Eletroporação única célula in vivo dentro do cérebro intacto desenvolvimento

A eletroporação de célula única é uma técnica especializada que permite a entrega de DNA ou outras macromoléculas em células individuais dentro de um tecido intacto, inclusive em preparações in vivo quando combinada com técnicas avançadas de imagem in vivo. A eletroporação de célula única com marcadores fluorescentes permite a visualização direta da morfologia celular, crescimento celular e eventos intercelulares em escalas de tempo que variam de segundos a dias. Neste vídeo, detalhamos o procedimento para eletroporação de célula única de um corante fluorescente ou DNA plasmidial em neurônios dentro do cérebro intacto da girina XUS, e mostramos exemplos de imagem em tempo real de neurônios marcados com fluorescência.

Oh, olá. Meu nome é Eth Haa e trabalho no laboratório do Dr. Kurt Haass no Centro de Pesquisa Cerebral da Universidade da Colúmbia Britânica. Hoje, demonstrarei como realizar a eletroporação direcionada em única célula de neurônios dentro do cérebro intacto da rã-tadpole albina XUS Lavis.

A vantagem distinta dessa técnica é que manipulações experimentais podem ser realizadas em células individuais mantendo o tecido circundante inalterado, permitindo assim distinguir efeitos autônomos celulares daqueles resultantes de tratamentos globais. O primeiro passo envolve a fabricação de micropipetas com diâmetro da ponta e ângulo de afunilamento apropriados, seguido pelo carregamento do material de transferência na micropipeta. Em seguida, os pools de TA devem ser anestesiados e transferidos para a câmara de registro, seguidos pela inserção da micropipeta no cérebro e aplicação de uma série de pulsos de tensão.

Por fim, os neurônios ativados são visualizados usando microscopia de dois fótons. Eles mostrarão esta técnica em girinos. A ativação de célula única pode ser utilizada em outros sistemas modelo, bem como em preparações ex vivo.

Com isso em mente, vamos começar. A eletroporação em célula única direciona-se a uma célula individual por meio de um eletrodo de micropipeta de vidro puxada, que restringe o campo elétrico a uma única célula em contato com a ponta da pipeta. A geometria física da ponta da pipeta é uma característica crítica que afeta diretamente o sucesso da técnica.

Utiliza-se um puxador de microeletrodos modelo P 97 para produzir micropipetas a partir de vidro borossilicato com diâmetro externo de 1,5 milímetros e diâmetro interno de 0,75 milímetros, contendo um filamento interno para facilitar o preenchimento da ponta sem bolhas de ar. As pontas de pipeta que se mostraram mais eficazes para eletroporação em célula única são aquelas com diâmetro de ponta entre 0,5 e um mícron e ângulos de afunilamento superiores a 10 graus. Após puxar uma micropipeta de vidro, o material em solução pode ser carregado na pipeta por preenchimento reverso ou com o uso de uma seringa de carga.

Para esta demonstração, vamos marcar fluorescentemente neurônios individuais com um corante fluorescente visto aqui ou com um plasmídeo codificador. As soluções de proteína verde fluorescente GFP devem ser centrifugadas brevemente em alta velocidade para reduzir a quantidade de detritos particulados que entram na pipeta. Como isso aumentará as chances de obstrução da ponta para usuários novos, recomenda-se começar com corantes fluorescentes, já que podem ser facilmente visualizados em fluorescência epiluminescente.

Isso permite a visualização da ponta dentro da amostra e fornece um feedback direto sobre se o equipamento foi configurado corretamente e se a ponta da pipeta é apropriada. Bom trabalho. Agora que preparamos a micropipeta, podemos passar para a realização do procedimento de eletroporação em célula única.

O equipamento elétrico necessário para esta técnica inclui um estimulador e um osciloscópio, além de um suporte para pipeta equipado com um fio de prata a ser inserido na pipeta. Aqui, estamos utilizando um Axon Instruments Axon Separator 800 A, porém estimuladores comuns, como o Grass SD9, também podem ser usados. O separador Axon é conectado ao estágio de cabeça, que faz a interface entre o separador Axon e o eletrodo de fio de prata.

O terra externo do girino é simplesmente um fio de prata que mantém um contato eletrônico com o girino. Durante a eletroporação, o estágio da cabeça, o cabo de terra e o terra externo do girino são conectados à entrada do osciloscópio. Uma vez que o equipamento elétrico tenha sido montado, a pipeta pode ser colocada no suporte de pipeta.

O suporte para pipeta deve ser montado em um micromanipulador de três eixos que permita movimentos finos. A eletroporação de célula única exige um microscópio com uma boa distância de trabalho. Uma vez que isso proporciona mais espaço para manobrar e permite que a pipeta seja inserida em um ângulo de aproximadamente 30 a 45 graus.

Uma vez que o equipamento tenha sido corretamente conectado, podemos iniciar o procedimento de eletroporação em célula única. Primeiramente, os girinos são anestesiados por imersão em MS 222 a 0,02%, momento em que os girinos geralmente estão completamente anestesiados. Após aproximadamente cinco minutos, um único girino é transferido para a câmara de eletroporação.

Usando uma pipeta de transferência de plástico, a câmara pode ser facilmente fabricada em laboratório mediante a escultura de uma cavidade em formato de girino em um pequeno bloco de silicone e a inserção de um fio de prata para aterramento, de modo que este entre em contato com a pele do girino quando estiver na câmara. Em seguida, utilizando um pincel para posicionar o girino, assegura-se de que ele fique com o lado dorsal voltado para cima. Em seguida, a micropipeta é abaixada até entrar em contato com a pele diretamente adjacente à região de interesse.

A continuação da descida da pipeta inicialmente causará uma reentrância na pele e depois penetrará no tecido subjacente. Aqui estou visando o túbulo óptico do cérebro do polo tidal. Estou especificamente mirando na região da camada de corpos celulares.

Se você estiver usando um xi, é possível monitorar a resistência da pipeta no tecido. Geralmente, a resistência varia de 10 a cerca de 40. Megaohms funcionam bem.

A resistência da pipeta é um bom indicador de que o diâmetro da ponta é muito pequeno ou de que a ponta está entupida, casos em que a resistência será alta. Por outro lado, se o diâmetro da ponta for muito grande ou se a ponta estiver quebrada, a resistência da pipeta será baixa. Embora a resistência absoluta, a pipeta não possa ser medida ao se utilizar um estimulador convencional.

A leitura do osciloscópio é uma medida indireta da resistência da pipeta para corantes de dextrana fluorescente. O estímulo consiste em uma série de pulsos quadrados positivos de 10 milissegundos aplicados a uma frequência de 300 hertz. Cada pulso individual tem duração de 300 microssegundos e é entregue com uma voltagem de 50 volts.

Usando essas configurações, o corante fluorescente é expelido pela ponta, como pode ser observado após a aplicação de um estímulo após a eletroporação. Em um local, a pipeta é recolhida e o processo é repetido em diferentes locais dentro do tecido para melhorar o rendimento. Enquanto uma série de pulsos de tensão está sendo aplicada, deve-se monitorar a amplitude dos pulsos resultantes no osciloscópio e ajustar a amplitude entre um e 1,5 microampères, se necessário.

Se a amplitude do pulso permanecer baixa mesmo após aumentar substancialmente a tensão ou diminuir durante o procedimento, isso sugere fortemente que a ponta está entupida ou que o diâmetro da ponta é muito pequeno. Isso pode ser bastante frustrante quando ocorre. Por outro lado, se a amplitude ainda estiver alta após reduzir substancialmente a tensão aplicada ou aumentar durante o procedimento, isso indica fortemente que a ponta é muito larga, que está quebrada ou que as pontas se quebram.

Fico muito emocionado e triste com frequência. Como mencionado anteriormente, a vantagem do uso de corantes fluorescentes é que é possível verificar imediatamente se as células individuais foram eletroporadas utilizando os parâmetros de estímulo fornecidos. Se as células parecerem muito fracas ou nenhuma célula estiver marcada, deve-se começar aumentando gradualmente cada parâmetro de estímulo independentemente até que as células marcadas pareçam fortemente fluorescentes como esta; ver células bem marcadas me deixa feliz.

Por outro lado, se diversas células parecessem estar marcadas, diminuir-se-iam gradualmente os parâmetros do estímulo até que parecesse que uma única célula estava intensamente marcada, como esta. Observar células intensamente marcadas é realmente satisfatório. No caso do DNA plasmidial, as séries de pulsos utilizadas são pulsos negativos com duração de um milissegundo, entregues a 300 hertz, e a duração da série é de 500 milissegundos.

Após a eletroporação, os girinos TA são colocados em solução de criação fresca, onde se recuperam rapidamente da anestesia. Normalmente, após eletroporar de 50 a cem girinos TA, podemos prosseguir com a triagem, o que mostrarei a seguir. Antes de iniciar experimentos de imageamento, é útil realizar rapidamente a triagem dos girinos eletroporados utilizando um microscópio de fluorescência epifluorescente invertido.

Para determinar quais girinos contêm neurônios adequados para imagem, os girinos são anestesiados e então colocados em uma câmara de charuto e cobertos com lamínula. Os cérebros individuais dos girinos são então rapidamente examinados sob luz epi-fluorescente para verificar a presença de neurônios individualmente marcados com fluorescência. Observe que a exposição excessiva à luz epi-fluorescente resultará em fototoxicidade, o que pode matar a célula marcada. Portanto, procure minimizar o tempo de exposição das células à luz fluorescente.

No caso dos corantes de dextrana, a triagem pode ser realizada já 30 minutos após a eletroporação. No entanto, observamos que intervalos mais longos estão associados a níveis de fluorescência de fundo mais baixos. No caso do plasmídeo, a triagem de DNA é tipicamente realizada pelo menos 12 horas após a eletroporação.

Utilizamos rotineiramente a eletroporação de célula única para rotular fluorescentemente neurônios dentro do tecto óptico de girinos. Nosso microscópio de dois fótons é personalizado, construído a partir de um microscópio confocal Olympus FV 300 e uma fonte de luz a laser Chameleon XP. Normalmente utilizamos um comprimento de onda de 910 nanômetros para imagens da força verde de fluorescência.

Uma vez que encontramos um girino com um único neurônio AL marcado e o posicionamos em nosso equipamento de dois fótons, prosseguimos com a aquisição de imagens com lapso de tempo para registrar os neurônios táteis em diferentes intervalos temporais. Isso nos permite observar os padrões dinâmicos de crescimento das arborizações dendríticas das células AL. Aqui vemos um exemplo de um neurônio que expressa GFP e que foi marcado utilizando eletroporação em uma única célula.

Esta imagem foi capturada utilizando microscopia de dois fótons in vivo com o objetivo de quantificar o crescimento neuronal. Reconstruções tridimensionais esqueletizadas de cada imagem neuronal são tipicamente geradas. A imagem em lapso de tempo com intervalos prolongados fornece informações sobre as consequências de longo prazo de uma manipulação experimental.

Aqui observamos um neurônio imaturo que expressa GFP e que foi imagiado diariamente ao longo de quatro dias, abrangendo o desenvolvimento de sua arborização dendrítica. Essas imagens foram capturadas utilizando microscopia de dois fótons e são apresentadas como projeções Z. A aquisição rápida de imagens em lapso de tempo nos permite observar a natureza de processos mais dinâmicos do crescimento neuronal, incluindo a formação e retração de filopódios dendríticos.

Este vídeo mostra um neurônio relativamente maduro que expressa GFP e que foi capturado em três dimensões a cada dois minutos durante uma hora. Este é um exemplo de um neurônio imaturo que expressa GFP e que foi capturado a cada cinco minutos ao longo de uma hora. Neurônios mais jovens são altamente dinâmicos, mostrando crescimento extenso de ramificações e retração de ramificações.

Uma visão ampliada deste neurônio que expressa GFP mostra a constante adição e retração de filopódios dendríticos, característica típica de neurônios em desenvolvimento neste sistema. A transparência do girino albino e a acessibilidade de seu cérebro tornam este sistema modelo ideal para visualizar o crescimento neuronal e eventos intracelulares dentro de um organismo vivo. A eletroporação em única célula nos permite visualizar o crescimento de um único neurônio e realizar manipulações autônomas celulares dentro de um cérebro de resto inalterado.

Portanto, acabamos de mostrar como realizar a eletroporação de célula única em tatos de zap lavis, embora aqui estejamos focados na eletroporação em tatos TA. Esta técnica já foi utilizada em outros organismos e também em fatias do hipocampo e culturas de células dissociadas. Ao realizar este procedimento, é importante garantir que você modifique constantemente as pontas de pipeta e os parâmetros de estimulação para manter um alto rendimento.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.