Estabelecimento de Culturas Primárias Enriquecidas em Zona a partir do córtex adrenal do camundongo

Minha pesquisa investigou a regulação do microambiente adrenal, focando na sinalização ACM e Wnt na diferenciação da zona glomerulosa e zona fasciculada, além do desenvolvimento tumoral. Os métodos existentes não conseguem distinguir claramente as zonas adrenais. Esse protocolo enriquece ZG e ZF, possibilitando o estudo de diferentes tipos celulares.

Esse protocolo pode ser aplicado para estudar a adrenofisiologia em ZG e ZF, incluindo zonação e diferenciação celular. Para isolar a glândula adrenal para cultura primária enriquecida em zonas, utilize-se de 10 a 15 camundongos machos adultos, com aproximadamente seis a sete semanas de idade. Após a eutanasia do rato, coloque-o em posição de decúbito dorsal sobre uma superfície plana e estéril e desinfete o pelo animal com álcool a 70%.

Usando tesoura, faça uma incisão inicial na região inguinal do abdômen. Estenda a incisão lateralmente em direção ao tórax em ambos os lados para expor o peritônio. Retraia a pele com cuidado.

Em seguida, retrai suavemente os músculos abdominais para expor a cavidade, evitando danos nos vasos sanguíneos para manter uma visualização clara das glândulas supra-renais. Troque os instrumentos cirúrgicos para minimizar a contaminação microbiana. Identificar a glândula adrenal esquerda localizada medialmente e acima do rim esquerdo no retroperitônio, com formato oval e coloração rosa, cercada por tecido adiposo branco.

Usando pinças contundentes, desloque cuidadosamente os órgãos adjacentes para melhorar a visualização da glândula adrenal. Usando tesoura, remova a maior parte do tecido adiposo ao redor com cortes curtos e controlados para isolar a glândula adrenal. Evite agarrar diretamente a glândula adrenal para evitar danos à sua cápsula.

Imediatamente coloque a glândula adrenal isolada em um prato de cultura P60 contendo 10 mililitros de meio DMEM F-12 pré-aquecido até que todas as amostras sejam coletadas. Em seguida, identifique a glândula adrenal direita localizada lateral e superior ao rim direito no retroperitônio, observando que sua proximidade ao fígado, ao cólon ascendente e aos vasos sanguíneos próximos pode dificultar a visualização. Manuseie cuidadosamente as veias renais e as artérias renais para evitar cortes acidentais e sangramentos.

Após isolar a glândula adrenal direita, usando o mesmo procedimento da glândula adrenal esquerda, coloque ambas as glândulas juntas no mesmo prato. Limpe o recipiente de cultura com álcool 70% antes de transferir as glândulas para a capela de fluxo laminar. Depois, lave as glândulas suprarrenais três vezes, transferindo-as sequencialmente por recipientes com PBS a 25 graus Celsius.

Após a lavagem final, colete e mantenha os tecidos separados em um quarto recipiente contendo DMEM pré-aquecido para preservar a viabilidade durante a preparação de múltiplas glândulas. Transfira as glândulas adrenais para um papel filtro para dissecação. Em seguida, usando pinças finas, agarre a glândula adrenal pelo tecido adiposo aderente.

Dissece cuidadosamente a gordura no papel filtro com movimentos controlados para evitar danificar a cápsula. Certifique-se de que a glândula esteja lisa e intacta, livre de excesso de tecido adiposo e conjuntivo. Transfira cuidadosamente as glândulas suprarrenais para um papel de filtro novo para facilitar uma microdissecação precisa.

Usando pinças finas, belisque suavemente a cápsula da glândula adrenal. Usando uma lâmina de bisturi, faça uma incisão radial na glândula sem cortar completamente o tecido. Aplique uma leve pressão mecânica para expulsar o conteúdo interno do córtex para fora através da incisão.

Expor o material glandular interno mantendo a cápsula e a zona glomerulosa conectadas à ponta da pinça. Identifique o material glandular interno expulso como a zona fasciculada e a medula. Inicie a digestão enzimática somente após o processamento de todas as glândulas, para garantir a separação mecânica adequada das zonas externa e interna.

Após a centrifugação, ressuspenda as células coletadas no meio de cultura. Após estabelecer a cultura de células adrenais, realize-se a caracterização molecular das células cultivadas utilizando análise de expressão gênica e imunocoloração. Culturas primárias de células adrenais foram estabelecidas com sucesso a partir da fração externa enriquecida para células zonaglomerulosis e da fração interna enriquecida para células zona fasciculada.

O modelo de camundongo com traçado de linhagem permitiu a visualização da expressão específica de mGFP da zona glomerulosa, impulsionada pelo promotor Cyp11b2. A expressão de mGFP foi predominantemente observada em culturas enriquecidas com zonaglomerulosa, enquanto culturas enriquecidas com zona fasciculata expressavam principalmente mTomato. Níveis mais altos de expressão relativa de Cyp11b2, Dab2 e Sonic hedgehog foram observados em culturas de fração externa em comparação com culturas de fração interna.

Culturas de fração interna apresentaram maior expressão relativa de Cyp11b1 e Akr1b7 em comparação com as culturas de fração externa. A secreção de aldosterona foi maior em culturas enriquecidas com zonaglomerulosa do que em culturas enriquecidas com zona fasciculata. Em culturas de frações externas, a secreção de aldosterona aumentou ainda mais após estimulação com angiotensina II, potássio e hormônio adrenocorticotrópico.

A secreção de corticosterona foi maior em culturas enriquecidas com zona fasciculata em comparação com culturas enriquecidas com zona glomerulosa. Culturas enriquecidas com zona fasciculata mostraram aumento da secreção de corticosterona em resposta à estimulação do hormônio adrenocorticotrópico e forskolina. Esse protocolo possibilita o estudo da fisiologia e diferenciação específicas de zonas, incluindo produção de hormônios, via de sinalização e matriz extracelular.

Estudos futuros podem explorar a zonação e diferenciação adrenal, e o uso dessas células para construir um modelo 3D e estudar interações com MEC.