Name: Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Aprenda a isolar e analisar células-tronco hematopoéticas da placenta murina. Este método demonstra técnicas experimentais para visualizar HSCs em seus nichos microambientais únicos durante a embriogênese.

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1. Remoção do embrião e dissecção da placenta <ol><li> Para começar, os embriões devem primeiro ser isolados de vacas prenhes. </li><li> Os animais são sacrificados de acordo com os procedimentos aprovados - no nosso caso vamos utilizar uma dose letal do anestésico isoflurano </li><li> Primeiro, spray a barriga com etanol e fazer uma pequena incisão com uma tesoura. </li><li> Arrancar a pele com ambas as mãos para descobrir o abdômen e corte aberto o peritônio. </li><li> Com uma pinça, pegue o cornos uterinos e recolhê-las usando uma tesoura em cada extremidade distal. Coloque o cornos uterinos em uma placa de petri preenchida com PBS e colocar no gelo. Além disso, lembre-se de lavar várias vezes com PBS antes de isolar a placenta. Agora podemos isolar a placenta. </li><li> Com duas pinças, comece a descascar cuidadosamente o tecido endometrial em torno do embrião conceptos. Deve-se ter cuidado para não furar ou não causar danos estruturais aos embriões, pois isso irá complicar a dissecção passos subseqüentes. </li><li> Coloque o conceptos isoladas numa placa de Petri novo com PBS sobre o gelo e continuar até que todos os conceptos foram libertados do endométrio. </li><li> Transferência de um concepto para uma nova placa de Petri com PBS colocado sob o microscópio e com duas pinças de descascar a decidua longe da placenta. Remover o máximo do possível decídua como células decidua irá interferir com a suspensão de uma única célula e citometria de fluxo. Um movimento contínuo suave peeling é recomendado para alcançar os melhores resultados. </li><li> Cortar o saco vitelino longe da placenta na junção entre os dois órgãos e puxe o saco vitelino e vasos vitelínico longe da placenta. Cuidados devem ser tomados para não perturbar a placa coriônica da placenta, especialmente com embriões. </li><li> Cuidadosamente segurando a placa coriônica da placenta com um par de fórceps e do cordão umbilical com outro, puxa o cordão umbilical e embrião ligado longe da placenta. </li><li> Remover o tecido celular excesso de gigante nas bordas da placenta, a fim de minimizar a aglutinação das células durante a preparação de uma única célula de suspensão. </li><li> Recolher a placenta em um recipiente apropriado, como um tubo Falcon de 15 ml, com PBS 5% FCS e no gelo. Faça isso para todas as placentas dissecados. </li><li> Neste ponto, você pode prosseguir com a preparação de uma suspensão de uma única célula de citometria de fluxo, ensaios funcionais, tais como a cultura in vitro ou transplante, ou preparar placenta inteira para fixação do tecido e bloco congelado fixo incorporação de imuno-histoquímica eventual. </li></ol> 2. Preparação de uma única célula de suspensão de tecido placenta <ol><li> Vamos agora mostrar como gerar uma suspensão única célula da placenta para análise FACS. </li><li> Para preparar uma suspensão única célula da placenta, mecânica e dissociação enzimática é necessária. Primeiro preparar uma solução de colagenase 0,1% em PBS com 10% SFB e 1% de solução a penicilina / estreptomicina. </li><li> Adicionar um volume adequado de solução de colagenase a placentas, dependendo de quantos você tem. Um volume que é o dobro do volume de placenta e entre 2-5ml é recomendado. </li><li> Use uma agulha de 16 G montado em uma seringa de 5 ml para mecanicamente perturbar o tecido por passaging a solução de colagenase e da placenta através da agulha 3 vezes. Repita com uma agulha de 18-G. </li><li> Colocar a amostra a 37 ° C, 5% incubadora de CO 2 por 45 minutos. </li><li> Após a incubação de 45 minutos em colagenase, a passagem da célula solução através de uma agulha de 20 G, e incubar por mais 45 minutos, em 37 ° C. </li><li> Após a incubação 1,5 hr total em colagenase, a passagem da célula solução a 22-G e 25-G agulhas 3 vezes com cada agulha. </li><li> Filtrar a amostra através de um filtro 50 mícrons anexado a um novo tubo Falcon de 15 ml, lavar com PBS FCS 5% e centrifugar a 4 ° C durante 5 minutos a 300 × g. </li><li> Neste ponto, temos uma única célula de suspensão adequado para FACS análise ou ensaios funcionais. </li></ol> 3. Fixação de tecidos para as secções congeladas <ol><li> Imediatamente após o isolamento da placenta de cada embrião, eles são colocados no frio 1X PBS. Normalmente, uma placa de 96 poços funciona melhor para placentas jovens (E8.5-11.5), mas com placentas mais velhos, E12.5 e mais velhos, uma placa de 24 poços pode ser mais conveniente. </li><li> Cada placenta é transferido para um novo poço cheio de recém descongelados paraformaldahyde 4% ou PFA. Para E12.5 placentas, o tecido é movido para um novo poço com a mão, mas para o E10.5 você pode remover o PBS cuidadosamente com uma pipeta e adicione o PFA. É importante que a placenta está totalmente imersa por 2-4 horas a 4 ° C, dependendo da idade e tamanho do tecido. </li><li> Transferir o tecido em sacarose 30%, ou se os tecidos são muito pequenos e frágeis, aspirar o PFA e adicione a sacarose diretamente. Nesta fase, as placentas estará flutuando em solução. Deixe os tecidos pernoite a 4 ° C.</li><li> Após a etapa durante a noite em sacarose 30%, os tecidos devem em última instância, desceria ao fundo do poço, indicativo de criopreservação apropriado. Retire metade da solução de sacarose e substituir o volume com outubro e coloque o tecido de volta em 4 ° C por 1-2 horas. Isso facilita a penetração de outubro </li><li> Transfira o tecido para outubro 100% por 1 hora, após o que pode ser incorporado. </li></ol> 4. Incorporação do tecido fixado <ol><li> Moldes de plástico com etiqueta de identificação de tecido apropriado (exemplo molde show). </li><li> Puxe o tecido para fora da solução outubro e cortar pela metade a placenta orientando a placenta em forma de disco com o lado do cordão umbilical para baixo e, cuidadosamente, cortando com uma lâmina limpa certificando-se de mover a lâmina frente e para trás antes de liberar a pressão para garantir um mesmo corte. A placenta é cortado ao meio para alcançar os melhores prientation mais tarde visualizar os HSCs placentária. </li><li> Coloque metade placenta outra na parte inferior do molde com a borda de corte em contato com a superfície inferior do molde. Repita o procedimento com um novo molde para a outra metade. Para E10.5 placentas, ambas as metades podem ser colocados no mesmo molde usando a mesma técnica. </li><li> Quando vazar outubro no molde, pode ser difícil manter o placentas na orientação correta. Assegurar a placenta no lugar, segurando a metade do tecido com uma pinça. Lentamente, deitar solução outubro no molde e evitar a produção de todas as bolhas. Para E10.5 placentas, segure uma metade do tecido por uma pinça e descansar a metade outro tecido contra a parte externa do fórceps. Lentamente, deitar outubro solução como descrito para E12.5 placentas. </li><li> Uma vez que o molde é preenchido com outubro, rapidamente colocar o molde em gelo seco, a OCT vai virar flash branco congelamento do tecido </li><li> Coloque o molde em um pequeno saco de plástico contendo Drierite e imediatamente armazenar no freezer -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li>
<li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li>
</ol>

Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo irá permitir isolamento e visualização do tecido placentário e tronco hematopoiéticas e células progenitoras. Para um resumo abrangente sobre a produção de celulares espera e número de HSCs na placenta e outros órgãos hematopoiéticos fetal durante o desenvolvimento fetal nos referimos a Gekas, et al. 2005. Para localização de HSCs desenvolvimento e outras células hematopoiéticas na placenta nos referimos a Rhodes, et al. 2008.

Lista de materiais: A glicose 100mM 10mM NaN3 15 ml tubos cônicos (BD) 16-G, 18-G, 20-G, 22-G e 25-G agulhas (BD) Solução de sacarose 30% Pratos Petri 35 milímetros (BD) Paraformaldeído 4% 50 - m filtros celular (Celltrics) 5 ml seringas (BD) Fosfatase alcalina Substrato Kit I (Red Vector, Vector) Fosfatase alcalina Substrato Kit III (Vector Azul, Vector) Solução (Penicilina / Estreptomicina, P / S) de antibióticos Colagenase tipo I (Sigma) Moldes Vinyl Cryomold descartáveis ​​amostras (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek) Citoqueratina anticorpo primário (DakoCytomation) Pinça de dissecção, aço inoxidável ou titânio, número 5 ou 55 Drierite De soro fetal bovino (FBS) Plastic Fisherbrand Microscope Slides Mailer (Fisher) 1000u/ml glicose oxidase Levamisole (Vector) Montagem de mídia, meio aquoso baseado em montagem (VectamountTM AQ) Normais soro de cavalo (Vector) Temperatura ideal de corte (OCT, Tissue-Tek) Peroxidase Substrato Kit DAB (Vector) Tampão fosfato salino (PBS) com Cálcio / Magnésio (w Ca2 + / Mg2 +) Tampão fosfato salino (PBS) sem cálcio / magnésio (w / o Ca2 + / Mg2 +) Box Deslize plástico (possui 100 slides) Tubos de plástico (PVC Nalgene 180 Autoclavável não-tóxico) Test Tube polipropileno de fundo redondo, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) Proteinase K 20mg/ml Solução (Amresco) Produtos Research International Corp Pap Super Pen HT Markers * Slide (2,5 mm, Fisher) Da cultura de tecidos tratados em forma de U (de fundo redondo) placas de 96 poços ou 24 poços (BD Falcon) Tween20, SigmaUltra (Sigma) Kit Amplification tiramida (Invitrogen) Vectastain ABC Fosfatase Alcalina Standard Kit (Vector) Vectastain ABC Padrão Elite Kit (Vector)

isolamento e análise de células-tronco hematopoéticas da placenta

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Células-tronco hematopoéticas (HSCs) têm a capacidade de se auto-renovar e gerar todos os tipos de célula das linhagens de sangue durante toda a vida de um indivíduo. Todos os HSCs surgem durante o desenvolvimento embrionário, após o qual o seu tamanho da piscina é mantido por auto-renovação divisões celulares. Identificar a origem anatômica do HSCs e os eventos críticos de desenvolvimento regular do processo de desenvolvimento HSC tem sido complicada como muitos sítios anatômicos participar durante a hematopoiese fetal. Recentemente, foi identificada a placenta como um órgão hematopoiético, onde grandes HSCs são gerados e ampliado em única nichos microambientais (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequentemente, a placenta é uma importante fonte de HSCs durante o seu surgimento e expansão inicial. Neste artigo, vamos mostrar técnicas de dissecção para o isolamento de placenta murino de E10.5 e E12.5 embriões, o que corresponde aos estágios de desenvolvimento do início do HSCs eo pico do tamanho da piscina HSC na placenta, respectivamente. Além disso, apresentamos um protocolo otimizado para dissociação enzimática e mecânica de tecido placentário em uma única célula de suspensão para uso em citometria de fluxo ou ensaios funcionais. Nós descobrimos que o uso de colagenase por uma única célula suspensão da placenta dá rendimentos suficientes de HSCs. Um fator importante que afeta o rendimento HSC da placenta é o grau de dissociação mecânica antes e duração, o tratamento enzimático. Nós também fornecemos um protocolo para a preparação de fixo congelado secções de tecido placentário para a visualização do desenvolvimento de HSCs por imuno-histoquímica em seus nichos precisa celular. Como hematopoiéticas antígenos específicos não são preservadas durante a preparação das seções incluídos em parafina, que usam rotineiramente fixo cortes congelados para localizar HSCs placentária e progenitores.

Nós identificamos a placenta como um órgão hematopoiético importante durante o desenvolvimento. Descobrimos que as células-tronco hematopoéticas (HSCs) são gerados e se expandiu na placenta em única nichos microambientais. Aqui, descrevemos as técnicas experimentais necessárias para o isolamento e visualização de HSCs na placenta mouse.

Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

As células-tronco hematopoiéticas (CTHs) possuem a capacidade de se autorrenovarem e de gerar todos os tipos celulares das linhagens sanguíneas ao longo da vida de um indivíduo. ...

Olá, eu sou Mikkola e bem-vindo ao meu laboratório. O foco principal do nosso laboratório é investigar o desenvolvimento das células-tronco hematopoiéticas. Durante a embriogênese, identificamos a placenta como um órgão hematopoiético importante e descobrimos que as células-tronco hematopoiéticas são geradas e expandidas na placenta em nichos microambientais únicos.Assim sendo, a placenta possui um valor imenso como fonte de células-tronco hematopoiéticas durante sua emergência e expansão inicial. Hoje, os membros do meu laboratório demonstrarão as técnicas experimentais necessárias para o isolamento de células-tronco hematopoiéticas da placenta e para a visualização de CTH em seus nichos microambientais únicos. Olá, sou Chriss Geka do laboratório da Dra. Hannah Mola, do Departamento de Biologia Celular e Desenvolvimento Molecular da UCLA.Hoje vou mostrar como dissecar a placenta de camundongo e como preparar uma suspensão de células isoladas do tecido placentário para análise por citometria de fluxo de células-tronco hematopoiéticas fetais. Eu sou Katrina Rhodes, e vou mostrar como preparar o tecido placentário para imuno-histoquímica. Então, vamos começar.Para começar, os embriõe

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Biologia

Este vídeo mostra como micro-dissecar o saco vitelino e aorta-gônadas-mesonefro região a partir de embriões e uso de citometria de fluxo para classificar as células-tronco hematopoiéticas.

Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas início de murino saco vitelino e AGM

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Duas técnicas de isolamento de gotículas lipídicas celulares a partir de 1) células de levedura e 2) placentas humanas estão apresentadas. A peça central de ambos os processos é a centrifugação de gradiente de densidade, onde a camada flutuante resultante contendo as gotículas podem ser facilmente visualizadas por olho, extraiu-se, e quantificada por análise de Western Blot quanto à pureza.

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

Descrito aqui é um protocolo para isolar e estudar mais detalhadamente os leucócitos infiltrantes da decídua basal e decídua parietalis - a interface materno-fetal humana. Este protocolo mantém a integridade dos marcadores de superfície celular e produz células viáveis suficientes para aplicações a jusante, conforme comprovado pela análise de citometria de fluxo.

Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Descrito aqui é um protocolo para isolar e analisar os leucócitos infiltrantes de tecidos na interface materno-fetal (útero, decídua e placenta) de camundongos. Este protocolo mantém a integridade da maioria dos marcadores de superfície celular e produz células viáveis suficientes para aplicações a jusante, incluindo análise de citometria de fluxo.

Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

Descreve-se aqui métodos para a dissecação de tecidos fetais e maternas de placenta humana, seguido por isolamento e expansão de células estaminais mesenquimais / estroma (MSC) a partir desses tecidos.

Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

Aqui, apresentam-se um protocolo para a dissecção de cordão umbilical humano (UC) e a amostra da placenta fetal em cordão de revestimento (CL), geleia de Wharton (WJ), junção de cabo-placenta (CPJ), e na placenta fetal (FP) para o isolamento e caracterização de células estromais mesenquimais (MSCs), utilizando a técnica de cultura de explante.

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

O objetivo do presente protocolo é isolar as células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical. Algumas das aplicações incluem o uso dessas células como um biomarcador para identificar pacientes com risco cardiovascular, tratamento de doenças isquêmicas, e criando engenharia de tecido vascular e coração válvula de construções.

Isolamento de células progenitoras endoteliais de sangue humano do Cordão Umbilical

Este protocolo demonstra um método para o isolamento de células de decidual humanas primários coletados de membranas fetais de placentas de termo que podem ser usadas para uma variedade de aplicações (ou seja, imunocitoquímica, citometria de fluxo, etc.) com o objetivo para estudar o papel das populações de células diferentes em complicações na gravidez.

Isolamento de células humanas primárias do Decidual de membranas fetais de termo placentas

Apresentamos um protocolo passo a passo para o isolamento de células-tronco hematopoéticas de longa duração (CT-HSCs) e CTHs de curta duração (CTH-ST) utilizando o sistema repórter Hoxb5.

Método de Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas de Longa e Curta Duração

Aprenda a isolar e analisar células-tronco hematopoéticas da placenta murina. Este método demonstra técnicas experimentais para visualizar HSCs em seus nichos microambientais únicos durante a embriogênese.

Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

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