Isolamento de Perícitos de Tecido Cortical de Camundongos Usando FACS para Sequenciamento de Células Únicas
30 de janeiro de 2026
Para obter perícitos corticais cerebrais de camundongo que atendam às demandas do scRNA-seq, apresentamos um protocolo FACS criticamente otimizado baseado na seleção CD13⁺/CD31⁻. Nossos principais aprimoramentos melhoram significativamente a viabilidade celular e a integridade do RNA, permitindo um perfil transcriptômico confiável.
Nossa pesquisa examina parasitas cerebrais focando em seus papéis vasculares e suas interações dentro da unidade neurovascular para entender a função cerebral. Baixa imagem e o FACS espacial em um processo intestinal de mapeamento ou função parasitária dentro da vasculatura cerebral revelam os papéis específicos da localização e os alvos terapêuticos. Para começar, borrife a região da cabeça e pescoço de um camundongo eutanasiado com 75% de etanol.
Usando um bisturi, faça uma incisão no couro cabeludo da região occipital até a frontal para expor o crânio. Realize uma incisão transversal anterior às órbitas bilaterais, seguida de incisões laterais ao longo das margens inferiores do cerebelo para descolar a base do crânio. Incire o calvário longitudinalmente ao longo da sutura sagital, de posterior para anterior.
Levante o retalho craniano junto com um duramater para expor o cérebro. Usando tesoura cirúrgica, eleve suavemente o cérebro enquanto corta os nervos ópticos e a conexão da medula oblonga da medula espinhal. Coloque o cérebro intacto delicadamente em um prato de 10 centímetros contendo 10 mililitros de PBS gelado, evitando qualquer dano.
Transfira o cérebro para papel alumínio. Expõe o espaço subaracnoideo. Depois de remover a dura-máter com pinça, enxágue com a solução salina equilibrada do Hank.
Transfira o papel de seda para papel filtrante e remova o piater enrolando. Com uma lâmina de barbear, corte e descarte o bulbo olfativo e as seções mais caudais, e corte o cérebro coronalmente em fatias de dois a três milímetros de espessura. Isole o córtex cerebral ao longo do corpo caloso.
Transfira o tecido cortical para ampolas contendo três mililitros de tampão de coleta de tecido gelado. Usando bisturi cirúrgicos, triture o tecido e as ampolas em fragmentos de aproximadamente um milímetro por milímetro e conclua a moção em cinco minutos para preservar a frescura do tecido. Antes de enxaguar as pontas da pipeta com um tampão de coleta de tecido.
Depois, aspire lentamente os fragmentos picados em direção ao ápice da ponta enquanto segura a pipeta na vertical. Expulse suavemente os fragmentos em tubos centrífugos pré-resfriados de 15 mililitros. Lave as ampolas originais com 2% de FBS em soro fisiológico PBS.
Transfira a lavagem para os mesmos tubos da centrífuga e centrifuge a 300G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante após a centrifugação. Resuspenda cada pellet em três mililitros de solução de trabalho enzimática CD.
Aliquota a suspensão igualmente em três tubos e adicione uma solução enzimática adicional para atingir um volume final de cinco mililitros por tubo. Incube os tubos em um forno de hibridização a 37 graus Celsius por 100 minutos com agitação orbital a 100G. Durante a incubação, adicione um mililitro de dnase e uma solução a 10 mililitros de 2%FBS em PBS.
Termine a digestão centrifugando a 300G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Depois, re-suspenda cada pellet em um mililitro de solução de dissociação tecidual. Pipete a solução 100 vezes para ajudar na dissociação mecânica.
Em seguida, agrupe todas as suspensões em um único tubo centrífugo de 50 mililitros. Enxágue cada tubo com dois mililitros de tampão e combine as lavagens. Após centrifugação a 300G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartando a camada superior, adicione 12,5 mililitros de 20% de BSA e inverta para misturar.
Centrifuge a 1000 G a quatro graus Celsius por 20 minutos. Agora colete o pellet inferior e transfira o sobrenadante para um novo tubo centrífugo de 50 mililitros. Resuspenda suavemente antes de centrifugar novamente.
Resuspenda cada pellet em dois mililitros de 2% de FBS em PBS. Depois, combine as duas suspensões em um único tubo. Centrifuge a suspensão combinada a 300G a quatro graus Celsius por cinco minutos.
Após descartar o sobrenadante, re-suspenda o último pellet em dois mililitros de PBS com 2% de FBS. Prepare quatro tubos centrífugos de 15 mililitros contendo quatro mililitros de solução 22% por chamada. Coloque suavemente alíquotas de 0,5 mililitro da suspensão da célula sobre cada gradiente e centrifuge a 560G por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Após aspirar o sobrenadante, re-suspenda cada pellet em um mililitro de buffer de glicose HBSS BSA. Depois, puxe as suspensões para um novo tubo de 15 mililitros. Enxágue os tubos de percol com dois mililitros de tampão e combine as lavagens antes da centrifugação a 300G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Para citometria de fluxo, ressuspenda o pellet em um mililitro de buffer de glicose HBSS BSA após aspirar o supernadante. Adicione cinco microlitros de reagente bloqueador do receptor FC e incube a quatro graus Celsius por cinco minutos. Depois, pipetei anticorpos conjugados fluorescentes à suspensão antes da incubação.
Lave as células com seis mililitros de tampão de glicose HBSS BSA. Depois, centrifuge a suspensão a 300G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Após aspirar o sobrenadante, re-suspenda o pellet em um mililitro de tampão.
Adicione 200 microlitros de solução de sete aminoaminoacinas Actinomicinas D e incube no gelo por 10 minutos. Depois, ajuste o volume final para dois mililitros com buffer HBSS suplementado com BSA e glicose. Enxágue a superfície interna dos tubos de coleta de triagem com solução 1%BSA.
Aspire o excesso de solução, deixando exatamente um mililitro de solução em cada tubo. Armazene os tubos no gelo para receber as células separadas. Células dissociadas do tecido cerebral foram sequencialmente direcionadas pela área de dispersão frontal e lateral para excluir detritos celulares durante a separação por citometria de fluxo.
Eventos positivos duplos positivos para CD45 e positivo para CD41 foram excluídos para remover células hematopoéticas e contaminantes plaquetários. Células da parede vascular CD13 positivas foram enriquecidas. E células apoptóticas foram excluídas usando sete amino actinomicina D negativa, seguida por seleção CD31 negativa para isolar parasitas.
A classificação por citometria de fluxo mostrou que as células nucleadas representaram 59,8% de todos os eventos. Células CD13 positivas representaram 1% de todos os eventos. E a população final de parasitas positivo CD13 positivo CD31 representou 0,7% de todos os eventos.
A redução de dimensionalidade das células classificadas pela UMAP revelou seis grandes agrupamentos distintos indicando heterogeneidade celular dentro da população isolada. A análise de mapa de calor normalizada pelo Z-score demonstrou que os genes marcadores parasitas foram altamente e predominantemente expressos em clusters zero a três. A análise de proporções de agrupamentos mostrou que os agrupamentos zero a três constituíam 87,1% da população total.
Enquanto marcadores de células musculares lisas foram enriquecidos no grupo quatro com 10,14% e marcadores de fibroblastos foram enriquecidos no grupo cinco com 2,77%. Este protocolo permite aos pesquisadores isolar parasitas vestíveis de alta pureza adequados para sequenciamento celular único a jusante e análise funcional. O principal desafio é a ausência de marcadores parasitários altamente específicos, o isolamento complicado e o aumento do risco de contaminação secular. Estudos futuros podem focar na identificação de marcadores específicos do parasita, possibilitando uma melhoria do isolamento, caracterização funcional mais profunda e investigações terapêuticas direcionadas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo otimizado e reprodutível para o isolamento de pericitos cerebrais de camundongo, adequado para sequenciamento de RNA em nível de única célula (scRNA-seq). Ao refinar a estratégia de separação estabelecida baseada em CD13+/CD31- e introduzir melhorias fundamentais, o método permite o isolamento robusto de pericitos viáveis, facilitando o estudo de sua heterogeneidade e papéis em doenças neurovasculares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia Vascular
Antecedentes
- Os pericitos são essenciais para manter a integridade da barreira hematoencefálica.
- Eles regulam a homeostase hemodinâmica cerebral mediante a modulação do tônus microvascular.
- A disfunção dos pericitos está associada a diversas doenças neurológicas.
- Compreender a heterogeneidade dos pericitos é fundamental para elucidar seus papéis nas doenças neurovasculares.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo otimizado para o isolamento de pericitos cerebrais de camundongo adequado para sequenciamento de RNA em única célula (scRNA-seq).
- Permitir uma análise de alta qualidade da heterogeneidade dos pericitos em nível de única célula.
- Fornecer uma ferramenta para investigar os mecanismos dos pericitos em doenças neurovasculares.
Métodos Utilizados
- Coleta de cérebros de camundongos adultos C57BL/6.
- Dissociação mecânica e digestão enzimática do tecido cerebral para obter suspensões de células isoladas.
- Passos sequenciais de centrifugação.
- Re-suspendimento do pellet celular final em albumina sérica bovina (BSA) a 20% para minimizar estresse e agregação.
- Classificação celular ativada por fluorescência (FACS) utilizando a estratégia CD13+/CD31-.
Resultados Principais
- O protocolo produz pericitos cerebrais viáveis de camundongo adequados para sequenciamento de RNA em célula única (scRNA-seq).
- O uso de BSA a 20% melhora a viabilidade celular e a qualidade do RNA.
- O método é reprodutível e robusto para o isolamento de pericitos.
- Permite o estudo detalhado da heterogeneidade dos pericitos em resolução de única célula.
Conclusões
- Este protocolo otimizado facilita o isolamento de alta qualidade de pericitos cerebrais de camundongo para sequenciamento de RNA em nível de célula única (scRNA-seq).
- Oferece uma ferramenta valiosa para dissecar a diversidade dos pericitos e seus papéis patológicos em doenças neurovasculares.
- A abordagem pode impulsionar a pesquisa sobre mecanismos relacionados aos pericitos em distúrbios neurológicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Isolamento robusto de pericitos viáveis a partir de tecido cortical de camundongo usando FACS atende diretamente à necessidade de entradas celulares de alta fidelidade na descoberta de alvos neurovasculares. Este protocolo aumenta a confiança preditiva em estudos de sequenciamento de RNA de única célula ao minimizar estresse celular e agregação, apoiando a validação rigorosa de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta precoce de fármacos para o SNC. A abordagem permite fluxos de trabalho escaláveis e reprodutíveis, essenciais para triagem de portfólio e continuidade da pesquisa translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação precisa da heterogeneidade dos pericitos relevante para os mecanismos das doenças neurovasculares.
- Apóia a validação funcional de alvos ao fornecer entradas de alta qualidade de células individuais para perfis transcriptômicos.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio do isolamento reprodutível de populações celulares definidas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece populações validadas de pericitos para ensaios de célula única e triagens moleculares subsequentes.
- Melhora a reprodutibilidade e padronização dos ensaios ao minimizar a agregação celular e o estresse.
- Permite leituras quantitativas essenciais para a avaliação confiável de compostos em pipelines focados no SNC.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se à modelagem de sistemas relevantes para doenças ao isolar pericitos implicados na patologia neurovascular.
- Permite continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio da geração de dados de alta qualidade em nível de célula única.
- Oferece uma plataforma para identificar biomarcadores translacionais associados à disfunção dos pericitos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de isolamento de pericitos baseado em FACS integra-se na interface entre descoberta inicial e pesquisa pré-clínica, fornecendo material celular de alta qualidade para sequenciamento em nível de única célula e estudos funcionais subsequentes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao permitir a análise transcriptômica de células individuais de pericitos.
- Triagem: Fornece populações celulares viáveis e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e triagem de compostos.
- Análises: Fornece dados quantitativos de RNA de célula única para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Facilita a descoberta de biomarcadores e a elucidação de mecanismos de doenças em modelos neurovasculares.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado adaptável a outros tipos celulares do SNC mediante otimização de marcadores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neurovasculares.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de isolamento de células individuais.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avançar ou não avançar e a eficiência do capital no avanço da carteira de projetos do SNC.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos neurovasculares e programas translacionais.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em operação de FACS e seleção de marcadores celulares neurovasculares.
- Exige acesso a infraestrutura de citometria de fluxo e sequenciamento de célula única de alta qualidade.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de processamento de tecidos e separação celular.
- Pode exigir adaptação dos painéis de marcadores para outros tipos celulares do SNC ou modelos de doenças.
- A viabilidade celular e a integridade do RNA dependem de manipulação precisa e prevenção de agregação mediada por BSA.
