Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

Mitocôndrias Têm vários papéis na fisiologia celular, desde o metabolismo e produção de energia até a morte celular programada e a síntese de hormônios esteróides. Apesar da importância das mitocôndrias nas funções celulares fundamentais e na doença, muito pouco se sabe sobre a função das mitocôndrias nas células-tronco embrionárias humanas e sua progênie diferenciada. Neste vídeo, mostraremos como os complexos da cadeia respiratória mitocondrial das células-tronco amry humanas podem ser analisados usando ensaios de atividade Ingel.

Olá, sou Ivan OV do laboratório de Michael Tetel no Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade da Califórnia em Los Angeles. Hoje mostraremos um procedimento para avaliar a função do complexo respiratório mitocondrial em células-tronco embrionárias humanas. Estes na atividade do gel avaliam este procedimento envolve o isolamento do palato mitocondrial bruto de células-tronco embrionárias humanas, separação de complexos mitocondriais do sistema de fosforilação exsudativa com eletroforese em gel de poliacrilamida nativa clara de alta resolução e subsequente atividade em gel sa.

Então vamos começar. O primeiro passo neste procedimento é isolar as mitocôndrias das células-tronco embrionárias humanas. Para este ensaio, usaremos células-tronco embrionárias humanas que foram cultivadas em uma placa coberta de matrigel em uma condição livre de alimentador.

Para coletar mitocôndrias de nossas células-tronco amry humanas, começamos lavando-as com uma quente XPDS pH 7.4 e, em seguida, tripsina nas células por cinco minutos. Você pode usar um mil de uma x tripsina por poço em uma placa de seis poços. Após cinco minutos, você pode interromper a reação adicionando um volume igual de inibidor de tripsina fresco de um miligrama por mil em um XPBS e colher as células.

As células coletadas são então centrifugadas a 200 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e resus, suspenda as células peletizadas em 0,8 a 1,7 mililitros de tampão de isolamento de mitocôndrias geladas com um coquetel recém-preparado de um inibidor de protease. A quantidade de tampão que você usa depende do tamanho do pellet celular que você obtém Depois que o pellet for ressuspenso, incube-o no gelo por cerca de 10 minutos.

Após a incubação nas células com um homogeneizador, isso pode levar cerca de 40 a 50 golpes. Podemos verificar a lista completa de homogeneização colorindo uma alíquota das células DOD com azul trian e olhando através de um microscópio óptico. Deve ser algo assim.

Este é o primeiro tiro após 50 tacadas com downs. Este é o segundo tiro após 80 tacadas com downs. Uma vez que as células estejam homogeneizadas, centrifugue-as a 20.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus C. Isso nos dará um pellet mitocondrial bruto, que também conterá núcleos e fragmentos de células maiores.

Antes da coleta do pellet, temos que pesar o tubo de coleta para estimar o peso subsequente do pellet, despejar e descartar o sobrenadante e, em seguida, pesar o pellet mitocondrial bruto precipitado. Subtraindo o peso do tubo neste ponto, pode-se proceder à solubilização do pellet, que será mostrado na próxima etapa. Para solubilizar o pellet mitocondrial bruto, começamos mantendo o pellet no gelo e fazendo vórtice com 35 microlitros de tampão de solubilização gelado.

Para cada 20 miligramas de pellet que temos, informações detalhadas sobre os compostos tampão são mencionadas no protocolo escrito que acompanha. Após o vórtice e a adição do tampão de solubilização e antes de adicionar a toína de dígito, transferimos o pellet ressuspenso para um tubo apropriado para centrifugação de alta velocidade e, em seguida, adicionamos 20 microlitros de 10% de peso por volume de toin de dígito para 20 miligramas de peso de pellet e misturamos sacudindo o tubo depois de ter sido misturado, incubamos completamente o pellet mitocondrial por cinco a 10 minutos no gelo. Doil beta D multiside ou DDM ou Triton X 100 pode ser substituído por dígitos toína em proteínas solubilizadas.

A escolha do detergente e sua quantidade podem afetar a formação de supracomplexos ou formas multiméricas de complexos mitocondriais após a incubação no gelo. E uma vez que o pellet tenha sido solubilizado, vamos centrifugá-lo a cem mil vezes G por 15 minutos a quatro graus C, então coletaremos o sobrenadante claro. Agora estamos prontos para preparar o sobrenadante para funcionar em nosso gel gradiente para eletroforese em gel gradiente nativo de mitocôndrias.

Recomendamos o uso de um gel gradiente de acrilamida de cinco a 13% com um gel de empilhamento de 3,5%. Para preparar o gel, usaremos uma mistura de acrilamida bis acrilamida, conforme descrito no protocolo escrito. A solução de acrilamida é preparada com antecedência e armazenada a quatro graus Celsius em local escuro.

A acrilamida e a bis acrilamida são produtos químicos tóxicos tanto em pó quanto na forma líquida, portanto, atenção especial deve ser dada ao trabalhar com eles. Combinamos a solução de acrilamida bis acrilamida com uma alíquota de três x tampão de gel composto por 1,5 molar de ácido hexa noico de seis aminoácidos e 75 milimolares ole em pH 7,0. A quantidade de acrilamida bis solução de acrilamida que adicionamos ao tampão dependerá da porcentagem de gel que estamos fazendo para fazer o gel gradiente.

Faremos uma mistura de 4% e uma mistura de 13%, e o gel de empilhamento será uma mistura de 3,5%. Não se esqueça de adicionar glicerol à mistura de 13%. Quando todas as três misturas estiverem prontas, adicionamos uma quantidade apropriada de amônio por sulfato e temid às misturas e despejamos as misturas em uma câmara de fundição de gradiente.

A parte esquerda da câmara contém a mistura de 5%. A parte direita da câmara contém a mistura de 13% em uma pequena barra de agitação magnética. Começamos a derramar o gel abrindo a parte direita da câmara.

Em seguida, imediatamente abrimos a parte esquerda da câmara e deixamos a solução a 5% se misturar com uma solução a 13% para fazer o gradiente. Adicionamos uma pequena quantidade de isopropanol na parte superior do gel para formar uma borda reta e afiada para o gel após a polimerização. Aproximadamente uma hora depois, quando a polimerização do gel gradiente estiver completa, removemos o isopropanol e despejamos o gel de empilhamento 3,5 no aparelho e inserimos um pente de gel.

Vamos montar e executar os géis em uma câmara fria de cerca de quatro a sete graus Celsius. Para executar este gel, usaremos dois buffers diferentes. Na câmara do ânodo, usaremos um tampão contendo ácido clorídrico ol 25 milimolar pH 7,0.

O tampão catódico conterá 50 milímetros tric, 7,5 milimolares de ácido clorídrico ole ol, 0,02% de peso por volume, doil beta D multiside ou DDM e 0,05% de peso para volume, deoxy coate pH 7,0. Para preparar o sobrenadante para ser executado no gel que acabamos de derramar, o tampão de carregamento é adicionado para produzir uma concentração final de 5% de peso para volume de glicerol e 0,01% de peso para volume. Ponto S, normalmente adicionamos uma solução estoque 10 x contendo glicerol e ponchos s diretamente aos sobrenadantes.

Agora estamos prontos para carregar a amostra de gel no gel. Carregaremos os poços de gel com um volume que contém 20 a 40 miligramas da proteína mitocondrial bruta por pista. Imediatamente após o carregamento, o gel é executado a 100 volts.

Uma vez que a amostra tenha entrado no gel de empilhamento, a tensão pode ser aumentada para 500 volts com a corrente limitada a 15 miliamperes. Embora geralmente executemos o gel durante a noite a 70 a 100 volts, paramos a eletroforese quando uma linha nítida do corante zos vermelho se aproxima da frente do gel. Agora que o gel foi executado, podemos analisar a atividade de diferentes complexos de proteínas diretamente no gel.

O tempo de incubação para cada ensaio depende da eficiência da solubilização de proteínas e da quantidade de material carregado por poço. Os complexos um, quatro e cinco geralmente produzem sinais mais fortes do que os complexos dois e três. É por isso que o tempo de coloração para os complexos dois e três deve ser maior.

Para testar a atividade complexa, precisaremos usar buffers específicos para cada complexo. Você pode encontrar os ingredientes para os buffers individuais no protocolo escrito. Agora vamos cortar faixas individuais do gel Para realizar os ensaios de atividade Ingel separadamente.

Para todos os complexos, incubar a fatia de gel nos respectivos tampões durante várias horas à temperatura ambiente para todos os complexos, excepto para o complexo cinco. Após a incubação, fixe o gel em 50% de metanol e 10% de ácido acético por 15 a 45 minutos. O gel fixo é preservado em ácido acético a 10%.

Você vê aqui como aparece a coloração do complexo. Há uma faixa roxa profunda na fatia de gel que corresponde a uma complexa. Os géis transparentes permitem realizar densitometria a partir de atividades complexas mitocondriais e fazer análises comparativas.

Após citometria densa, geralmente secamos as fatias de gel para armazenamento de longo prazo e / ou para digitalização, a fim de obter um complexo de imagem de alta qualidade, duas manchas da mesma cor roxa que um complexo três e complexo quatro. Ambos dão uma faixa de coloração laranja ou amarelada. Aqui estão exemplos de atividades complexas de coloração duas, três e quatro.

Acabamos de mostrar como analisar a atividade dos complexos de exsudação mitocondrial, que foram extraídos de células-tronco embrionárias humanas e separados por maior resolução, incluindo eletros de gel nativos. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.