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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Básica e Aplicada de Guangdong para Pesquisa (2023A1515011278), pelo Projeto Autofinanciado do Instituto de Pesquisa em Biotecnologia da Província de Guangdong (GDBRI-ZL202602) e pelo Programa de Intercâmbio e Cooperação Acadêmica China-Canadá sobre Modelos e Patogênese de Doenças Cardiovasculares (MS202500058).

<ol>
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Os autores declaram que não possuem interesses concorrentes.

Neste estudo, geramos um camundongo deficiente em Cracd projetado com CRISPR/Cas9 e estabelecemos um fluxo de trabalho para fenotipá-lo após IAM utilizando ecocardiografia convencional, imagem de deformação por rastreamento de speckle e histologia. O protocolo gerou animais knockout com perda confirmada da proteína CRACD. Camundongos deficientes em Cracd apresentaram menor dilatação ventricular, melhor FE e fibrose reduzida em comparação aos controles WT após IAM, confirmando a utilidade do modelo para o estudo do remodelamento cardíaco.
O sucesso deste modelo depende de várias etapas críticas. O planejamento do gRNA e sua validação in vitro afetam diretamente a eficiência da edição em zigotos23. Utilizamos o CRISPick ou o Benchling para selecionar gRNAs com pontuações CRISPRater ≥ 0,5 e, em seguida, testamos a eficiência de clivagem com um ensaio in vitro de Cas9/gRNA. Apenas gRNAs que atinjam clivagem > 50% são microinjetados. A ligadura adequada da ADA também é igualmente crucial: o fio 7‑0 deve passar a 2–3 mm da origem da ADA com uma profundidade de 0,5–1 mm para evitar perfurar o ventrículo direito (muito profundo) ou não obstruir o vaso (muito superficial); o embranquecimento imediato da parede anterior confirma a obstrução. O controle da frequência cardíaca durante a ecocardiografia também é essencial24; manter a frequência entre 450–550 bpm mediante ajuste da concentração de isoflurano (geralmente 1–2%) melhora a reprodutibilidade das medidas convencionais e de deformação. Por fim, para a análise de rastreamento de padrão de ruído (speckle-tracking), a avaliação visual da malha codificada por cores é essencial25. A malha deve seguir os limites do miocárdio sem movimentos abruptos; caso contrário, é necessária correção manual; se a qualidade permanecer insatisfatória após três tentativas, o camundongo é excluído.
Mesmo quando o protocolo é seguido meticulosamente, certas dificuldades técnicas podem surgir. A solução sistemática de problemas pode resolver a maioria delas. Taxas baixas de transmissão germinativa (abaixo de 10%) geralmente indicam má integração do oligonucleotídeo doador ou atividade fraca do gRNA26. Consequentemente, aumentar o oligo doador para 20 ng/µL, estender os braços de homologia para 120–200 pb e reavaliar a clivagem do gRNA (&#62; 50%) pode melhorar a transmissão. Alta mortalidade pós-IM (acima de 30%) frequentemente resulta de pneumotórax, hemorragia e grande infarto27. Assim, manter os camundongos com oxigênio contínuo até despertarem e usar uma placa aquecida para manter a temperatura corporal reduz significativamente as taxas de mortalidade. Se a parede anterior não ficar pálida após a ligadura, provavelmente a artéria descendente anterior (ADA) foi mal identificada ou o ponto está muito superficial. Nesse caso, relocar a ADA (um vaso diagonal vermelho brilhante) e passar novamente a agulha a uma profundidade de 0,5–1 mm, às vezes com auxílio de um microscópio estereoscópico, resolve esse problema. Para qualidade ruim no rastreamento de speckle, baixa taxa de quadros, bordas desfocadas ou artefatos de movimento são as causas mais comuns28. Assim sendo, aumentar a taxa de quadros, ajustar com precisão o ganho, corrigir manualmente o traçado endocárdico e descartar ciclos com arritmias ajudam a resolver o problema.
Além dessas considerações operacionais, o método apresenta limitações claras. O knockout de Cracd é global, de modo que CRACD está ausente em todos os tecidos. Consequentemente, a proteção observada não pode ser atribuída exclusivamente aos cardiomiócitos, já que contribuições sistêmicas também podem desempenhar um papel. Seria necessário um knockout condicional para separar os papéis específicos a cada tipo celular. Outra limitação é o único ponto temporal no dia 7; não se observa nada sobre remodelação crônica. Portanto, pontos temporais posteriores (4 ou 8 semanas) devem ser adicionados para estudos de longo prazo. A reprodutibilidade também é afetada pela dependência da qualidade da imagem: nem todo sistema de ultrassom consegue fornecer bordas endocárdicas nítidas, e a experiência do operador é relevante. Assim, recomenda-se que uma pessoa profissionalmente treinada realize todas as cirurgias e medições.
Diante dessas limitações, é útil comparar nossa abordagem com estratégias alternativas para estudar a função gênica no remodelamento pós-IM. A manipulação genética mediada por AAV e oligonucleotídeos antisense (ASOs) são duas alternativas comuns29,30. O AAV9 pode promover superexpressão ou silenciamento transitórios e específicos para o coração sem a necessidade de cruzamento, mas suas limitações de empacotamento (~4,7 kb), eficiência variável de transdução e efeitos fora do alvo são desvantagens31. Em contraste, nosso modelo de interrupção por CRISPR/Cas9 oferece perda permanente e completa da função, o que é vantajoso para estudos de longo prazo. Os ASOs proporcionam silenciamento reversível e dependente de dose, com início rápido, tornando-os adequados para intervenções agudas; no entanto, exigem administração repetida e não possuem especificidade tecidual32. Portanto, a interrupção constitutiva descrita aqui é a mais indicada para descobertas iniciais e fenotipagem crônica.
Por fim, o protocolo pode ser ampliado para além do CRACD. O mesmo fluxo de trabalho — geração de camundongos knockout por CRISPR/Cas9 combinada com ecocardiografia, imagem de deformação e histologia — pode avaliar qualquer gene candidato no remodelamento pós-IM. A estrutura de fenotipagem também se adapta a outros modelos de doenças cardiovasculares, como constrição aórtica transversa (sobrecarga de pressão) ou lesão por isquemia-reperfusão. Além disso, as amostras de tecido obtidas com este protocolo podem ser utilizadas em análises de multi-ômicas (transcriptômica, proteômica, metabolômica) para revelar mecanismos moleculares. O modelo deficiente em Cracd pode servir como uma ferramenta para testes de fármacos: compostos suspeitos de agir por meio da via CRACD podem ser avaliados. Assim, este protocolo fornece uma plataforma adaptável a uma ampla gama de estudos mecanísticos e translacionais na pesquisa cardiovascular.

O infarto do miocárdio (IM) continua sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo, contribuindo significativamente para a sobrecarga da saúde cardiovascular global.1O prognóstico a longo prazo após infarto do miocárdio é determinado principalmente pelo processo de remodelação do ventrículo esquerdo (VE).2, que envolve dilatação ventricular, afinamento da parede e fibrose intersticial3,4, que são fatores-chave na progressão para insuficiência cardíaca (IC). A incidência global de IC resultante da remodelação cardíaca pós-infarto do miocárdio agrava ainda mais o ônus da doença cardiovascular5Apesar dessas observações clínicas bem estabelecidas, faltam estudos sistemáticos que utilizem modelos in vivo sensíveis e reprodutíveis para avaliar o papel de genes específicos no remodelamento pós-IM. Atualmente, nenhum protocolo combina um modelo de nocaute engenharizado por CRISPR/Cas9 com imagem avançada de deformação para avaliar um regulador do citoesqueleto como o CRACD. Assim, é urgentemente necessária uma metodologia que permita manipulação genética precisa e fenotipagem cardíaca de alta resolução.
A proteína reguladora da inibição da polimerização da actina (CRACD), também conhecida como KIAA1211, é um regulador da polimerização da actina predominantemente localizado no citosol que desempenha um papel crítico na dinâmica do citoesqueleto6. Ela regula positivamente a polimerização da actina ao se ligar às proteínas de capeamento da actina (CAPZA1, CAPZA2, CAPZB) e impedir que estas se liguem às extremidades pontiagudas dos filamentos de actina7. Em tecidos epiteliais, a CRACD desempenha um papel essencial na manutenção da morfologia celular e na transdução de sinais, preservando a integridade do citoesqueleto de actina8,9. Em células tumorais, sua desregulação está associada ao aumento da metástase e proliferação celular6,10. O papel da CRACD no coração ainda não foi completamente compreendido. Estudos de transcriptoma cardíaco e intervenções experimentais mostram que a expressão do gene Cracd responde ao estresse patológico e pode regular genes relacionados à dinâmica citoesquelética durante o remodelamento ventricular9,11. Além disso, sua proteína inibidora, CapZ, está fortemente associada à patologia cardíaca: a fosforilação da CapZ regula o crescimento dos miofilamentos durante a hipertrofia induzida pela fenilefrina12. Nossa pesquisa inicial indica que a diminuição moderada da CRACD confere proteção contra danos miocárdicos e preserva a contratilidade dos miofilamentos após isquemia aguda13. Esses achados levantam a possibilidade de que a CRACD desempenhe um papel no remodelamento ventricular maladaptativo após infarto do miocárdio (MI). No entanto, estudos sistemáticos in vivo de perda de função, que testem se a deficiência de Cracd modula o remodelamento pós-MI, ainda são escassos, principalmente devido à ausência de um protocolo validado, passo a passo, para gerar e fenotipar um camundongo deficiente em Cracd sob estresse isquêmico.
Várias abordagens existem para gerar camundongos knockout constitutivos. A recombinação homóloga tradicional em células-tronco embrionárias (ES) é precisa, mas cara e demorada (12–18 meses), além de limitada a certas linhagens de camundongos14. A mutagênese com ENU (N-etil-N-nitrosoureia) produz mutações pontuais aleatórias, exigindo retrocruzamentos extensivos e sequenciamento15. Em contraste, o CRISPR/Cas9 oferece vantagens práticas distintas para este estudo: (i) a injeção direta em zigotos reduz o tempo para 4–6 meses; (ii) permite a deleção de um grande fragmento genômico (3153 pb) para assegurar a perda completa da função; (iii) funciona diretamente na linhagem C57BL/6N, sem necessidade de conversão de linhagem; e (iv) evita a utilização de um marcador selecionável, minimizando interferências transcricionais não intencionais. Portanto, o CRISPR/Cas9 é a escolha mais eficiente para gerar uma linhagem deficiente em Cracd, adequada para fenotipagem cardiovascular de rotina. Essa tecnologia tem sido amplamente utilizada para realizar estudos precisos in vivo de perda de função16,17.
A imagem de deformação por rastreamento de speckle é uma técnica de pós-processamento que acompanha o movimento de speckles acústicos naturais no miocárdio quadro a quadro, permitindo o cálculo de parâmetros de deformação miocárdica, como deformação (mudança fracional no comprimento) e taxa de deformação (velocidade de deformação)18. Diferentemente da ecocardiografia em modo M convencional ou bidimensional, que fornece índices funcionais globais (fração de ejeção, encurtamento fracional, diâmetro interno do ventrículo esquerdo) e é relativamente insensível a anormalidades regionais do movimento da parede, a imagem de deformação pode quantificar a função contrátil segmentar. Isso é particularmente importante no período inicial após o infarto, quando a hipercinesia compensatória de segmentos não infartados pode preservar a fração de ejeção global apesar de disfunção regional significativa. O rastreamento de speckle oferece várias vantagens sobre os pontos finais padrão: fornece deformação segmentar e taxa de deformação, deslocamento e velocidade, detectando assim alterações subclínicas sutis19; pode identificar dessincronia e déficits contráteis precoces antes que ocorra remodelação irreversível; e investiga diretamente o subendocárdio, a camada mais vulnerável à isquemia20. Neste estudo, CRACD é um regulador do citoesqueleto que pode influenciar a contratilidade das miofibras em nível microscópico. Medidas baseadas na cavidade convencional podem facilmente deixar passar esses efeitos mecânicos locais. Assim, a integração da análise por rastreamento de speckle neste protocolo aumenta a capacidade de detectar efeitos protetores precoces da deficiência de Cracd. Portanto, integrar o rastreamento de speckle neste protocolo fornece uma ferramenta sensível e quantitativa para avaliar a remodelação pós-infarto, especialmente durante a primeira semana após o IAM, quando ocorrem dilatação precoce e disfunção contrátil21,22.
Este protocolo foi desenvolvido para pesquisadores que investigam o impacto funcional da deleção de um gene específico no remodelamento agudo (7 dias) pós-IM, utilizando uma combinação de camundongos knockout constitutivos e imagens de alta resolução. É adequado para estudos geradores de hipóteses em que a perda global do gene-alvo é aceitável e o principal desfecho são as alterações estruturais e funcionais sistólicas precoces. No entanto, várias limitações devem ser consideradas. Primeiro, o camundongo deficiente em Cracd é um knockout global; portanto, os efeitos cardioprotetores observados não podem ser atribuídos exclusivamente à perda de CRACD nos cardiomiócitos, já que contribuições sistêmicas também podem desempenhar um papel. Estudos futuros utilizando estratégias de knockout condicional serão necessários para obter deleção específica do coração. Segundo, o protocolo concentra-se em um único ponto temporal (dia 7) e não aborda o remodelamento crônico nem a progressão da IC. Estudos longitudinais além da fase aguda serão necessários. Terceiro, a análise por rastreamento de speckle exige imagens de alta qualidade (bordas endocárdicas bem definidas) e software dedicado, os quais podem não estar disponíveis em todas as instalações centrais. Apesar dessas limitações, o protocolo fornece uma plataforma robusta e reprodutível para a caracterização funcional inicial de genes envolvidos no remodelamento cardíaco pós-IM.
Este estudo teve como objetivo utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para gerar e validar um modelo de camundongo deficiente em Cracd (C57BL/6N-Cracdem1 (c.538-83 a c.3352+255 del)) para investigar o impacto da deficiência de Cracd no remodelamento cardíaco pós-IM e no movimento da parede ventricular. O infarto do miocárdio (IM) foi induzido em camundongos selvagens (WT, C57BL/6N) e em camundongos deficientes em Cracd, sendo realizadas avaliações abrangentes uma semana após o IM. As avaliações incluíram parâmetros ecocardiográficos convencionais, análise de deformação por rastreamento de padrão aleatório (speckle-tracking) e avaliação histopatológica. Concentramo-nos especificamente na fase inicial após o IM (dia 7) para captar os eventos iniciais de remodelamento e determinar se a deficiência de Cracd afeta a dilatação ventricular e a função sistólica durante a fase aguda do IM. Os resultados devem fornecer informações valiosas sobre o papel do CRACD na modulação do remodelamento cardíaco adverso após o infarto do miocárdio.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ACRISPR/Cas9&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de Cloreto de Trizma</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T2663</td><td>Utilizada para preparar o tampão de extração de DNA</td></tr><tr><td>Protease K</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>539480</td><td>Utilizada para digestão da cauda de camundongo</td></tr><tr><td>Green Taq Mix</td><td>Vazyme, China</td><td>P131</td><td>Utilizada para amplificação por PCR</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioFroxx, Germany</td><td>1110GR500</td><td>Utilizada para eletroforese em gel de DNA em concentração de 1&amp;ndash;2%</td></tr><tr><td>Marcador de DNA</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>SM0242</td><td>Utilizado como escada de DNA para determinação do tamanho dos produtos de PCR</td></tr><tr><td>Kit TIANamp de DNA Genômico</td><td>Tiangen Biotech, China</td><td>DP304</td><td>Utilizado para extração de DNA genômico a partir de tecido da cauda de camundongo</td></tr><tr><td>Kit de transcrição MEGAshortscript&amp;trade; T7</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>AM1354</td><td>Utilizado para transcrição in vitro de gRNA</td></tr><tr><td>Kit de purificação de RNA</td><td>Zymo Research, USA</td><td>R1016</td><td>Utilizado para purificação do gRNA transcrito</td></tr><tr><td>Kit de Triagem de sgRNA BeyoCRISPR&amp;trade;</td><td>Beyotime, China</td><td>D8412S</td><td>Utilizado para avaliação in vitro da atividade de clivagem do gRNA</td></tr><tr><td>Inibidor de RNase</td><td>NEB, USA</td><td>M0314</td><td>Utilizado para prevenir a degradação do RNA durante a transcrição in vitro</td></tr><tr><td>TaKaRa Taq</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>R001A</td><td>Utilizado para genotipagem por PCR do DNA da cauda de camundongo</td></tr><tr><td>Meio de Pré-incubação de Espermatozoides FERTIUP&amp;reg; para Camundongos: PM</td><td>Cosmo Bio, Japan</td><td>KYD-002-EX</td><td>Utilizado para capacitação espermática antes da fertilização in vitro</td></tr><tr><td>Kit T7 ARCA mRNA</td><td>NEB, USA</td><td>E2060</td><td>Utilizado para transcrição in vitro de mRNA de Cas9</td></tr><tr><td>Gonadotrofina de Soro de Égua Preñada</td><td>MCE, USA</td><td>9002-70-4</td><td>Utilizada para superovulação, administrada por injeção intraperitoneal</td></tr><tr><td>Gonadotrofina Coriônica Humana</td><td>ProSpec, Israel</td><td>HOR-250</td><td>Utilizada para indução da ovulação, administrada por injeção intraperitoneal</td></tr><tr><td>Água livre de RNase</td><td>Aladdin, China</td><td>R665526</td><td>Utilizada para dissolução de RNA e preparação de reações de PCR</td></tr><tr><td>Primer</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>/</td><td>Utilizados para genotipagem</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cirurgia&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isóflurano</td><td>RWD Life Science, China</td><td>R510-22-10</td><td>Utilizado para indução e manutenção da anestesia durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Creme depilatório</td><td>Veet, France</td><td>1000207</td><td>Aplicado na região torácica para remoção de pelos antes da cirurgia e ultrassonografia</td></tr><tr><td>Sutura 7-0</td><td>Lingqiao, China</td><td>LQ7022380206</td><td>Utilizada para ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD)</td></tr><tr><td>Sutura 4-0</td><td>Lingqiao, China</td><td>LQ4022380412</td><td>Utilizada para fechamento da incisão cutânea após a cirurgia</td></tr><tr><td>Ventilador anestésico</td><td>Harvard Apparatus, USA</td><td>Tabletop</td><td>Utilizado para administração de isóflurano e suporte respiratório</td></tr><tr><td>Ventilador para pequenos animais</td><td>Taimeng, China</td><td>HX-101E</td><td>Utilizado para fornecer ventilação com pressão positiva durante cirurgia torácica aberta</td></tr><tr><td>Almofada aquecida com temperatura constante</td><td>TigerGene, USA</td><td>TG-TP-GS</td><td>Utilizada para manter a temperatura corporal do camundongo durante a cirurgia e recuperação</td></tr><tr><td>Retrador de costelas</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>LN-18-4101</td><td>Utilizado para separar as costelas e expor o coração para ligadura da LAD</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>18-0551</td><td>Utilizada para fazer incisões na pele e cortar tecidos</td></tr><tr><td>Microsscópio estereoscópico</td><td>Nikon, Japan</td><td>SMZ 745</td><td>Utilizado para fornecer uma visão ampliada durante a cirurgia de ligadura da artéria LAD</td></tr><tr><td>Porta-agulha microscópico</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>18-2211</td><td>Utilizado para manipular a agulha fina de sutura 7-0 sob o microscópio</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Produtos químicos e reagentes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agentes acoplantes ultrassônicos</td><td>Tianjin Jinya Technology Development, China</td><td>TM-100</td><td>Aplicados no tórax para ecocardiografia, garantem contato adequado da sonda</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>V900894</td><td>Utilizado para fixação do tecido cardíaco após a coleta</td></tr><tr><td>Xilol</td><td>Macklin, China</td><td>1330-20-7</td><td>Utilizado para remoção de parafina e clareamento do tecido antes da coloração</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H3136</td><td>Corante nuclear, utilizado na coloração HE</td></tr><tr><td>Eosina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E4009</td><td>Corante citoplasmático, utilizado na coloração HE</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P3504</td><td>Utilizado na coloração de Masson para coloração do citoplasma</td></tr><tr><td>Ácido fosfomolíbdico</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>221856</td><td>Utilizado na coloração de Masson como mordente e para diferenciação</td></tr><tr><td>Solução de azul de anilina</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>415049</td><td>Utilizada na coloração de Masson para coloração de fibras colágenas (azul)</td></tr><tr><td>Anticorpo CRACD</td><td>Absea, China</td><td>KC-35356</td><td>Anticorpo primário para detecção da proteína CRACD por Western Blot, diluição 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorpo GAPDH</td><td>CST, USA</td><td>2118S</td><td>Anticorpo de controle de carga para Western Blot, diluição 1:5000</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Macklin, China</td><td>64-17-5</td><td>Utilizado para desidratação e preparação de reagentes (concentrações de 70%, 80%, 95%, 100%)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipamentos de laboratório&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Sorvall&amp;trade; Legend&amp;trade; Micro 17</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>75002541</td><td>Utilizada para preparação rotineira de amostras</td></tr><tr><td>Ciclador térmico de PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories, USA</td><td>1861096</td><td>Utilizado para amplificação de DNA</td></tr><tr><td>Sistema de microinjeção</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>5193000020</td><td>Utilizado para microinjeção de reagentes CRISPR/Cas9 em zigotos</td></tr><tr><td>Sistema de imagem Vevo 2100</td><td>VisualSonics, Canada</td><td>Vevo2100</td><td>Sistema de imagem de alta frequência para avaliação não invasiva da função e estrutura cardíaca após infarto</td></tr><tr><td>Microsscópio óptico</td><td>Leica, Germany</td><td>DM2500</td><td>Utilizado para observar cortes cardíacos corados com HE e Masson</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software de análise&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>/</td><td>Utilizado para análise de imagens, incluindo medição de área, quantificação de sinal e processamento de imagens histológicas (colorações HE e Masson)</td></tr><tr><td>VevoLab 3.2.0 / VevoStrain</td><td>VisualSonics, Canada</td><td>/</td><td>Software VevoLab para análise da função cardíaca; módulo VevoStrain utilizado para análise de deformação miocárdica para avaliação do desempenho cardíaco após infarto</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software, USA</td><td>/</td><td>Utilizado para análise estatística e preparação de gráficos</td></tr></tbody></table>

geração e caracterização fenotípica de um modelo de camundongo deficiente em cracd modificado por crispr/cas9 para estudos de remodelamento pós-infarto do miocárdio

Generation and Phenotypic Characterization of a CRISPR/Cas9-Engineered Cracd-Deficient Mouse Model for Post-Myocardial Infarction Remodeling Studies

Myocardial infarction (MI) remains a major cause of morbidity and mortality worldwide. This protocol describes a method for generating and characterizing a Cracd-deficient mouse line on the C57BL/6N background using CRISPR/Cas9 technology. Zygotes were co-injected with Cas9 mRNA, a gRNA construct, and a donor template designed to generate a 3153-bp genomic deletion. The edited allele was confirmed by PCR genotyping and Sanger sequencing. To assess the functional role of CRACD in post-MI remodeling, Cracd-deficient and wild-type (WT, C57BL/6N) mice underwent MI induced by permanent ligation of the left anterior descending coronary artery. On postoperative day 7, cardiac function and left ventricular wall motion were assessed using transthoracic echocardiography and speckle-tracking strain imaging, followed by histopathological evaluation with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Representative results showed that Cracd-deficient mice exhibited reduced ventricular dilation and preserved systolic function compared to WT controls. This protocol provides a reliable experimental platform for mechanistic studies of CRACD in cardiac pathophysiology.

Generation of Cracd-deficient mice
A heritable mouse model carrying a targeted deficiency in the Cracd gene was generated using CRISPR/Cas9-mediated genome editing (Figure 1A, Figure 1B). To distinguish WT, heterozygous, and homozygous genotypes, a multiplex PCR was performed using three primers (F1, F2, R1) in a single reaction. Mice homozygous for the deletion (Cracd&#8209;deficient) displayed only the 421 bp band, WT mice showed only the 357 bp band (Figure 1C). Sanger sequencing of genomic DNA from Cracd-deficient mice confirmed the predicted deletion in the target gene compared to WT controls (Figure 1D). Western blot analysis further demonstrated a marked reduction in CRACD protein levels in cardiac tissues from Cracd-deficient mice compared with WT controls (Figure 1E). Together, these data confirm the successful establishment of the Cracd-deficient mouse line.
Echocardiography
Echocardiographic assessment on postoperative day 7 revealed pronounced pathological cardiac remodeling in WT mice after MI (WT-MI) compared with sham-operated controls (Figure 2A). The WT-MI group showed thinning of the interventricular septum (Figure 2B, C), significant left ventricular (LV) dilation as reflected by increased LVIDd (Figure 2D) and LVIDs (Figure 2E), and thinning of the posterior wall (Figure 2F, G). These structural alterations were associated with a pronounced decline in global systolic function, as demonstrated by significantly reduced EF (Figure 2H) and FS (Figure 2I). In contrast, Cracd-deficient mice displayed a cardioprotective phenotype following MI. LV dilation was significantly attenuated, with notably smaller LVIDd and LVIDs compared with the WT-MI group. Furthermore, these mice exhibited improved systolic thickening of the posterior wall and maintained significantly higher EF and FS values. These findings indicate that Cracd deficiency effectively attenuates post-infarction LV dilation and preserves global systolic function.
Speckle-tracking strain analysis
Left ventricular myocardial motion and deformation were further evaluated by speckle&#8209;tracking echocardiography using only parasternal long&#8209;axis views (Figure 3A). To ensure data reliability, we defined pragmatic criteria for acceptable output based on the capabilities of the VevoStrain software. Acceptable strain analysis required: (i) a clear parasternal long&#8209;axis view with endocardial borders visible throughout the cardiac cycle; (ii) a stable heart rate between 450&#8211;550 bpm during acquisition; (iii) after automatic tracking, the colour&#8209;coded mesh (activated via &#8220;toggle contour/vector/orbit line/B mode&#8221;) had to closely follow the endocardial and epicardial borders without jerking or losing contact; and (iv) strain curves had to be smooth, show consistent waveforms across segments, and lack sudden spikes or arrhythmic interruptions. Suboptimal output&#8212;most commonly erratic strain curves or inability to visualise clear motion trajectories&#8212;led to manual adjustment of endocardial or epicardial contours and re&#8209;analysis. If quality remained poor after three attempts, the mouse was excluded. Using these criteria, we obtained reliable strain data in WT&#8209;MI mice and Cracd&#8209;deficient MI mice.
Compared with the sham group, WT-MI mice exhibited significantly reduced radial velocity (Figure 3B) and longitudinal velocity (Figure 3C), as well as radial displacement (Figure 3D) and longitudinal displacement (Figure 3E), indicating impaired global myocardial motion. The absolute values of radial strain (Figure 3F), radial strain rate (Figure 3G), longitudinal strain (Figure 3H), and longitudinal strain rate (Figure 3I) were also markedly decreased, reflecting severely compromised regional myocardial deformation and function. In contrast, Cracd-deficient mice showed significant improvement in these parameters. Compared with the WT-MI group, they displayed better recovery of radial and longitudinal displacements. Furthermore, radial velocity, radial strain, and radial strain rate were maintained at higher levels, while longitudinal strain and longitudinal strain rate were significantly improved. These results suggest that Cracd deficiency not only preserves global systolic function but also enhances regional LV myocardial deformation after MI.
The speckle&#8209;tracking imaging analysis also included visualization of segmental strain distribution and cardiac motion trajectories. Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images with segmented six regions (BA, MA, AA, AP, MP, BP) and color gradient mapping are displayed in Figure 4A. Cardiac motion trajectories, time&#8209;to&#8209;peak curves for radial and longitudinal strain, parametric distribution maps of strain synchrony, and three&#8209;dimensional reconstructions are presented in Figure 4B. These data further support the functional improvements observed in Cracd&#8209;deficient mice.
Histological examination
To assess the protective effect of Cracd deficiency against MI, histopathological examination was performed on heart sections from WT and Cracd-deficient mice at 7 days post-MI using H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Whole&#8209;heart longitudinal sections are shown in Figure 5A, with quantitative analysis of infarct size and collagen content presented in Figure 5B and Figure 5C, respectively. High&#8209;magnification views of the infarct zone, border zone, and remote zone are displayed in Figure 5D. In WT-MI hearts, H&#38;E staining showed pronounced left ventricular wall thinning and a well-demarcated infarct zone. Within the infarct region, extensive inflammatory cell infiltration, myocardial necrosis, and marked fibrosis with scar formation were observed. In the border zone, inflammatory infiltration, myocardial necrosis, fibrosis and cardiomyocyte hypertrophy were evident, while the remote zone displayed prominent hypertrophic changes. Corresponding Masson&#39;s trichrome staining further demonstrated extensive interstitial fibrosis within both the infarct and border zones of WT hearts following MI. In contrast, Cracd-deficient mice exhibited substantially attenuated pathological alterations, including reduced wall thinning, diminished inflammatory infiltration and myocardial necrosis, less pronounced cardiomyocyte hypertrophy, and markedly decreased interstitial fibrosis compared with WT-MI hearts. These histological findings indicate that Cracd deficiency mitigates post-infarction myocardial damage and adverse remodeling.
Successful protocol execution should yield: (i) a well&#8209;demarcated infarct zone with extensive collagen deposition in WT-MI hearts; (ii) clear cellular morphology without staining artifacts; and (iii) significantly attenuated pathology in Cracd&#8209;deficient MI hearts. Although infarct size may vary with ligation precision, the genotype&#8209;dependent difference is a reliable indicator of successful performance.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig1c1.jpg" /> 
Figure 1: Generation of Cracd-deficient mice. (A) Construction of Cracd-deficient mice. (B) Schematic of the Cracd gene modification strategy. (C) PCR genotyping of tail genomic DNA. WT mice show a single 357 bp band, while homozygous (Cracd&#8209;deficient) mice show a single 421 bp band. (D) Sanger sequencing of genomic DNA confirmed the predicted deletion in the Cracd locus of deficient mice compared to WT controls. (E) Western blot analysis showed significantly reduced CRACD protein levels in the hearts of Cracd-deficient mice compared to WT controls. n = 6 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was calculated with a two-tailed unpaired Student&#39;s t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig2c1.jpg" /> 
Figure 2: Echocardiographic assessment of cardiac function. (A) Representative B-mode and M-mode echocardiographic images of mouse hearts at diastole and systole. Quantitative analysis of (B) interventricular septum thickness at diastole (IVSd) and (C) systole (IVSs), (D) left ventricular internal diameter at diastole (LVIDd) and (E) systole (LVIDs), (F) left ventricular posterior wall thickness at diastole (LVPWd) and (G) systole (LVPWs), (H) ejection fraction (EF), and (I) fractional shortening (FS). n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig2largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig3c1.jpg" /> 
Figure 3: Speckle-tracking strain analysis. (A) Representative images of left ventricular wall motion and deformation at diastole and systole. Quantitative analyses of the following parameters: (B) radial velocity, (C) longitudinal velocity, (D) radial displacement, (E) longitudinal displacement, (F) radial strain, (G) radial strain rate, (H) longitudinal strain, and (I) longitudinal strain rate. n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig4d1.jpg" /> 
Figure 4: Speckle-tracking imaging in WT-Sham, WT-MI, Cracd-deficient Sham, and Cracd-deficient MI groups at 7 days post-MI. (A) Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images. Left ventricular wall was segmented into six regions: BA (basal anterior), MA (mid anterior), AA (apical anterior), AP (apical posterior), MP (mid posterior), and BP (basal posterior). Color gradient from blue to red represents increasing strain magnitude. (B) Cardiac motion trajectories; time-to-peak curves for radial and longitudinal strain values along with corresponding peak times. Parametric distribution maps of strain synchrony (blue/red indicate direction: radial &#8211; away from/toward center; longitudinal &#8211; away from/toward apex). White dots = highest velocity regions, black dots = lowest velocity. Three-dimensional reconstructions (X: time, Y: spatial position, Z: strain magnitude). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig4larged1.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig5c1.jpg" /> 
Figure 5: Histopathological analysis of cardiac remodeling after MI. (A) Whole-heart longitudinal sections with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Scale bars: 2 mm. (B) Quantitative analysis of infarct size and (C) collagen content. (D) High&#8209;magnification views of infarct zone (IZ), border zone (BZ), and remote zone (RZ). H&#38;E: yellow circles = inflammatory infiltration; black arrows = myocardial necrosis; green stars = fibrosis; blue arrows = hypertrophy. Masson&#8217;s trichrome:&#160;blue indicates collagen deposition. Scale bar: 50 &#956;m. n = 5 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig5largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Este protocolo descreve a geração e caracterização fenotípica de um modelo de camundongo C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9 para estudar o papel do CRACD na remodelação cardíaca após infarto do miocárdio.

Geração e Caracterização Fenotípica de um Modelo de Camundongo Deficiente em Cracd Modificado por CRISPR/Cas9 para Estudos de Remodelamento Pós-Infarto do Miocárdio

O infarto do miocárdio (IM) continua a ser uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Este protocolo descreve um método para a geração e caracterização de ...

We study how Cracd-deficiency influences heart remodeling and function after myocardial infarction using a Cracd-deficient mouse model. This protocol can be applied to study gene functions in post-MI cardiac remodeling by combining CRISPR knockout with vivos during imaging. To begin, use CRISPR-Cas9 gene editing technology to generate Cracd-deficient mice on a C57BL/6N background.Place the anesthetized mice in a supine position on a surgical platform and confirm deep anesthesia by the absence of the pedal withdrawal reflex. Then perform orotracheal intubation using a 20 gauge intravenous catheter sheath. Place a small tuft of cotton wool at the opening of the tube to confirm successful intubation as it moves rhythmically with the mouse's breathing.Connect the tube to a mechanical ventilator upon successful intubation to maintain ventilation and anesthesia with 2%isoflurane. Apply ophthalmic ointment to both eyes to prevent corneal drying. Then remove the hair from the anterior chest using a depilatory cream and disinfect the surgical area by applying povidone iodine and 70%alcohol multiple times.After fully exposing the skin, make a 1 to 1.5 centimeter incision in the left chest wa

generation-phenotypic-characterization-crisprcas9-engineered-cracd

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Nós introduzimos um método cirúrgico para induzir experimental de isquemia / reperfusão (I / R) prejuízo para simular o infarto do miocárdio (MI) em modelos de mouse que permite uma maior clareza no posicionamento da ligadura na artéria descendente anterior esquerda (LAD) para aumentar a reprodutibilidade de experimentos MI em camundongos.

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

A insuficiência cardíaca é a principal causa de hospitalização e uma das principais causas de mortalidade. Um modelo de ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior em camundongos é aplicado para investigar o remodelamento ventricular e a disfunção cardíaca pós-infarto do miocárdio. A técnica de medidas hemodinâmicas invasivas em camundongos é apresentada.

A ligação permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda em Ratos: Um Modelo de Remodelação pós-infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para realizar na vivo edição de gene cardíaca em ratos usando recombinantes Adeno-Associated vírus (rAAV)-mediada entrega de CRISPR. Este protocolo oferece uma promissora estratégia terapêutica para tratar a cardiomiopatia distrófica em distrofia muscular de Duchenne e pode ser usado para gerar o nocaute cardíaco-específicas em ratos pós-natal.

Entrega de mediada por vírus adeno-associado de CRISPR para Gene cardíaco em ratos de edição

Nisto nós descrevemos um procedimento cirúrgico que mostra como conseguir a ligadura permanente da artéria coronária descendente esquerdo-anterior nos ratos. Este modelo é de grande relevância para investigar a fisiopatologia do infarto do miocárdio e os processos biológicos concomitantes.

Modelo de infarto do miocárdio murino usando ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda

Este artigo demonstra um modelo para estudar o remodelamento cardíaco após o cryoinjúria miocárdico nos ratos.

Um modelo Crioferimento para estudar infarto do miocárdio no mouse

Este protocolo apresenta uma maneira simples e coerente de regulamentar transitoriamente um gene de interesse usando modRNA após infarto do miocárdio em camundongos.

Entrega de mRNA modificado em um modelo de mouse de infarto do miocárdio

Descrevemos aqui, o estabelecimento e a aplicação de um Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referido como αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 abaixo) linha de repórteres para avaliação de reprogramação cardíaca. Os fibroblastos cardíacos neonatais (NCFs) isolados da cepa do camundongo são convertidos em cardiomiócitos induzidos (iCMs), permitindo uma avaliação conveniente e eficiente da eficiência de reprogramação e maturação funcional dos ICMs via fluxo de cálcio (Ca2+).

Avaliação in vitro da reprogramação cardíaca medindo fluxo de cálcio específico cardíaco com um repórter GCaMP3

Há várias diferenças entre os ventrículos direito e esquerdo. No entanto, a fisiopatologia do infarto ventricular direito (RVI) não foi esclarecida. No presente protocolo, é introduzido um método reprodutível para geração de modelos de mouse RVI, o que pode fornecer um meio de explicar o mecanismo do RVI.

Geração e Caracterização do Infarto do Miocárdio Ventricular Direito Induzido pela Ligação Permanente da Artéria Coronária Direita em Camundongos

Este protocolo descreve uma abordagem para facilitar edições precisas em embriões de peixe-zebra usando a tecnologia CRISPR-Cas9. Um pipeline de fenotipagem é apresentado para demonstrar a aplicabilidade dessas técnicas para modelar uma variante gênica associada à Síndrome do QT Longo.

Edições de knock-in precisas mediadas por CRISPR-Cas9 em corações de peixe-zebra

Fototrombose é uma técnica rápida, minimamente invasiva para induzir pequena e bem delimitada infarto em áreas de interesse de maneira altamente reprodutível. É particularmente adequado para o estudo de respostas celulares e moleculares subjacentes plasticidade cerebral em ratinhos transgénicos.

Isquemia Photothrombotic: Um Modelo de lesão cortical fotoquímica Minimamente Invasiva e reprodutível para mouse Estudos curso

Guangdong Provincial Biotechnology Research Institute (Guangdong Provincial Laboratory Animals Monitoring Center).  This protocol describes the generation and phenotypic characterization of a C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) mouse model using CRISPR/Cas9 technology to study the role of CRACD in cardiac remodeling following myocardial infarction.

Geração e Caracterização Fenotípica de um Modelo de Camundongo Deficiente em Cracd Modificado por CRISPR/Cas9 para Estudos de Remodelamento Pós-Infarto do Miocárdio

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