Name: Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Aprenda a analisar complexos respiratórios mitocondriais em células estaminais embrionárias humanas usando ensaios de atividade in gel. Este método permite avaliar a função mitocondrial com alta resolução.

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Humana estudos de células-tronco embrionárias no laboratório Teitell são atualmente suportadas por um Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM), as sementes conceder RS1-00313. Agradecemos ao Dr. Carla Koehler (UCLA) e membros do laboratório Koehler para fornecer conselhos e idéias nessas e em estudos adicionais.

Alta Resolução Eletroforese Gel Limpar Native (hrCNE) para Complex mitocondrial em Gel-ensaios de atividade Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) foram mantidos em uma monocamada de ˠ irradiados ou mitomicina C fibroblastos tratados com embrionárias de camundongos (MEFs), depois passou para o crescimento em Matrigel por 5 dias em MEF-condicionado médio utilizando condições padrão. Para remover contaminantes MEFs, hESCs foram re-semeadas em Matrigel e cultivadas em MEF-condicionado meio de um adicional de 3 dias. Microscopia de imunofluorescência para marcadores de pluripotência Oct-4 e SSEA-4 foi usado para confirmar a falta de diferenciação CTEh. <ol><li> Lavar as células com PBS 1x quente, pH 7,4, seguido por tripsinização (1 ml de tripsina 1x por bem em uma placa de 6 poços) por 5 min. </li><li> Adicionar um volume igual de inibidor de tripsina frescos (1mg/ml em 1x PBS, pH 7,4). Células colheita e centrifugar a 200 g, 5 min, temperatura ambiente. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 0,8 peletizada - 1.7ml (baseado no tamanho do pellet celular) de gelo tampão de isolamento a frio mitocôndrias (83mm de sacarose; 6.6mM imidazol / HCl, pH 7,0) preparada na hora com Cocktail Inibidor 1 &#39;Protease. Incubar no gelo por 10 min. </li><li> Dounce células com um homogeneizador (~ 4-50 AVC). Mancha uma alíquota das células dounced com azul de tripano para verificar integridade de homogeneização utilizando um microscópio de luz. </li><li> Centrifugar a 20.000 g por 10 min a 4 ° C para obter um bruto mitocondrial pelota que também contém núcleos e fragmentos de célula maior. Decantar e desprezar o sobrenadante e pesar o precipitado bruto mitocondrial pellet. O pellet podem ser armazenadas a -80 ° C após congelamento em nitrogênio líquido instante se este é um ponto de parada. NOTA: centrifugação diferencial ou outros baseados em gradiente de procedimentos podem ser usados ​​para isolar e coletar uma fração de membrana pura mitocondrial. Ver ref. 4 para mais detalhes. Esta abordagem alternativa trará a atividade mitocondrial complexo por mg de proteína mitocondrial em vez de atividade complexa por mg de peso celular ou número de celular. A concentração de proteínas mitocondriais terá de ser determinada após a purificação para fazer esta comparação. Além disso, um buffer de isolamento diferentes podem ser necessários para esta abordagem. Para solubilização da fração de membrana pura mitocondrial, consulte a seguinte nota a etapa 6 abaixo. </li><li> Solubilizar o crude mitocondrial pellet no gelo por vórtex com gelo tampão de solubilização a frio (50 mM NaCl, 50 mM imidazol / HCl pH 7.0, 1mM EDTA, 2mM 6-aminohexanoic ácido). Ácido 6-aminohexanoic pode ser substituído com o Cocktail 1x Inibidor da Protease. Use 35μl de tampão de solubilização por 20mg de peso pelota. Adicionar 20μl de 10% w / v digitonina por 20mg de pellet de peso e misture sacudindo o tubo. Incubar por 50-10 min no gelo. Dodecil-bD-maltosídeo ou triton X-100 pode ser substituído por digitonina para solubilizar as proteínas. A escolha do detergente e sua quantidade pode afetar a formação de supercomplexes ou formas multimérica dos complexos mitocondriais. Para mais informações, consulte ref.1. NOTA: A quantidade de detergente necessária para solubilizar uma fração de membrana pura mitocondrial corresponde a uma relação peso / detergente de proteínas variando de 2-6g / g. A proporção ideal para solubilizar as membranas mitocondrial é 2,5 g / g de dodecil-bD-maltosídeo, 3g / g de triton X-100, e 6g / g para digitonina. </li><li> Centrifugar o pellet solubilizados a 100.000 g por 15 min a 4 ° C. Recolher o sobrenadante límpido. </li><li> Adicionar tampão de carregamento para um final de 5% de glicerol w / v e 0,01% w / v Ponceau S (use um 50% de glicerol w / v, 0,1% w / v carregamento Ponceau S solução estoque regulador). </li><li> Carga poços de gel com um volume que contém 20-40mg do crude mitocondrial pellet por pista. Use um gel de gradiente de acrilamida (4% -13) com 3,5% de empilhamento gel. NOTA: Gel de preparação e condições de eletroforese: Para a preparação de gel, use um acrilamida / bis-acrilamida (AA / bisAA) 3 mix da seguinte forma: 48g de acrilamida e 1,5 g de bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Onde T é a concentração total de AA e bisAA e C é o percentual de reticulador (bisAA) para monômero total). Gel buffer (3 &#39;): 1,5 M de ácido 6-aminohexanoic; imidazol 75mm, pH 7,0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;" border="0"><tbody><tr><td> Gel gradiente: </td><td> 4% </td><td> 13% </td><td> Empilhamento gel: </td><td> 3,5% </td></tr><tr><td> AA / bisAA misture 3 </td><td> 2 ml </td><td> 6,5 ml </td><td></td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td> Gel tampão 3 &#39; </td><td> 8,3 ml </td><td> 8,3 ml </td><td></td><td> 2,7 ml </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td></td><td> 5 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14,7 ml </td><td> 5 ml </td><td></td><td> 4,7 ml </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td></td><td> 8 ml </td></tr><tr><td> APS 10% </td><td> 139 mL </td><td> 125 mL </td><td></td><td> 67 mL </td></tr><tr><td> Temed </td><td> 14 mL </td><td> 12,5 mL </td><td></td><td> 6,7 mL </td></tr></tbody></table> Buffer de ânodo: 25mM imidazol / HCl, pH 7,0 Tampão cátodo: tricine 50mm, 7.5mm imidazol / HCl, 0,02% w / v dodecil-bD-maltosídeo, 0,05% w / v desoxicolato, pH 7,0 Despeje e executar géis em uma sala fria (4-7 ° C). A tensão inicial usado é 100V. Quando a amostra entrou no gel de empilhamento, a tensão é elevada a 500V com a corrente limitada a 15mA (para 0,15 &#39;14&#39; 14 cm de gel). Eletroforese é interrompido após 3-4 h, quando a linha nítida de corante vermelho Ponceau S a abordagens frente gel. Alternativamente, um gel pode ser executado durante a noite com tensão constante de 70-100V. <ol><li> Em gel de ensaios de atividade. O tempo de incubação para cada ensaio depende da eficiência de solubilização de proteína e da quantidade de material carregado por bem. Complexos I, IV e V costumam gerar sinais mais fortes do que os complexos II e III. </li></ol> Complexo I (CI) Incubar a fatia de gel com CI buffer (5mM Tris-HCl, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) em temperatura ambiente por várias horas. CI buffer: Adicionar por 100ml de 5mM Tris-HCl, pH 7.4: 0.01g NADH 0.25g NBT Corrigir o gel em metanol 50% e 10% de ácido acético por 15-45 min. O gel é preservada fixo em 10% de ácido acético. Complexo II (CII) Incubar a fatia de gel com CII buffer (20mM de sódio succinato; methasulfate fenazina 0,2 mM; 2.5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7,4) em temperatura ambiente por várias horas. CII buffer: Adicionar por 100ml de 5mM Tris-HCl, pH 7.4: Succinato de sódio 1M 200μl Pipete 80 methasulfate fenazina (PMS 250mm dissolvido em DMSO) 0.25g NBT Corrigir o gel como descrito para Complexo I Complexo III (CIII) Incubar a fatia de gel com CIII tampão (fosfato de sódio 50mM, pH 7,2; 0,05% 3,3 tetrahidrocloreto &#39;diaminobenzidina (DAB)) em temperatura ambiente por várias horas. CIII buffer: Adicionar por 100 ml de fosfato de sódio pH, 50mM 7.2: 50mg tetrahidrocloreto diaminobenzidina Corrigir o gel como descrito para Complexo I Complexo IV (CIV) Incubar a fatia de gel com CIV tampão (fosfato de sódio 50mM, pH 7,2; 0,05% 3,3 tetrahidrocloreto &#39;diaminobenzidina (DAB), o cavalo de 50 ìm coração citocromo c) em temperatura ambiente por várias horas. CIV buffer: Adicionar por 100 ml de fosfato de sódio pH, 50mM 7.2: 50mg tetrahidrocloreto diaminobenzidina Cavalo 0.1g coração citocromo c Corrigir o gel como descrito para Complexo I Complexo V (CV) Incubar a fatia de gel com CV tampão (Tris-base de 35mm, 270mm glicina, pH 8,3 a 25 ° C, 14mm MgSO 4, 0,2% w / v Pb (NO 3) 2, 8MM ATP) em temperatura ambiente por várias horas. CV buffer: 100 ml de solução por acrescentar: <table border="0"><tbody><tr><td> Tris-base </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> Glicina </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> Pb (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> Não há necessidade de ajustar o pH (deve ser 8.3) - não use ácido ou base. Filtro e adicionar <table border="0"><tbody><tr><td> ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> Corrigir o gel em metanol 50% por 30 min e transferência para a água.

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

Neste vídeo, temos descrito a extração de complexos de proteína mitocondrial de células estaminais embrionárias humanas, a sua separação por eletroforese em gel de alta resolução clara nativa (hrCNE), e posterior análise por gel em ensaios de atividade catalítica. hrCNE resolve complexos de proteína mitocondrial de membrana com uma resolução comparável à de eletroforese em gel azul nativa e é superior para os ensaios em gel atividade. Esta técnica pode ser empregada não apenas para quantificar respiratória mitocondrial complexos IV, mas tam...

<table><tbody><tr><td>EDTA 0,5 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>ajustar o pH para 8,0 com NaOH</td></tr><tr><td>NaCl 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de sódio 1 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 e BP329-1</td><td>Misture 68,4 ml de Na2HPO4 1 M e 31,6 ml de NaH2PO4 1 M para preparar tampão de fosfato de sódio 0,1 M com pH 7,2 a 25 °C</td></tr><tr><td>Tricina 1 M, pH 7,0 (ajustado com NaOH)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>armazenar a 4 °C</td></tr><tr><td>Imidazol/HCl 1 M, pH 7,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>armazenar a 4 °C</td></tr><tr><td>Tris-HCl 1 M, pH 7,4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil-β-D-maltosídeo (DDM) 20% (p/v)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>Dissolvido em água. Armazene alíquotas de 1 ml a &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Digitonina 10% (p/v) (&amp;gt;50% de pureza, usada sem recristalização)</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>Dissolvida em água. Armazene alíquotas de 0,1&amp;#8211;1 ml a &amp;#8211;20 °C. Deve ser aquecida até 95 °C antes do uso.</td></tr><tr><td>Ácido 6-aminohexanóico 2 M</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>armazenar a 4 °C</td></tr><tr><td>Solução estoque de Ponceau S/glicerol 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 e G6279-1L</td><td>Ponceau S 0,1%, glicerol 50% (p/v) em água.</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio 10% p/v</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>Dissolvido em água. Deve ser protegido da luz. Ajuste o pH para 7,0 com HCl, filtre e armazene à temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Fenazina metassulfato (PMS) 250 mM</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>Dissolvido em DMSO e alquotado. Armazene a &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Tetrazólio azul nítrico (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidina tetra-hidrocloridrato (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Base de Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&amp;rsquo;-trifosfato dissódico (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>Classe I, mínimo 99%</td></tr><tr><td>β-nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) forma reduzida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c do coração de cavalo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease 100x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Armazenar a &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Dissulfóxido de dimetila (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Corante azul de tripano 0,4%</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 10x (0,5%)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

sondagem para a atividade complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

As mitocôndrias são organelas citoplasmáticas que têm um papel fundamental no metabolismo celular ea homeostase, a regulação da rede de sinalização celular e morte celular programada. Mitocôndrias produzem ATP, regular o estado redox citoplasmático e Ca2 + equilíbrio, catabolizar ácidos gordos, sintetizar heme, nucleotídeos, hormônios esteróides, aminoácidos, e ajudar a montar ferro-enxofre em proteínas. Mitocôndria também têm um papel essencial na produção de calor. Mutações do genoma mitocondrial causar vários tipos de desordem humana. O acúmulo de mutações do mtDNA correlaciona-se com o envelhecimento e é suspeito de ter um papel importante no desenvolvimento do câncer. Devido ao seu papel de vital importância em todos os tipos de células, a função das mitocôndrias também deve ser crítico para as células-tronco. Avanços importantes foram feitos em nossa compreensão da viabilidade de células-tronco, proliferação e capacidade de diferenciação. Mas a atividade funcional das células-tronco, no estado de energia particular, a sua, não foi ainda estudado em detalhe. Quase nada se sabe sobre as propriedades mitocondrial de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e seus descendentes precursor diferenciadas. Uma maneira de compreender e avaliar o papel da mitocôndria na função CTEh e potencial de desenvolvimento é o de medir diretamente a atividade dos complexos respiratórios mitocondriais. Aqui, descrevemos de alta resolução de eletroforese em gel claro nativa e posterior visualização em gel atividade como um método para analisar os cinco complexos da cadeia respiratória de hESCs.

Neste vídeo, vamos mostrar-lhe como os complexos da cadeia respiratória mitocondrial de células estaminais embrionárias humanas podem ser analisadas por ensaios de atividade em gel.

Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

As mitocôndrias são organelas citoplasmáticas que desempenham um papel fundamental no metabolismo e na homeostase celular, na regulação da rede de sinalização celular e...

As mitocôndrias têm inúmeras funções na fisiologia celular, desde o metabolismo e produção de energia até a morte celular programada e a síntese de hormônios esteroides. Apesar da importância das mitocôndrias tanto nas funções celulares fundamentais quanto nas doenças, sabe-se muito pouco sobre a função mitocondrial em células-tronco embrionárias humanas e em seus descendentes diferenciados. Neste vídeo, mostraremos como os complexos da cadeia respiratória mitocondrial de células-tronco embrionárias humanas podem ser analisados utilizando ensaios histoquímicos de atividade enzimática.Olá, sou Ivan OV do laboratório de Michael Tetel do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade da Califórnia, Los Angeles. Hoje vamos mostrar um procedimento para avaliar a função dos complexos respiratórios mitocondriais em células-tronco embrionárias humanas. Esta avaliação da atividade em gel envolve o isolamento de um extrato mitocondrial bruto de células-tronco embrionárias humanas, a separação dos complexos mitocondriais do sistema de fosforilação oxidativa por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo claro com alta resolução e, posteriormente, a detecção da atividade e

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Fibroblastos de pacientes portadores de mutações no causadores de doenças de Parkinson genes representam um facilmente...

A utilização de recursos primários fibroblastos humanos de Monitoramento Fenótipos mitocondriais no Campo da Doença de Parkinson

Os efeitos da activação da proteína quinase C (PKC) isozimas de funções mitocondriais associadas com a respiração e fosforilação oxidativa e na viabilidade celular são descritos. A abordagem técnica adapta adenoviral para superexpressar selectivamente as isozimas PKC em cultura primária de células e uma variedade de ensaios para determinar as funções mitocondriais e do estado de energia da célula.

Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

Aqui, descrevemos como estudar a localização mitocondrial de uma quinase (ciclo celular) e como determinar sua localização submitocondrial, bem como potenciais substratos/alvos mitocondriais. A expressão forçada de proteínas nas mitocôndrias fornece uma ferramenta útil para estudar as consequências funcionais da localização mitocondrial de uma proteína de interesse.

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Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas. O protocolo apresentado usa neurônios cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para avaliar o transporte mitocondrial e a morfologia em paraplegia espástica hereditária. Este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia, o que facilitará o estudo de doenças neurodegenerativas.

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

Descrevemos um protocolo detalhado para a geração de organoides cerebrais pluripotentes induzidos por células-tronco induzidos pelo homem e seu uso na modelagem de doenças mitocondriais.

Geração de Organoides cerebrais humanos para modelagem de doenças mitocondriais

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Medindo complexos de transferência de elétrons mitocondrial em tecido cardíaco previamente congelado da prole da porca: um modelo para avaliar alterações bioenergetics mitocondrial induzidas pelo exercício

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Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

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