Trypsinizing e Subcultura células de mamíferos

Tecnologia de cultura de tecidos Encontrou ampla aplicação no campo da biologia celular. No entanto, as células cultivadas requerem manutenção regular para se manterem saudáveis. À medida que as células atingem a cofluência, elas devem ser subcultivadas ou passadas.

Não fazer isso resulta em crescimento reduzido e, eventualmente, morte celular. Neste vídeo, demonstramos como manter células de cultura de tecidos para linhagens celulares aderentes e em suspensão. Olá, sou Ricky aqui no Laboratório do Dr.LAN na Rede de Laboratórios de Patologia Molecular no leste do Tennessee.

Hoje quero mostrar a vocês duas técnicas para embalar células em suspensão e aderentes. Para passar um prato de células. Queremos começar com uma cultura primária cultivada até a cofluência em uma placa de Petri de 60 milímetros ou um frasco de cultura de tecidos quadrado de 25 centímetros contendo cinco mils de meio de cultura de tecidos.

Começamos removendo todo o meio da cultura primária com a pipeta estéril. Em seguida, lavamos a monocamada de células aderentes uma ou duas vezes com um pequeno volume de 37 graus Celsius HBSS sem cálcio e magnésio. Para remover qualquer soro fetal bovino residual que possa inibir a ação da enzima tripsina que será adicionada na próxima etapa.

Em seguida, adicione solução de tripsina EDTA quente suficiente à cultura para cobrir a camada celular aderente. Em seguida, você pode colocar o prato em uma bandeja de aquecimento de 37 graus Celsius por um a dois minutos. Após a incubação, bata o fundo da placa em uma superfície plana para desalojar as células.

Verifique a cultura com um microscópio invertido para ter certeza de que as células estão arredondadas para cima, o que indica que elas estão separadas da superfície. Se as células não estiverem suficientemente destacadas, retorne a placa à bandeja de aquecimento por mais um ou dois minutos. Depois de examinar o escopo, lave o prato em meio completo e pipete a suspensão em um tubo cônico de 15 mil contendo dois mils de meio completo.

Gire as células para baixo para pellet e ressuspenda o pellet em meio completo. Agora, adicione um volume igual de suspensão celular a cada uma das placas frescas que foram devidamente rotuladas. Alternativamente, as células podem ser contadas usando um hemocitômetro e diluídas até a densidade desejada para que um número específico de células possa ser adicionado a cada placa.

Certifique-se de rotular cada placa com a data da subcultura e o número da passagem. Depois de adicionar a suspensão celular, coloque um mil de meio fresco para cada nova cultura. Agora incube as placas em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius 5% CO2.

Depois de incubar as células durante a noite, adicione meio fresco às placas e coloque-as de volta a 37 graus. Uma vez que a placa tenha crescido até a confluência, você pode passar a placa novamente repetindo este procedimento e continuar a passagem conforme necessário. Agora vamos mostrar como passar células em cultura de suspensão.

O empacotamento de células em cultura em suspensão é mais simples do que para células de aderência. Antes de embalar as culturas em suspensão, as células devem ser mantidas alimentando-se a cada dois ou três dias até atingirem a cofluência, que é quando as células se aglomeram na suspensão e o meio parece turido. Quando o frasco é agitado.

Para isso, retire o frasco de células em suspensão da incubadora, tomando cuidado para não perturbar as que se depositaram no frasco. Retirar assepticamente e eliminar cerca de um terço do meio do balão e substituí-lo por um volume igual de meio pré-aquecido a 37 graus Celsius. Depois de trocar o meio, gire o frasco e devolva-o à incubadora, que está a 37 graus Celsius, 5% de CO2.

Se houver menos de 15 mils, um meio no frasco incuba o frasco na posição horizontal para aumentar o contato da célula com o meio. Caso contrário, o frasco pode ser incubado verticalmente nos dias em que as culturas não estão sendo alimentadas. Verifique-os girando os planos para ressuspender as células.

Certifique-se de observar quaisquer mudanças de cor no meio que indiquem um bom crescimento metabólico. Uma vez que as culturas sejam confluentes, o que deve ser cerca de 2,5 milhões de células por mil, você pode passá-las. Mais uma vez, acabamos de mostrar como passar células cultivadas para culturas aderentes e em suspensão.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com todos os seus experimentos.