Método Padronizado para Detectar Nanotubos de Tunelamento em Células de Pele Humana para Aplicações de Engenharia de Tecidos

Desenvolvemos métodos para detectar e analisar de forma confiável os nanotubos de tunelamento entre células da pele humana e estudar seu papel potencial na regeneração da pele. Nosso protocolo foi projetado para amostras fixas ou para células primárias da pele humana. É útil em pesquisas relacionadas à biologia da pele e à regeneração de tecidos.

Para começar, descongele e cultive queratinócitos epidérmicos humanos e fibroblastos dérmicos em recipientes de 60 milímetros contendo o meio de crescimento adequado. Suplemente as culturas de queratinócitos com Y-27632 até uma concentração final de cinco micromolares durante a ressuscitação. Mantenha todas as culturas a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada até que atinjam aproximadamente 80% de confluência.

Depois, retire o meio do prato de cultura. Enxágue brevemente as células com um mililitro de PBS para manter o pH fisiológico e a osmolaridade durante a lavagem. Aspire completamente o PBS.

Adicione um mililitro de EDTA 0,05% de tripsina e distribua-a uniformemente pela superfície celular. Incube o prato a 37 graus Celsius por 1,5 a 2,5 minutos. Resuspenda suavemente as células pipetando para cima e para baixo.

Adicione dois mililitros de meio de crescimento para neutralizar a tripsina. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 15 mililitros e centrifuge a 200 G por cinco minutos em temperatura ambiente. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante do tubo da centrífuga.

Ressuspenda o pellet celular em um a dois mililitros de meio e conte as células usando um contador automático. Em seguida, seme 12.000 fibroblastos dérmicos ou 20.000 queratinócitos em cada poço de uma lâmina de câmara de oito poços em um volume final de 400 microlitros. Após a semeadura, agite bem a câmara para distribuir as células de forma uniforme e incube as células a 37 graus Celsius por aproximadamente 24 horas.

Após a incubação, confirme se a confluência celular está em torno de 80% sob o microscópio. Quando as culturas atingirem 80% de confluência, adicione suavemente várias gotas de solução fixativa, uma diretamente no poço da câmara, para prefixar as células. Incube as células em temperatura ambiente por quatro minutos, garantindo que o fixador se espalhe uniformemente, sem perturbar as células.

Em seguida, aspire o pré-fixador do poço e adicione 140 microlitros de solução fixativa fresca um, garantindo cobertura completa da superfície do poço. Incube a lâmina a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, remova o fixador do poço da câmara e adicione 140 microlitros de 100 milimolares cloreto de amônio para temperar os aldeídos residuais.

Incube a lâmina em temperatura ambiente por 10 a 30 minutos. Enxágue as amostras três vezes com PBS por 30 segundos em temperatura ambiente. Durante cada enxágue, pipete suavemente o buffer ao longo da parede da câmara para evitar lavar as células ou danificar nanotubos que se tunelam.

Incubar as células com 140 microlitros de uma diluição volume-volume 1:300 do conjugado de farinha Alexa aglutinina do germe de trigo em PBS. Realize a incubação no escuro, em temperatura ambiente, por 20 minutos para marcar glicoproteínas da membrana plasmática e visualizar nanotubos de tunelamento derivados da membrana. Depois, lave as células três vezes com PBS por 30 segundos cada.

Depois, incubar as células com 140 microlitros de conjugado de faloidina diluído de uma a 250 vezes em 1% de BSA por 30 minutos no escuro, em temperatura ambiente. Após lavar as células três vezes com PBS, incube-as com 140 microlitros de solução DAPI por cinco minutos em temperatura ambiente, no escuro. Por fim, adicione de duas a três gotas de meio de montagem em cada poço e incube a amostra em temperatura ambiente por 20 minutos.

Armazene as lâminas a quatro graus Celsius no escuro por pelo menos 20 minutos até a obtenção da imagem. Em culturas de fibroblastos dérmicos, nanotubos de tunelamento foram observados como longas e finas projeções conectando células adjacentes a membranas coradas por aglutinina de germe de trigo e F-actina marcada por faloidina. Em culturas de queratinócitos epidérmicos, nanotubos de tunelamento com protuberâncias características F-actina positivas também foram observados fazendo a ponte entre células vizinhas.

Em coculturas de fibroblastos dérmicos e queratinócitos epidérmicos, nanotubos de tunelamento foram consistentemente detectados entre fibroblastos dérmicos e queratinócitos epidérmicos, visualizados por coloração por membrana e citoqueratina 5. Os nanotubos de tunelamento nas coculturas apresentaram uma organização citoesquelética diversificada, com exemplos contendo apenas F-actina, tanto os filamentos, F-actina com alfa-tubulina parcial, quanto com baixos níveis de alfa-tubulina. O principal desafio é preservar o túnel em nanotubos.

Isso requer fixação suave, tempo apropriado e o uso de aditivos fixos recém-preparados. Usando nosso protocolo, os nanotubos de tunelamento podem ser medidos sob diferentes condições celulares para explorar suas funções potenciais. No futuro, marcaremos mitocôndrias fluorescentes para estudar sua transferência por meio de nanotubos de tunelamento.