramente visíveis dentro da janela de visualização do suporte sem lâmina de cobertura. Realize as etapas de preparação da amostra, seja manualmente usando uma câmara de descamuflado ou automaticamente usando um colorador automático. Coloque os slides preparados no suporte de slides sem cobertura.

Alinhe as bordas superior e direita contra os batentes metálicos. Trave o ferrolho no lugar usando as duas mãos ao mesmo tempo para girar as câmeras plásticas para a posição fechada do cadeado. Verifique se o ferrolho está completamente achatado e não balança dentro do suporte.

Coloque o ClickWell, insira a câmara sobre o ferrolho e belisque as barras laterais com as duas mãos para limitar a pressão e evitar quebras. Carregue o poço de clique com 2 mililitros de meio de montagem contendo 50% de glicerol em soro tampado com fosfato através da porta de entrada. Adicione uma etiqueta de código de barras no lado esquerdo do slide em qualquer uma das orientações, e então prossiga para a imagem.

Para seleção de regiões e análise de autofluorescência, abra o Mx Workflow versão 4204, software de aquisição de imagens multiplexadas. Clique em Ferramentas para selecionar Editor de Protocolo. No pop-up Multiplex Protocol Publisher, insira o nome do protocolo.

Clique em Criar Rodada de Preparação, seguido de adicionar Rodada Próxima de Protocolo para criar várias rodadas de rotulagem de biomarcadores. Clique em Publicar, depois selecione OK na janela pop-up. Adquira o canal Cy3 para imagens virtuais de H&E.

Clique em Slide, depois Criar um novo lote. Após selecionar o nome do protocolo, insira o ID do slide. Clique em Adicionar Slide e então selecione Criar Batch para criar um fluxo de trabalho de experimento multiplexado. Abra o software de aquisição Cell DIVE.

Clique em Carregar para carregar a lâmina no microscópio. No menu suspenso Ferramentas, clique no ícone da grade para definir as regiões desejadas e use a ferramenta Mover para reposicionar as regiões definidas. Em seguida, use a ferramenta Desenhar para desmarcar quaisquer campos que não sejam necessários, garantindo que cada campo de visão tenha pelo menos dois campos vizinhos para evitar problemas de costura, e clique em Salvar Regiões.

Na janela do Fluxo de Trabalho MX, clique em Viewer QC para abrir a página do visualizador Cell DIVE e visualizar a imagem do tecido em ampliação 10x. Clique no ícone de correção de imagem para ajustar o brilho da imagem e clique em Enviar QC para selecionar Passar e Recarregar Slide na janela pop-up. Quando a imagem recarregar, clique em Adicionar ROI para desenhar e ajustar as regiões de interesse.

Selecione os campos de visão desejados e repita a adição do ROI. Em seguida, clique em Enviar para o Laboratório. Carregue o slide para iniciar a aquisição de imagem em autofluorescência 20x.

No menu de Controle de Qualidade de Imagem, selecione a caixa correspondente ao ID específico do Slide, depois clique em Controle de Qualidade do Visualizador. Dê zoom na imagem carregada para escanear regiões desfocadas ou artefatos. Verifique as imagens de fundo de cada canal, que serão subtraídas do sinal final do biomarcador. Clique em Enviar QC, depois selecione Passar e Sair para gerar imagens de fundo.

Antes da coloração sequencial de biomarcadores, centrifuge os anticorpos a 13.000 G por um minuto em temperatura ambiente para limitar artefatos. Prepare a solução de anticorpos em diluição de 1 em 200 em soro tampão de fosfato, ou PBS, contendo 0,3% de albumina sérica bovina, ou BSA. Remova o suporte de montagem fazendo pipeting a partir da porta ClickWell.

E lave três vezes com 2 mililitros de PBS contendo 0,01% Tween 20 ou PBST por 5 minutos. Adicione 350 microlitros de solução de anticorpos na porta para garantir cobertura total da amostra dentro da câmara de coloração. Incube por uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, pipete a solução de anticorpos da porta ClickWell. E lave três vezes com 2 mililitros de PBST por 5 minutos. Adicione 2 mililitros de suporte de montagem.

Insira o suporte ClickWell no microscópio e carregue a lâmina para iniciar a imagem de biomarcador 20x. Realize o controle de qualidade de imagem usando o editor de mistura e as opções de correção de imagem e envie a avaliação de controle de qualidade da imagem. Pipete o meio de montagem da porta ClickWell e lave três vezes com 2 mililitros de PBST por 5 minutos.

Prepare a solução de inativação do corante de forma fresca antes do uso. Após remover o PBST, adicione 2 mililitros de solução de inativação de corante para cada lâmina. Incube por 15 minutos no suporte do lâmina.

Pipete a solução de inativação do corante do porto ClickWell e lave com 2 mililitros de PBST por 5 minutos. Adicione 2 mililitros de meio de montagem e insira o suporte ClickWell no microscópio para iniciar a imagem autofluorescente 20x específica para rodadas. Avance no fluxo de trabalho passando os passos de controle de qualidade conforme indicado na tela após a conclusão.

Repita a coloração sequencial, inativação do corante e imagens multiplexadas pelo número de marcadores necessários, e continue até a conclusão. Use o software HALO para selecionar vários canais para visualizar a localização de marcadores em diferentes regiões do núcleo tecido. Clique em Analisar e selecione Imagem Inteira para analisar as métricas quantitativas de marcadores individuais.

Clique em Resultados para ver o número total de células no núcleo de tecido analisado e o subconjunto de células que expressam marcadores específicos. Comparado ao método automatizado baseado em stainer de slides, o método manual baseado em câmara de descamuflado resultou em uma frequência maior de artefatos de tecido caracterizados especificamente por descolamento de tecido, bem como por ausências perdidas ou deslizadas. A quantificação realizada com software de patologia digital em tecido pancreasiano representativo revelou que células p16 positivas estavam associadas a níveis mais baixos de LB1 e vice-versa, demonstrando um perfil consistente com padrões de marcadores associados à senescência.

Um mapa térmico normalizado com Z-score ilustra a distribuição do fenótipo de senescência p16 negativo lamin-B1 positivo em vários tecidos, revelando altas concentrações de células senescentes no pulmão, glândulas supra-renais e hipófises, correspondendo a níveis elevados de p16 e diminuição de LB1. Por outro lado, o apêndice, o linfonodo e o baço apresentaram baixa senescência, mantendo alta expressão de LB1 e baixa de p16. Esse protocolo permite a sondagem de uma combinação de biomarcadores de senescência, estruturais e imunológicos dentro de uma única lâmina de microscopia.

Ao combinar múltiplos marcadores em uma única amostra, é possível realizar uma análise espacial da arquitetura dos tecidos e da distribuição celular senescente. Aplicações futuras incluem o perfilamento em larga escala de biomarcadores de senescência em múltiplos tipos de tecidos e a integração com cômicos espaciais para melhor resolver a heterogeneidade celular.