Desenvolvimento de Nanovesículas Envolvidas em Membrana por Células-Tronco Mesenquimatosas para Entrega Aprimorada de Genes

Neste protocolo, apresentamos um método para preparar nanovesículas derivadas de células-tronco mesenquimatos, que se assemelham a vesículas extracelulares e encapsulam AAVs para melhorar a entrega de genes. Chamamos essas nanovesículas contendo AAV de CME-AAVs. Comparados ao vetor emergente de entrega genética EV-AAV, OS CME-AVS oferecem maior flexibilidade nas fontes celulares e maior rendimento.

Para começar, remova o meio de cultura de um recipiente contendo células-tronco mesenquimatosas humanas com confluência de 70 a 90%. Usando um raspador de células, desprenda as células do prato de cultura e transfira-as para um tubo cônico contendo PBS. Centrifuge as células coletadas a 300g por cinco minutos a quatro graus Celsius para granular as células.

Depois, lave o pellet celular duas vezes com PBS e centrifuge novamente. Ressuspenda o último pellet celular em PBS suplementado com um coquetel inibidor de protease. Depois, submeter a suspensão celular a três ciclos de congelamento-descongelamento para desestabilizar a membrana plasmática e gerar um lisado bruto.

Usando uma pipeta, homogeneize o lisado completamente. Depois, centrifuge a 1.000g por 20 minutos a quatro graus Celsius para remover detritos celulares. Transfira o sobrenadante para um novo tubo.

Centrífuga a 18.000g por uma hora a quatro graus Celsius para pelletar a fração de membrana. Descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet de membrana em PBS para obter a fração bruta de membrana das células-tronco mesenquimatos. Agora, homogeneize a suspensão de membrana passando-a sequencialmente por seringas equipadas com agulhas de calibre 20 a 27.

Determine a concentração de proteína da suspensão de membrana homogeneizada usando um ensaio de ácido bicinconínico. Aliquota a suspensão e armazene a menos 80 graus Celsius até que seja necessário. Rehomogeneize a suspensão usando uma seringa calibre 27 após cada ciclo de descongelamento.

Misture a suspensão de membrana preparada com vírus adeno-associado, ou AAVs, na proporção de 150 microgramas de proteína por um vezes 10 vezes a potência de 10 cópias genômicas. Incube a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos com uma sacudida suave. Carregue a membrana e a mistura de vírus em um mini extrusor equipado com uma membrana de policarbonato de 400 nanômetros.

Passe a mistura pelo extrusor 20 vezes para promover o encapsulamento. Substitua a membrana de 400 nanômetros por uma de 200 nanômetros e repita a extrusão. Colete o vírus encapsulado em suspensão do processo, junto com vírus não encapsulado e vesículas vazias.

Agrupe vários lotes, se necessário, e proceda imediatamente para a purificação. Dilua a solução original de iodixanol com 10x PBS e água estéril deionizada para preparar soluções de 40 e 25%. Usando uma pipeta, adicione um mililitro de iodixanol a 40% no fundo de um tubo ultratransparente de parede fina aberta com topo aberto de 13,2 mililitros.

Depois, sobreponha três mililitros de iodixanol a 25% acima da camada de 40% para formar um gradiente descontínuo. Sobreposição suavemente sete mililitros da suspensão processada sobre o topo do gradiente. Equilibre os tubos e coloque-os em um rotor de ultracentrífuga com balde oscilante.

Centrifugar a 150.000g por três horas a quatro graus Celsius, usando aceleração rápida e desaceleração lenta. Depois, remova cuidadosamente os tubos sem perturbar o gradiente. Colete frações de um mililitro de cima para baixo em tubos microcentrífugas de 1,5 mililitro rotulados.

Mantenha todas as frações no gelo. Agora, identifique e agrupe frações sete e oito contendo CME-AAVs purificados em um novo tubo ultracentrífuga aberto. Compense o volume para 11 mililitros com PBS.

Depois, misture delicadamente com uma pipeta de um mililitro. Usando aceleração e desaceleração rápidas, centrifuge as frações acumuladas a 150.000g por três horas a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante com cuidado.

Ressuspenda o pellet em 50 a 200 microlitros de PBS estéril, dependendo da concentração desejada. Aliquot, a preparação purificada. Depois, armazene a 80 graus Celsius até novo uso.

Prepare soluções funcionais de vírus encapsulados e vírus de controle em PBS estéril. Adicione cópias iguais do genoma do vírus encapsulado ou vírus de controle diretamente ao meio de cultivo em cada poço. Inclua poços de controle negativos com volume equivalente de PBS ou partículas virais vazias.

Gire suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme e incube por 24 a 72 horas, dependendo do desenho experimental. Em seguida, aspire suavemente o meio de cultura. Lave as células duas vezes com PBS sem deslocá-las.

Núcleos de stain com Hoechst 33342 conforme as instruções do fabricante. Realize imagens de fluorescência de células vivas usando um microscópio de fluorescência invertida com conjuntos de filtros apropriados para proteína fluorescente verde aprimorada e Hoechst. Selecione objetivos 10x ou 20x para quantificação e objetivos 63x para imagens de alta resolução, se necessário.

Adquira pelo menos cinco campos de visão por poço, usando parâmetros de imagem idênticos. Salve todas as imagens em formatos raw e em tons de cinza para análise quantitativa. A microscopia eletrônica de transmissão revelou que as CME-AAVs apresentavam dimensões de tamanho e estruturas de membrana semelhantes às vesículas extracelulares.

Os marcadores da membrana das células-tronco mesenquimatos, CD73 e CD90, foram detectados na CME-AAV por análise por Western blot. As três principais proteínas da capsídea viral adeno-associadas, VP1, VP2 e VP3, foram identificadas na CME-AAV pelo SDS-PAGE. A análise do NanoSight mostrou que CME-AAV9.

O EGFP tinha um diâmetro médio de 128,6 nanômetros e uma concentração total de partículas de 1,32 vezes 10, com a potência de 10 partículas por mililitro. A microscopia de fluorescência demonstrou que a CME-AAV9. O EGFP produziu um nível marcadamente maior de expressão aprimorada de proteínas fluorescentes verdes em células HEK293T.

O vírus envolto em membrana alcançou expressão gênica aproximadamente 2,5 vezes maior, sugerindo maior absorção celular e potencial aumento do tráfego intracelular. Imagens bioluminescentes in vivo mostraram que o fígado apresentou o sinal luminescente mais forte após a administração da CME-AAV. A análise quantitativa das regiões hepáticas revelou que a administração de CME-AAV resultou em níveis significativamente mais altos de expressão gênica.

Esses protocolos descrevem etapas para obter AAVs purificados com membrana celular, ou CME-AAV, por meio de extrusão e ultracentrifugação por gradiente de densidade. Dois fatores-chave exigem consideração cuidadosa: pré-processamento de fragmentos celulares para extrusão e otimização da relação de mistura fragmento-AAV de membrana para controlar a relação partícula-AAV para genoma. Estudos futuros podem explorar ainda mais o recinto da membrana celular para aprimorar a proteção imune e as propriedades funcionais da superfície, otimizando o CME-AAV como uma plataforma versátil para a entrega de AAV.