Name: De MEFs para Matrigel I: hESCs Passaging na Presença de MEFs (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-04T23:27:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Aprenda a cultivar células-tronco embrionárias humanas em estado pluripotente usando fibroblastos embrionários de camundongo e condições livres de alimentador com matrigel. Este método é essencial para pesquisas em medicina regenerativa.

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Humana estudos de células-tronco embrionárias no laboratório Teitell são suportados por um Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM), as sementes conceder RS1-00313. Agradecemos a membros do Centro de Medicina Regenerativa Broad e Investigação em Células Estaminais na Universidade da Califórnia, especialmente Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, e membros do Instituto Broad Stem UCLA Facility núcleo celular para o seu apoio de nossos estudos.

Dividir células estaminais embrionárias humanas (hESCs) semeadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) Normalmente uma placa CTEh confluentes podem ser divididos 01:06 - 01:10, dependendo da linha CTEh particular. A placa vai se tornar confluentes dividir novamente 5-7 dias após a divisão. <ol><li> Dois dias antes de se separarem, gelatinizar placas usando uma solução 0,1% de gelatina. Para uma placa de 6 poços, adicionar 2 ml em cada placa bem e incubar a 37 ° C, 5% CO 2 de cultura de tecidos incubadora durante a noite. </li><li> Placa MEFs em 6-gelatinizado bem pratos do dia antes de o plano de dividir o hESCs. (NOTA: MEFs pode ser banhado até 3 dias antes, se necessário Após a 3 dias, MEFs-se mais planas e mais espalhadas, e não pode sustentar hESCs bem como calouro MEFs pode..) Pegue um frasco de g-irradiado ou mitomicina C tratados CF1 MEFs, contendo 5-6 x 10 6 células, a partir de nitrogênio líquido e descongelamento por 2 min em banho-maria a 37 ° C. Lave as células uma vez com o Media MEF quente Cultura em um tubo falcon de 50ml e ressuspenda no volume final de Meios de Cultura quente MEF. Em 5-6 x 10 6 células, isso é suficiente para placa de duas ou três placas de 6-bem. </li><li> Enquanto o MEFs estão sendo lavados, retire as placas gelatinizado, remover toda a solução dos poços e adicionar 2,5 ml de Meios de Cultura MEF por poço. </li><li> Adicionar 0,5 ml de suspensão por poço MEF para alcançar 3ml como um volume final em cada poço. Certifique-se de MEFs são uniformemente dispersas e placas lugar de volta na incubadora durante a noite para resolver. </li><li> No dia da divisão CTEh, prepare frescos ou use &lt;2 semanas de idade estéril colagenase solução IV em 1mg/ml. Remova toda a mídia dos poços CTEh você quer dividir, lave uma vez com 2 ml por poço de 1 × quente PBS, pH 7,4, e adicionar 1 ml de solução de colagenase IV. Incubar a 37 ° C por 5-10 min. Pegue a placa CTEh 6-bem fora da incubadora e adicionar 1 ml de ES mídia (sem bFGF) a cada poço. Usando a solução em cada poço, com uma pipeta de 1ml sugar até a mídia e soprar as células-tronco fora da placa. Para cada bem isso vai levar cerca de 5 a 10 repetições. Em seguida, transfira a hESCs suspenso em um tubo falcon 50ml. Faça isso para todos os poços, sendo dividido e se combinam em um tubo falcon 50ml. Pellet o hESCs a uma temperatura de 200g por 5 min e lave uma vez com a mídia ES faltando bFGF. </li><li> Enquanto o hESCs estão sendo lavados, retire as placas MEF, remova toda a mídia dos poços e lavar uma vez com estéril, morna 1 × PBS, pH 7,4, em seguida, adicionar 2,5 ml de ES mídia (agora suplementado com 10 ng / ml bFGF) por também. </li><li> Ressuspender o hESCs peletizadas em um volume adequado de mídia ES, suplementado com 10ng/ml bFGF. (NOTA:.. Quando o hESCs são ressuspenso, eles devem ser do tamanho das colônias mais ou menos uniforme e forma o volume de ressuspensão depende da relação de divisão) cuidadosamente pipeta suspensão CTEh cima e para baixo algumas vezes para fazer as colônias menores e mais uniformes, mas não tanto que as células individuais ou colônias muito pequenas são gerados. Adicionar 0,5 ml de suspensão CTEh por poço para as placas MEF para atingir 3 ml como volume final em cada poço. Visualmente certifique-se que o hESCs são distribuídas uniformemente, antes de colocar as placas de volta na incubadora durante a noite para resolver. Após o plaqueamento, ele geralmente levam alguns dias para colônias de assumir a sua forma característica e aparência fronteira. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science . 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology+%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em células embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) alimentador. Na última etapa antes do plaqueamento, quando o hESCs são ressuspenso, eles devem ser do tamanho das colônias mais ou menos uniforme e forma. Pipeta com cuidado a suspensão CTEh cima e para baixo algumas vezes para fazer as colônias menores e mais uniforme, mas não tanto que as células individuais ou colônias são muito pequenas manchas generated.Immunofluorescence e citometria de fluxo para mic...

<table><tbody><tr><td>Substituto de Soro para Depleção (KSR)</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Reagente</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Reagente</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina </td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reagente</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Oct-4</td><td>Reagente</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-h/mSSEA-4 conjugado com Fitoc&amp;#8211;eritrina, IgG3 de camundongo</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário IgG de coelho conjugado com FITC</td><td>Reagente</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

de mefs para matrigel i: hescs passaging na presença de mefs

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em células embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) alimentador.

Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em células embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) alimentador. Parte 1 de 3.

De MEFs para Matrigel I: hESCs Passaging na Presença de MEFs

Este vídeo demonstra como cultivar células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em células alimentadoras de fibroblastos embrionários de camundongo (MEF).

Devido ao seu potencial significativo na medicina regenerativa, crescente atenção tem sido direcionada à biologia e manipulação de células-tronco embrionárias humanas. Neste vídeo, mostramos como cultivar e manter células-tronco embrionárias humanas em um estado pluripotente utilizando células alimentadoras de fibroblastos embrionários de camundongo e condições livres de alimentadoras em matrigel. Olá, sou Jinjiang de um microtítulo de laboratório do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade da Califórnia em Los Angeles.Hoje vamos mostrar um procedimento para o cultivo de células-tronco embrionárias humanas em fibroblastos embrionários de camundongo, células alimentadoras derivadas de camundongo e em condições livres de alimentadoras sobre gel de matriz. Este procedimento envolve o preparo de fibroblastos embrionários de camundongo, a geração de meio condicionado com met, o preparo do gel de matriz, o preparo de placas e massas para alimentação e o cultivo de células-tronco embrionárias humanas ao longo do tempo. Então, vamos começar.Para iniciar o procedimento de cultura, células-tronco embrionárias humanas são semeadas sobre fibroblastos embrionários de ca

from-mefs-to-matrigel-i-passaging-hescs-in-the-presence-of-mefs

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina.

MATIZ Passaging-tronco embrionárias humanas Cell-linhas com Tripsina

Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 2 de 3.

De MEFs para Matrigel 2: hESCs Divisão de MEFs para Matrigel

Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 3 de 3.

De MEFs para Matrigel 3: hESCs Passaging de Matrigel em Matrigel

Diferenciação dirigida de hESCs em células específicas tem gerado muito interesse na medicina regenerativa. Nós fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para determinar...

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Este artigo incidirá sobre a geração de endoderme hepática humana de populações humanas de células-tronco embrionárias.

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

A qualidade de fibroblastos embrionários (MEFs) é ditada pela estirpe direito de rato tal como CF-1. Pluripotência-MEFs apoio e meios condicionados (CM), obtida a partir destes deve conter concentrações ótimas de Activin A, Gremlin e TGF-p1 necessários para a Activin / Nodal e vias FGF para co-operatório manter a auto-renovação e pluripotência.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

Apesar dos esforços em curso para as culturas de transição para a alimentação livres de condições, a derivação ea cultura de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) permanecem em grande parte dependente de co-culturas com alimentadores embrionárias (MEFs). Aqui, mostramos uma nova metodologia para a rápida remoção de alimentadores de culturas CTEh antes da experimentação.

A remoção rápida de fibroblastos de Alta Densidade Humanos culturas de células estaminais embrionárias

Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em reprogramação epigenética de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para a geração de uma população homogênea de células progenitoras musculares esqueléticas que, sob condições de cultura permissiva formam aglomerados tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres), que recapitulam características biológicas do ser humano músculos esqueléticos.

Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC), com base no crescimento de monocamada do tipo não colônia (NCM) de células individuais dissociadas. Este novo método, utilizando inibidores de quinase associados a Rho ou a isoforma de laminina 521 (LN-521), é adequado para produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneos, manipulação genética e descoberta de medicamentos.

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

Linhas celulares Repórter oferecer um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse de populações heterogêneas. No entanto, utilizando a recombinação homóloga convencional em células estaminais embrionárias humanas-alvo do gene é extremamente ineficiente. Relata-se alvo CNS mesencéfalo específico fator de transcrição PITX3 loco com EGFP usando zinc-finger nuclease reforçada recombinação homóloga.

Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando proteína morfogênica óssea 4 e inibidores das vias Activina/Nodal. Este método é adequado para a diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas e pode gerar grandes quantidades de células para manipulação genética.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

Aprenda a cultivar células-tronco embrionárias humanas em estado pluripotente usando fibroblastos embrionários de camundongo e condições livres de alimentador com matrigel. Este método é essencial para pesquisas em medicina regenerativa.

De MEFs para Matrigel I: hESCs Passaging na Presença de MEFs

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