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Os autores agradecem aos desenvolvedores e mantenedores dos pacotes Seurat, Giotto e SPOTlight pelo suporte e documentação. Agradecem também, com gratidão, as contribuições dos repositórios públicos de dados e dos pesquisadores que generosamente compartilharam seus conjuntos de dados.

<ol>
	<li>Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.</li>
	<li>Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.</li>
	<li>Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.</li>
	<li>Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcriptomics data sharing, analysis and visualization. Accessed October 31, 2025. https://dx.doi.org/10.1093/nar/gkad933</li>
	<li>Wang G, Wu S, Xiong Z, Qu H, Fang X, Bao Y. CROST: A comprehensive repository of spatial transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D882-D890.</li>
	<li>Chen JG, Ch&#225;vez-Fuentes JC, O&#8217;Brien M, et al. Giotto Suite: a multiscale and technology-agnostic spatial multiomics analysis ecosystem. Nat Methods. 2025;22(10):2052-2064. doi:10.1038/s41592-025-02817-w</li>
	<li>Butler A, Hoffman P, Smibert P, Papalexi E, Satija R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 2018;36(5):411-420.</li>
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	<li>Luecken MD, B&#252;ttner M, Chaichoompu K, et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 2022;19(1):41-50.</li>
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	<li>Cuevas-Diaz Duran R, Wei H, Wu J. Data normalization for addressing the challenges in the analysis of single-cell transcriptomic datasets. BMC Genomics. 2024;25(1):444.</li>
	<li>Sun S, Zhu J, Zhou X. Statistical analysis of spatial expression patterns for spatially resolved transcriptomic studies. Nat Methods. 2020;17(2):193-200.</li>
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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho computacional abrangente para análise de dados de transcriptômica espacial, equilibrando profundidade analítica com acessibilidade prática. A abordagem passo a passo orienta pesquisadores ao longo do pipeline analítico completo, desde a aquisição inicial dos dados até análises espaciais avançadas, enfatizando pontos críticos de decisão e armadilhas potenciais.
Várias etapas do protocolo merecem atenção especial devido ao seu impacto nos resultados subsequentes. Os limiares de controle de qualidade e filtragem devem ser cuidadosamente ajustados de acordo com os tipos específicos de tecido e plataformas tecnológicas, pois uma filtragem excessivamente rigorosa pode eliminar pontos biologicamente relevantes, enquanto limiares mais permissivos podem introduzir ruídos técnicos. A escolha do método de normalização influencia significativamente os resultados de agrupamento e de expressão diferencial. Por exemplo, o pipeline utiliza o SCTransform em vez da normalização logarítmica padrão porque o SCTransform tem demonstrado modelar e reduzir a variação técnica relacionada à profundidade de sequenciamento e a outros efeitos técnicos em fluxos de trabalho de célula única e espaciais14,15. Durante a integração, a seleção de características de integração e dos parâmetros de resolução exige consideração cuidadosa para equilibrar a força da integração com a preservação do sinal biológico. Para a identificação de genes espacialmente variáveis, o Índice de Moran foi escolhido pela escalabilidade computacional e adequação à análise de autocorrelação espacial em dados baseados em matrizes, embora chamadores alternativos, como o SPARK, possam ser considerados dependendo do tamanho do conjunto de dados e dos objetivos do estudo16.
O componente de solução de problemas deste fluxo de trabalho concentra-se em problemas comuns de interoperabilidade que ocorrem ao passar saídas de um pacote para outro. Em vez de depender de uma única etapa genérica de conversão, o fluxo de trabalho utiliza conversões personalizadas de formato em cada interface de software: dados espaciais de contagem são copiados para um espaço padrão de ensaio de RNA antes da integração no Seurat; objetos de referência do Seurat e de célula única são convertidos em objetos SingleCellExperiment para o SPOTlight; matrizes espaciais de contagem são reformatadas para o STdeconvolve; contagens derivadas do Seurat, coordenadas e metadados de tipos celulares são convertidos em um objeto Giotto para análise de comunicação entre células; e anotações de ROI provenientes do Select Spatial Spots são exportadas como arquivos CSV com CELL_ID, coordenadas X/Y e rótulos de grupo, para que possam ser mapeadas de volta ao objeto Seurat. Essas etapas ajudam os usuários a identificar e corrigir problemas comuns, como espaços de ensaio incompatíveis, identificadores de spots não correspondentes, colunas de metadados ausentes, formatação incorreta de coordenadas e discrepâncias nos símbolos gênicos de ligante-receptor.
Um recurso adicional deste fluxo de trabalho é o uso de duas estratégias complementares de desconvolução, em vez de depender de um único algoritmo. O SPOTlight utiliza referências prévias de scRNA-seq para estimativa orientada por referência das proporções de tipos celulares, enquanto o STdeconvolve permite a descoberta livre de referência de tópicos transcricionais latentes. No conjunto de dados demonstrativo, os tópicos do STdeconvolve alinharam-se com regiões definidas histologicamente (Figura 5B), apoiando a interpretabilidade biológica. Uma comparação quantitativa direta entre os dois métodos não foi realizada neste protocolo; os usuários que desejarem compará-los com seus próprios dados podem seguir a estrutura fornecida na etapa 7.3.2 do protocolo. Além disso, o protocolo favorece a usabilidade e a rastreabilidade ao utilizar scripts para funções principais, ao mesmo tempo que oferece uma interface gráfica (Selecionar Pontos Espaciais) para o isolamento intuitivo de regiões de interesse (ROI).
A integração entre Seurat e Giotto permite que o fluxo de trabalho combine o pré-processamento e a integração baseados no Seurat com as estatísticas espaciais e a análise de redes baseadas no Giotto. O Seurat oferece um ambiente consolidado para pesquisadores com experiência em scRNA-seq e suporta integração de múltiplas amostras, enquanto a transferência dos dados harmonizados para o Giotto possibilita a construção de redes espaciais e a análise de ligantes-receptores. Esse design permite aos usuários aproveitar as funcionalidades comprovadas de ambas as plataformas, sem implicar que tenham sido comparadas diretamente com Squidpy ou outras ferramentas neste contexto. Para comunicação célula-célula, foi utilizada a inferência de ligante-receptor baseada na rede de Delaunay do Giotto, pois incorpora a adjacência espacial dentro do mesmo ambiente analítico; outras ferramentas, como o CellChat, fornecem bancos de dados de sinalização extensos, mas não são avaliadas neste protocolo17.
Várias limitações devem ser consideradas. A abordagem de desconvolução baseada em referência depende criticamente da disponibilidade de referências de célula única de alta qualidade e correspondentes. Além disso, as suposições fundamentais por trás da análise de comunicação entre células baseiam-se na coexpressão de transcritos como um indicador de interação física entre proteínas, exigindo posterior validação experimental. Por fim, este fluxo de trabalho foi desenvolvido principalmente para conjuntos de dados Visium padrão. À medida que a área avança em direção a tecnologias de resolução quase de célula única, como o Visium HD, as considerações analíticas mudarão; dados de maior resolução podem exigir parâmetros diferentes de pré-processamento e reduzir a necessidade absoluta de desconvolução de spots. Para adaptar este fluxo de trabalho a conjuntos de dados Visium HD, os bins de alta resolução podem ser computacionalmente agregados em bins espaciais maiores, ou os módulos de desconvolução de spots podem ser ignorados em favor de segmentação celular baseada em imagem18.
Essas características sugerem uma aplicabilidade potencial em diversos domínios biológicos, incluindo biologia do desenvolvimento, neurociência, pesquisa em câncer e imunologia19,20,21,22. O design modular permite que pesquisadores adaptem componentes específicos às suas necessidades, seja com foco na identificação de domínios espaciais, comunicação celular ou especialização regional. À medida que as tecnologias espaciais continuam a evoluir e os conjuntos de dados se expandem, este protocolo fornece uma base que pode ser ampliada para incorporar novos métodos analíticos e responder a questões biológicas emergentes.

A transcriptômica espacial (ST) é uma família transformadora de tecnologias que mede a expressão gênica em todo o genoma ao mesmo tempo em que preserva as coordenadas espaciais das moléculas de RNA mensageiro (mRNA) dentro de seções de tecido. Os métodos de ST incluem abordagens baseadas em sequenciamento que utilizam matrizes com códigos de posição e abordagens de imagem in situ que mapeiam sinais transcricionais dentro de microambientes teciduais intactos1,2. Ao preservar o contexto espacial, a ST permite a análise da arquitetura tecidual, da organização de vizinhanças celulares, da comunicação entre células e de processos biológicos associados ao microambiente que não podem ser totalmente resolvidos após a dissociação do tecido3.
O rápido crescimento dos repositórios públicos de dados de ST criou oportunidades sem precedentes para análise secundária e desenvolvimento de métodos3. Recursos como a base de dados CROST curam centenas de conjuntos de dados transcriptômicos com resolução espacial em múltiplas espécies e plataformas tecnológicas, enquanto coleções especializadas como o STOmicsDB focam em metodologias específicas, tais como o Stereo-seq4,5. Apesar dessa abundância de dados, a análise computacional permanece desafiadora devido à complexidade das estruturas de dados espaciais, à diversidade de ferramentas analíticas e aos obstáculos técnicos na implementação de fluxos de trabalho reprodutíveis6,7,8,9,10,11.
Para superar as limitações de depender de um único ambiente de software, apresenta-se aqui um fluxo de trabalho computacional integrado que utiliza ferramentas analíticas complementares. Os ecossistemas existentes de análise de ST incluem principalmente Seurat, Giotto e estruturas baseadas em Python, como o Squidpy6,7,12. Embora ferramentas baseadas em Python, como o Squidpy, ofereçam funcionalidades extensas para análise de grafos espaciais, consolidar o principal fluxo computacional dentro de um único ambiente de linguagem de programação minimiza dificuldades técnicas entre linguagens. Consequentemente, o fluxo principal é implementado principalmente em R para reduzir essas dificuldades técnicas entre linguagens. Neste fluxo de trabalho baseado em R, o Seurat é utilizado para carregamento de dados, controle de qualidade, normalização, redução de dimensionalidade, visualização e integração de múltiplas amostras, refletindo seu uso comum em fluxos de trabalho de transcriptômica única de célula e espacial. O Giotto é então usado para a construção da rede espacial e para a análise de comunicação célula a célula baseada em ligante-receptor. Assim, este fluxo de trabalho conecta o pré-processamento e integração baseados no Seurat à análise espacial baseada no Giotto, mantendo explícita e reprodutível a transferência de dados entre os dois conjuntos de ferramentas.
Dentro desse enfoque, duas estratégias complementares de desconvolução são implementadas: SPOTlight, um método orientado por referência que utiliza dados de scRNA-seq para estimar as proporções de tipos celulares, e STdeconvolve, um método não supervisionado baseado em modelagem de tópicos que identifica padrões transcricionais latentes8,11. Os resultados fornecem visões complementares da heterogeneidade celular espacial, mas não são tratados como uma validação cruzada quantitativa, a menos que os usuários realizem a análise opcional de concordância descrita no protocolo. Uma aplicação personalizada em Python Dash, Select Spatial Spots, é integrada para anotação interativa de regiões de interesse (ROI) e exporta arquivos de anotação baseados em coordenadas padrão que podem ser utilizados em análises downstream subsequentes.
Quanto à aplicabilidade prática, este fluxo de trabalho destina-se principalmente a dados de ST baseados em matrizes padrão (por exemplo, Visium com resolução de 55 µm) e pode ser adaptado a outros tipos de tecidos após avaliação dos parâmetros. Limitações importantes devem ser consideradas antes da análise. Primeiro, o módulo de desconvolução orientado por referência depende de uma referência de scRNA-seq de alta qualidade e correspondente ao tecido. Segundo, plataformas subcelulares ou próximas da resolução unicelular podem exigir pré-processamento modificado, agregação espacial de bins ou segmentação celular baseada em imagem antes da integração2. O conjunto de dados representativo do cólon de camundongo é utilizado como um caso de demonstração para mostrar como o fluxo de trabalho pode avaliar domínios espaciais e a organização tecidual definida por marcadores, e não como evidência de compatibilidade universal da plataforma.

<table><tbody><tr><td>ggplot2</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v4.0.0(CRAN)</td><td>Visualização avançada de dados</td></tr><tr><td>Giotto</td><td>Dries Lab</td><td>v4.2.2 (GitHub)</td><td>Análise espacial de redes e comunicação entre células</td></tr><tr><td>patchwork&amp;nbsp;</td><td>Thomas Lin Pedersen</td><td>v1.3.2 (CRAN)</td><td>Composição e organização de gráficos</td></tr><tr><td>R software&amp;nbsp;</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>v4.4.3</td><td>Ambiente principal de execução (macOS aarch64)</td></tr><tr><td>scater</td><td>Davis McCarthy et al.</td><td>v1.34.1 (Bioconductor)</td><td>Controle de qualidade e visualização em nível de célula única</td></tr><tr><td>scran</td><td>Aaron Lun et al.</td><td>v1.34.0 (Bioconductor)</td><td>Modelagem de variância em células únicas e detecção de marcadores</td></tr><tr><td>Select Spatial Spots (Ferramenta Python personalizada)</td><td>LeafLight</td><td>v1.0.0 (GitHub)</td><td>Seleção interativa de regiões de interesse espaciais (ROI) (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)</td></tr><tr><td>Seurat&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.3.0 (CRAN)</td><td>Pré-processamento, integração e agrupamento de dados espaciais</td></tr><tr><td>SeuratObject&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.2.0 (CRAN)</td><td>Estruturas de dados para dados de célula única e espaciais</td></tr><tr><td>SingleCellExperiment</td><td>Equipe Núcleo do Bioconductor</td><td>v1.28.1 (Bioconductor)</td><td>Contêiner padronizado para scRNA-seq</td></tr><tr><td>SPOTlight</td><td>Marc Elosua-Bayes et al.</td><td>v1.10.0 (Bioconductor)</td><td>Desconvolução espacial guiada por referência</td></tr><tr><td>Stdeconvolve</td><td>Laboratório de Jean Fan</td><td>v1.3.2 (Bioconductor)</td><td>Modelagem latente não supervisionada por tópicos</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v2.0.0 (CRAN)</td><td>Suporte principal para manipulação e formatação de dados</td></tr></tbody></table>

um fluxo de trabalho prático para a análise de dados de transcriptômica espacial: da aquisição de dados às análises avançadas

A Practical Workflow for Spatial Transcriptomics Data Analysis: From Data Acquisition to Advanced Analyses

A transcriptômica espacial (ST) caracteriza a expressão gênica em todo o genoma ao mesmo tempo em que preserva o contexto espacial bidimensional das moléculas de mRNA dentro de seções de tecido, permitindo estudos sobre a arquitetura tecidual e a biologia associada ao microambiente. No entanto, a análise de ST ainda é desafiadora porque a importação de dados, controle de qualidade, integração, desconvolução, estatísticas espaciais e visualização frequentemente exigem múltiplos ambientes de software e escolhas reprodutíveis de parâmetros. Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho computacional prático para conjuntos de dados públicos de ST em R, começando pela aquisição de dados e configuração do software e prosseguindo com o carregamento de dados baseado no Seurat, controle de qualidade, normalização, integração de múltiplas amostras, agrupamento e análise de genes espacialmente variáveis. O fluxo de trabalho aplica então estratégias complementares de desconvolução, incluindo a análise SPOTlight guiada por referência e a modelagem de tópicos não supervisionada com STdeconvolve, seguida por análise espacial de comunicação célula a célula baseada no Giotto e seleção interativa de regiões de interesse (ROI) utilizando uma aplicação personalizada em Python Dash. Ao enfatizar a execução baseada em scripts, justificativas explícitas dos parâmetros, saídas esperadas e pontos de verificação para solução de problemas, o protocolo fornece um framework adaptável para conjuntos de dados padrão de ST baseados em matrizes e plataformas relacionadas após avaliação de parâmetros específicos do conjunto de dados e da plataforma.

Implementação do fluxo de trabalho e integração de dados ilustram as principais características dos tecidos
O fluxo de trabalho computacional foi aplicado a dados de transcriptômica espacial de cólon de camundongo para ilustrar as saídas esperadas em cada estágio analítico. Conforme representado no esquema do fluxo de trabalho (Figura 1), o processo iniciou-se com a aquisição de dados e controle de qualidade, em que os gráficos espaciais de características delimitaram os limites do tecido (Figura 2A,B). Em seguida, utilizou-se o fluxo de integração baseado em âncoras do Seurat para reduzir efeitos técnicos de lote, ao mesmo tempo que preservava a variação biológica interpretável. Visualizações UMAP mostraram o alinhamento das amostras e os padrões de agrupamento espacial após a integração (Figura 2C,D). A seleção quantitativa e dinâmica de componentes principais (PCs) com base na variância acumulada foi implementada para orientar a redução dimensional e o agrupamento subsequente (ver Figura Suplementar 1). A análise de mapa de calor de genes marcadores revelou perfis transcripcionais distintos subjacentes aos agrupamentos espaciais (Figura 2E).
Para avaliar se os agrupamentos computacionais eram consistentes com a arquitetura anatômica conhecida da histologia do cólon, os perfis de expressão de genes marcadores canônicos específicos de camada foram analisados. A camada do epitélio mucoso mostrou expressão de marcadores de células epiteliais, incluindo Epcam e Krt8, juntamente com o marcador de células caliciformes Muc2. Marcadores mesenquimais e estromais, como Col1a1 e Vim, identificaram a lâmina própria e as regiões submucosas, enquanto a camada externa da muscularis própria foi indicada por genes estruturais de músculo liso, como Acta2 e Tagln. A restrição espacial desses marcadores associados a linhagens sustenta a interpretação de que o fluxo de trabalho de integração e agrupamento preservou as principais laminações histológicas do tecido colônico ao longo do eixo mucosa-muscularis (ver Supplementary Figure 2).
Após a validação dos clusters, foi realizada uma análise diferencial de expressão gênica para identificar genes diferencialmente expressos (GDEs) entre as condições experimentais (Figura 2F,G). Além disso, genes espacialmente variáveis foram identificados utilizando a estatística de Moran's I, destacando genes com distribuição espacial significativamente não aleatória ao longo do tecido (Figura 2H).
As desconvolução celular e as redes de interação espacial revelam a microorganização tecidual
O processamento dos dados de referência de RNA-seq de célula única gerou anotações apoiadas por filtragem de controle de qualidade (Figura 3A), agrupamento não supervisionado (Figura 3B), validação de genes marcadores (Figura 3C) e concordância com anotações independentes (Figura 3D). A composição celular (Figura 3E) orientou a estratégia de subamostragem para a desconvolução. O SPOTlight estimou as proporções de tipos celulares guiadas por referência em pontos espaciais (Figura 4A,B), enquanto o STdeconvolve forneceu uma visão baseada em modelagem de tópicos não supervisionada dos padrões celulares espaciais (Figura 5B). A ferramenta personalizada Selecionar Pontos Espaciais forneceu contexto histológico para esses padrões (Figura 5A). Finalmente, utilizando as atribuições de tipos celulares desconvolutadas, a análise de comunicação espacial identificou interações ligante-receptor entre grupos de tipos celulares proximais no espaço (Figura 6A,B).
Observações de solução de problemas a partir da otimização do protocolo
Durante a otimização do protocolo, foram identificados vários problemas que orientaram pontos de controle práticos. Resultados de desconvolução subótimos ocorreram quando as referências de célula única não foram bem correspondidas ao contexto tecidual, indicando a necessidade de usar dados de scRNA-seq compatíveis com o tecido e a espécie, quando disponíveis. Tentativas iniciais de agrupamento com parâmetros padrão nem sempre resolveram estruturas biológicas esperadas; a inspeção da seleção de componentes principais (PC), resolução do agrupamento e coerência dos genes marcadores ajudou a identificar domínios com interpretação espacial alinhados à anatomia do tecido. Essas observações fornecem exemplos práticos de como os usuários podem diagnosticar problemas analíticos comuns durante a execução do fluxo de trabalho.
<img alt="Diagrama do fluxo de trabalho de análise de dados de scRNA-seq. Processos: normalização, integração, agrupamento." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1: Fluxo de trabalho para análise integrada de transcriptômica espacial. Representação esquemática do pipeline analítico, desde a aquisição e pré-processamento dos dados até as análises espaciais avançadas. Os principais passos incluem: (1) Carregamento dos dados, controle de qualidade e integração multi-amostral utilizando o Seurat; (2) Agrupamento espacial e detecção de genes com variabilidade espacial; (3) Desconvolução de tipos celulares via métodos baseados em referência (SPOTlight) e não supervisionados (STdeconvolve); (4) análise espacial de comunicação célula a célula com Giotto e seleção interativa de região de interesse usando uma ferramenta personalizada, Selecionar Pontos Espaciais. Os resultados de todos os módulos são sintetizados para obter insights biológicos sobre a arquitetura tecidual e o microambiente celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise de transcriptômica espacial com gráficos de violino, agrupamento t-SNE, gráfico de volcão e dados de mapa de calor." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Integração de dados, agrupamento e análise de expressão diferencial. (A,B) Métricas de controle de qualidade para as amostras espaciais A1 e B1, mostrando as distribuições de contagens de genes, contagens de UMI e porcentagens de genes mitocondriais. (C) Visualização UMAP dos dados integrados de transcriptômica espacial, colorida por origem da amostra (esquerda) e identidade de agrupamento (direita). (D) Projeção espacial das identidades dos agrupamentos sobre as seções de tecido. (E) Mapa de calor dos principais genes marcadores para cada agrupamento espacial. (F) Gráfico de volcão exibindo genes diferencialmente expressos entre as condições A1_colon_d0 e B1_colon_d14. (G) Padrões de expressão espacial de genes representativos diferencialmente expressos ao longo das seções de tecido. (H) Mapas de expressão espacial dos principais genes com variabilidade espacial identificados via estatística de Moran's I, com os dois painéis à esquerda exibindo genes da amostra A1_colon_d0 e os dois painéis à direita exibindo genes da amostra B1_colon_d14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise de scRNA-seq: gráficos de violino, agrupamentos UMAP, pontuações de tipo celular e distribuição em gráfico de barras." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Processamento e anotação de dados de referência de única célula. (A) Métricas de controle de qualidade para dados de referência de scRNA-seq antes e após a filtragem. (B) Visualização UMAP dos dados de scRNA-seq colorida por agrupamentos não supervisionados. (C) Gráfico de pontos mostrando as pontuações de expressão dos genes marcadores canônicos de tipos celulares nos diferentes agrupamentos. (D) Visualização UMAP anotada dos dados de scRNA-seq com os principais tipos celulares identificados. (E) Composição celular do conjunto de dados de referência de scRNA-seq. A linha vermelha tracejada indica o limiar de subamostragem (n = 50 células por tipo) aplicado durante a desconvolução SPOTlight para equilibrar eficiência computacional e representação dos tipos celulares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Distribuição de tipos celulares, imagens de microscopia; análise de linfócitos B, endoteliais e fibroblastos em tecidos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Desconvolução espacial da heterogeneidade celular. (A,B) Gráficos de dispersão espaciais em formato de pizza gerados pela desconvolução com SPOTlight, mostrando a composição proporcional dos principais tipos celulares em cada ponto para as amostras A1 (A) e B1 (B). (C) Distribuição espacial representativa de linfócitos B nas amostras A1 (esquerda) e B1 (direita), demonstrando os padrões de localização espacialmente resolvidos de uma população específica de células imunes identificada por meio da desconvolução. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise de expressão gênica espacial, diagrama mostrando tipos celulares e grupos de pixels em seção de tecido." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Análise interativa de região de interesse e comparação de desconvolução não supervisionada. (A) Interface da ferramenta personalizada "Selecionar Pontos Espaciais" mostrando a seleção interativa de regiões correspondentes ao cólon proximal, cólon distal e outros domínios teciduais. (B) Visualização espacial em gráfico de pizza mostrando os resultados da desconvolução não supervisionada (STdeconvolve) para a amostra A1, com pontos coloridos de acordo com as regiões anotadas manualmente em (A), ilustrando a correspondência entre a anotação baseada em histologia e as distribuições de tópicos celulares derivadas computacionalmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráfico de comunicação célula-célula com interações ligante-receptor e valores log2fc; diagrama de bolhas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 6"> 
Figura 6: Redes espaciais de comunicação célula-célula informadas pela localização espacial. (A,B) Redes de interação ligante-receptor inferidas pelo Giotto para as amostras A1 (A) e B1 (B). Os nós representam tipos celulares, as arestas representam pares significativos de ligante-receptor (FDR &lt; 0,05) e a espessura das arestas corresponde à intensidade da interação. Para garantir comparabilidade e clareza na visualização, foi aplicado um limiar uniforme de significância (FDR &lt; 0,05) em todas as amostras, exibindo-se as 20 principais interações classificadas por log2FC para cada condição. As redes destacam padrões específicos de comunicação entre tipos celulares no contexto espacial do tecido do cólon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.</a>
Figura Suplementar 1: Avaliação quantitativa da otimização de parâmetros para redução de dimensionalidade. O gráfico do cotovelo demonstra a abordagem programática do fluxo de trabalho para selecionar dinamicamente o número ótimo de componentes principais (PCs). A seleção é calculada com base nos limiares de desvio padrão acumulado e de variância marginal, representados pela linha vertical vermelha, com o objetivo de capturar a variância biológica enquanto reduz o ruído técnico antes do agrupamento subsequente.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS1.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar 2: Validação do agrupamento espacial utilizando marcadores específicos das camadas colônicas canônicas. (A) Gráfico de pontos mostrando a expressão enriquecida de marcadores epiteliais, estromais e de músculo liso nos agrupamentos computacionais. (B) Gráficos de características espaciais mapeando marcadores representativos (Epcam, Col1a1, Acta2) de volta às coordenadas do tecido.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS2.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho reprodutível para análise de dados de transcriptômica espacial, orientando os usuários desde a aquisição de dados públicos e controle de qualidade baseado no Seurat até a integração, detecção de características espaciais, desconvolução de tipos celulares, anotação de regiões de interesse e análise de comunicação célula-célula, com pontos de verificação práticos que apoiam a execução transparente.

Um Fluxo de Trabalho Prático para a Análise de Dados de Transcriptômica Espacial: da Aquisição de Dados às Análises Avançadas

A transcriptômica espacial (ST) traça o perfil da expressão gênica em todo o genoma, preservando o contexto espacial bidimensional das moléculas de mRNA dentro do tecido...

Olá a todos. Neste vídeo, vamos percorrer um pipeline prático de análise de dados de transcriptômica espacial, desde a aquisição e carregamento dos dados até a exploração básica e, por fim, a análise avançada. No geral, o fluxo de trabalho consiste em três etapas principais.Primeiro, baixar os dados; segundo, obter o código de análise; e terceiro, executar o pipeline para gerar os resultados. Etapa um: aquisição de dados e preparação da estrutura de diretórios. Primeiro, obtenha conjuntos de dados públicos de transcriptômica espacial.Baixe o arquivo de dados brutos. E extraia o arquivo. Organize os arquivos em uma estrutura de diretórios padronizada.Primeiro, crie um diretório principal de dados e, em seguida, crie um subdiretório dedicado para cada amostra. Transfira os seguintes arquivos essenciais de cada amostra para o subdiretório respectivo. Depois, crie uma subpasta espacial dentro de cada diretório de amostra.Coloque os seguintes arquivos na subpasta espacial. Coloque o arquivo S1 de métricas de PC de características filtradas na subpasta principal da amostra. Descompacte os arquivos gzip na pasta espacial.Garanta que os nomes originais dos arquivos permaneçam exatamente como exigido pela função de carregamento espacial 10X. Segundo passo: configuração do ambiente de software. Aqui, pulamos a instalação da linguagem R e o processo de análise começa com a obtenção do script de análise no repositório do GitHub.Instale os pacotes R necessários do Graham no arquivo do condutor executando o script setup R. Instale o auto suit executando os comandos de instalação fornecidos na planilha do documento oficial. Acesse a URL oficial de instalação para recuperar os scripts de configuração. Inicialize o ambiente Python necessário e as dependências do sistema de acordo com as instruções da página de configuração.Obtenha a ferramenta personalizada acessando o repositório do GitHub e baixe o código-fonte. Navegue até o diretório TOS e instale as dependências do Python. Passo três: carregamento dos dados espaciais e controle de qualidade.Leia os dados espaciais no objeto Seurat. Use ler imagem 10X para carregar manualmente a imagem de tecido de alta resolução. Especifique a imagem e o nome da imagem.Utilize a opção carregar 10X espacial com a imagem definida como o objeto de imagem criado na etapa anterior e crie o objeto Seurat. Calcule as métricas de controle de qualidade. Compute a porcentagem de leituras mitocondriais utilizando o conjunto de características percentuais com o padrão mt.Visualize e interprete os dados com base nas métricas de controle de qualidade (QC). Gere gráficos de violino de nCount_Spatial, nFeature_Spatial e percent. mt utilizando a função de gráfico de violino.Crie gráficos de características espaciais dessas métricas utilizando gráficos de características espaciais. E identifique pontos fora da área do tecido. Opcional: aplique filtros para remover pontos de baixa qualidade.Após executar o script, você pode obter esses resultados, incluindo métricas de controle de qualidade (QC) e o gráfico espacial de características. Passo quatro, pré-processamento dos dados, integração e agrupamento. Normalizar no pré-processamento de amostras individuais.Aplicar, separadamente para cada amostra, a normalização SC transform com o ensaio Spatial. Integrar múltiplas amostras. Preparar a lista de objetos normalizados por SCTransform para integração.Certifique-se de que cada objeto tenha um ensaio de RNA copiando o ensaio espacial. Utilize as características de integração selecionadas na integração PREP SCT para identificar características variáveis compartilhadas. Encontre os âncoras de integração utilizando encontrar âncoras de integração com o método de normalização SCT.Integre os dados utilizando IntegrateData. Realize a redução de dimensionalidade na agrupamento no ensaio integrado. Execute PCA nos dados integrados utilizando runPCA.Determine o número ideal de componentes principais para a análise subsequente calculando a variância acumulada explicada. Identifique o ponto de cotovelo por meio de programa adequado. Execute o UMap utilizando o número determinado de PC.Agrupe as células utilizando FindNeighbors e FindClusters. Especifique os PCs determinados na resolução definida em 0,5. Realize análise de expressão diferencial entre os grupos-alvo utilizando a função FindWorkers.Identifique genes com variabilidade espacial. Para cada amostra original, execute a busca de características espacialmente variáveis utilizando o método de Moran's I no ensaio SCT para calcular a autocorreção espacial. Após executar este script, você poderá obter o gráfico de cotovelo, o gráfico UMap, o gráfico de agrupamento, o mapa de calor dos marcadores de agrupamento, o gráfico de volcão, os genes diferencialmente expressos por característica espacial, os genes espacialmente confiáveis e os marcadores das camadas do cólon.E o gráfico de pontos dos marcadores da camada do cólon, juntamente com os marcadores no gráfico de características espaciais. Passo cinco, pré-processamento dos dados de referência de única célula. Leia a matriz de contagem de RNA-seq de única célula utilizando read 10X e crie um objeto Seurat.Realize a normalização de QC padrão e desagrupamento. Calcule a porcentagem de leituras mitocondriais nas células filtradas. Normalize os dados utilizando a transformação SC.Defina uma vara.to. Regresse o percent.mt. Execute a PCA e o UMap longos e agrupe as células utilizando o método dinâmico de seleção de PCs descrito nos passos anteriores, depois anote os tipos celulares.Calcule os escores dos módulos para genes marcadores de tipos celulares canônicos utilizando o AddModuleScore. Anote os agrupamentos com base nos escores dos módulos e na biologia conhecida. Alternativamente, importe anotações pré-computadas dos metadados.Após aprender este script, você poderá obter as métricas de controle de qualidade. Eles já enviaram o UMap por agrupamento, UMap por amostra e os escores de tipos celulares. Etapa seis, desconvolução guiada por referência com o SPOTlight.Primeiro, prepare os dados para o SPOTlight. Converta o objeto Seurat de célula única anotado e o objeto Seurat espacial em um objeto de experimento de célula única. Normalize os dados de célula única por log utilizando LogMoreCounts.Em seguida, execute a desconvolução SPOTlight. Primeiro, identifique genes altamente variáveis nos dados de célula única utilizando o ModelGeneVar. Calcule os marcadores de tipo celular usando a pontuação de marcadores e filtre os marcadores de alta qualidade.Reduza a amostragem da referência de célula única para cada tipo celular a um número gerenciável para diminuir o tempo computacional. Execute a desconvolução utilizando a função SPOTlight, fornecendo a referência de célula única, os dados espaciais, a lista de marcadores e os HVGs; em seguida, podemos visualizar e exportar os resultados. Você pode obter o resultado da desconvolução assim, mostrado como um gráfico de dispersão.Etapa sete, desconvolução não supervisionada com Stdeconvolve. Primeiro, prepare os dados espaciais. Extraia as métricas de contagem de linhas do objeto espacial Seurat utilizando GetAssayData com o slot counts.Remova pontos e genes de baixa qualidade utilizando contagens limpas do STdeconvolve. Identifique os tipos celulares latentes para os filtros que o corpus quatro genes expressos em uma fração mínima de pontos usando LDA restrito estrito por meio desse modelo de alocação em uma variedade de números potenciais de tópicos usando fitLDA. Selecione o modelo ótimo com base na complexidade mínima usando o modelo ótimo com opt min.Analise e visualize os resultados. Extraia a proporção de sorotipos, Theta, e os perfis gênicos Beta para o modelo ótimo utilizando getBetaTheta. Para incluir a interpretação biológica dos tópicos de corrosão, importe anotações de regiões de interesse geradas pela ferramenta de seleção de pontos espaciais.Use essas anotações como parâmetro do grupo na função com todos os tópicos. Ao seu projeto, recoloque as proporções de tipos celulares desconvoluídas nas coordenadas espaciais e codifique por cores os pontos conforme sua ROI. Após executar o script, você obterá um resultado como este, uma carga de tubo de escala, como aquelas produzidas pelo SPOTlight.Passo oito, comunicação espacial célula-célula usando o Giotto. Primeiro, converta o objeto Seurat em um objeto Giotto. Utilize a função createGiottoObject, fornecendo as métricas de contagem baixa e as coordenadas espaciais.Pré-processe o objeto Giotto e adicione o resultado da desconvolução. Normalize os dados utilizando o Giotto normalizado, adicionando como anotações de sorotipo. Escolha as metainformações das células utilizando addCellmetadata.Crie uma rede espacial utilizando o createSpatialNetwork. Carregue uma base de dados de receptores e ligantes em nosso ambiente. Execute o explore CellCellcom para identificar interações significativas entre ligantes e receptores entre tipos celulares que estão em proximidade espacial.Você pode obter o gráfico de pontos de comunicação célula-célula assim. O passo nove é opcional. Seleção interativa de pontos com SelectSpatialSpot.Prepare os dados para a ferramenta interativa usando o script six. Extraia as coordenadas espaciais do objeto Seurat usando GetTissueCoordinates. Formate e exporte os dados.Exporte o quadro de dados formativo para um arquivo CSV. Em seguida, realize a análise da região de interesse. Inicie o personalizado.Selecione as aplicações de pontos espaciais e carregue o arquivo CSV. Selecione interativamente os pontos com base na localização espacial. Em seguida, exporte a lista dos pontos selecionados e seus grupos atribuídos, rotulados como um novo arquivo CSV.Acabamos de verificar o que podemos obter após executar o script passo a passo. Todos os resultados são salvos na pasta de resultados dividida em cinco partes. E, como você pode ver, podemos obter as métricas de QC e dividir.E você pode verificar o gráfico de características espaciais aqui. Além disso, o processo de desconvolução é realizado de forma supervisionada e não supervisionada. Os resultados do SPOTlight estão aqui.Como você pode ver, todos os pontos contêm as informações de proporção. Os resultados da desconvolução não supervisionada pelo STdeconvolve também são gerados aqui. E este é o resultado dos agrupamentos do Seurat para o ponto nos dados espaciais.Você também pode visualizá-los no gráfico espacial da equipe, como este. Além disso, você também pode obter o resultado da comunicação entre spots usando o Giotto. Todo este fluxo de trabalho é 100% de código aberto.Análise de pontos desde as métricas de expressão até a modelagem espacial avançada. Todos os passos são executados em uma máquina com 16 GB de RAM. A base de código é modular, um script para cada tarefa.Observe que este fluxo de trabalho não abrange o processamento inicial a partir do preço FASTQ. O foco está nos dados espaciais 2D e atualmente inclui apenas os programas de download do Visium. É isso; obrigado por assistir.

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Research

JoVE Journal

Genetics

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