Name: Trypsinizing e Subcultura células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-12T13:28:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Aprenda técnicas de subcultura para células aderentes e em suspensão usando tripsina e meio de cultura. Este método demonstra como manter a viabilidade celular e prevenir a morte celular por confluência excessiva em laboratório.

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O protocolo de texto completo para essa abordagem experimental está disponível em <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract" target="_blank">protocolos atuais em biologia celular</a> .

Os autores não têm nada a declarar.

trypsinizing e subcultura células de mamíferos

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Como células atingir confluência, eles devem ser repicadas ou várias passagens. Falta de subcultura resultados confluentes células do índice mitótico reduzido e, eventualmente, na morte celular. O primeiro passo na subcultura é para separar as células da superfície do vaso cultura primária por tripsinização ou meios mecânicos. A suspensão celular resultante é então subdividida, ou reseeded, em culturas frescas. Culturas secundárias são verificados para o crescimento e alimentado periodicamente, e pode ser posteriormente subcultivadas para produzir culturas terciário. O tempo entre passaging de células varia com a linhagem de células e depende da taxa de crescimento.

Como células atingir confluência, eles devem ser repicadas ou várias passagens. Este vídeo vai demonstrar um procedimento para a subcultura ambos os aderentes e células em suspensão.

Trypsinizing e Subcultura células de mamíferos

À medida que as células atingem a confluência, elas devem ser subcultivadas ou passadas. A falha em subcultivar células confluentes resulta em um índice mitótico reduzido e, eventualmente, em...

A tecnologia de cultivo de tecidos tem encontrado ampla aplicação na área da biologia celular. No entanto, células cultivadas exigem manutenção regular para permanecer saudáveis. Quando as células atingem a confluência, devem ser subcultivadas ou repassadas.A falha em fazê-lo resulta em crescimento reduzido e, eventualmente, morte celular. Neste vídeo, demonstramos como manter células em cultura de tecidos, tanto para linhagens celulares aderentes quanto em suspensão. Olá, sou Ricky, do Laboratório do Dr. LAN, nas Instalações de Laboratórios de Patologia Molecular no Leste do Tennessee.Hoje quero mostrar a você duas técnicas para o envasamento de células em suspensão e células aderentes. Para repicar uma placa de células, devemos começar com um cultivo primário crescido até a confluência em uma placa de Petri de 60 milímetros ou em um frasco de cultura de tecidos de 25 centímetros quadrados contendo cinco mililitros de meio de cultura de tecidos.Iniciamos removendo todo o meio da cultura primária com a pipeta estéril. Em seguida, lavamos a monocamada de células aderidas uma ou duas vezes com um pequeno volume de HBSS a 37 graus Celsius sem cálcio e magnésio. Para remover qualquer soro bovino fetal residual que possa inibir a ação da enzima tripsina que será adicionada na próxima etapa.Em seguida, adicione quantidade suficiente de solução morna de tripsina-EDTA ao cultivo para cobrir a camada de células aderentes. Então, coloque a placa em uma bandeja aquecida a 37 graus Celsius por um a dois minutos. Após a incubação, bata suavemente na parte inferior da placa sobre uma superfície plana para desprender as células.Verifique o cultivo com um microscópio invertido para garantir que as células estejam arredondadas, o que indica que estão desprendidas da superfície. Se as células não estiverem suficientemente desprendidas, retorne a placa à bandeja aquecida por mais um ou dois minutos. Após observar pelo microscópio, lave a placa com meio completo e pipete a suspensão para um tubo cônico de 15 mil contendo dois mililitros de meio completo.Centrifugue as células para formar o pellet e reconstitua o pellet em meio completo. Agora, adicione um volume igual de suspensão celular a cada uma das placas novas que foram devidamente identificadas. Alternativamente, as células podem ser contadas usando um hemocitômetro e diluídas até a densidade desejada, de modo que um número específico de células possa ser adicionado a cada placa.Certifique-se de rotular cada placa com a data da subcultura e o número de passagem. Após adicionar a suspensão celular, coloque um mililitro de meio fresco em cada nova cultura. Incube, agora, as placas em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de CO₂.Após incubar as células durante a noite, adicione meio fresco às placas e coloque-as novamente a 37 graus. Assim que a placa atingir confluência, você pode repicar as células novamente repetindo este procedimento e continuar a repicar conforme necessário. Agora vamos mostrar como repicar células em cultura de suspensão.Cultivar células em suspensão é mais simples do que cultivar células aderentes. Antes de envasar culturas em suspensão, as células devem ser mantidas com alimentação a cada dois ou três dias até atingirem a confluência, momento em que as células se agregam na suspensão e o meio aparece turvo. Quando o frasco é agitado suavemente.Para fazer isso, retire o frasco com as células em suspensão do incubador, tomando cuidado para não perturbar aquelas que se depositaram no fundo do frasco. De forma asséptica, remova e descarte cerca de um terço do meio do frasco e substitua-o por um volume igual de meio pré-aquecido a 37 graus Celsius. Após a troca do meio, agite suavemente o frasco e devolva-o ao incubador, mantido a 37 graus Celsius e 5% de CO₂.Se houver menos de 15 mililitros, coloque o meio no frasco e incube o frasco em posição horizontal para aumentar o contato entre as células e o meio. Caso contrário, o frasco pode ser incubado na posição vertical nos dias em que as culturas não forem alimentadas. Verifique-os agitando suavemente as placas para ressuspender as células.Certifique-se de observar quaisquer alterações de cor no meio que indiquem bom crescimento metabólico. Quando os cultivos estiverem confluentes, o que deve corresponder a cerca de 2,5 milhões de células por mil, você poderá repicá-los. Mais uma vez, mostramos como repicar células cultivadas, tanto para cultivos aderentes quanto em suspensão.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte em todos os seus experimentos.

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Biology

Biologia

O micro-dissecados técnica de explantes é um método robusto e confiável para isolar proliferativa das células do músculo esquelético juvenil, adulto ou músculos embrionárias como fonte de células-tronco do músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células têm sido clonal para produzir derivados do músculo esquelético linhas de células-tronco usado para in vivo o transplante.

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Neste relatório, nós demonstramos um sistema para isolar e cultura de células de doadores da glândula mamária do mouse, e ortotopicamente transplante dessas células em ratos para analisar estroma destinatário: interações epiteliais durante o desenvolvimento do tumor mamário.

Transplante mamária de células estromais e células de carcinoma em camundongos C57BL/6J

Este vídeo demonstra uma técnica para estudar a localização in vivo de anticorpos específicos do tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor de camundongo. Após a injeção subcutânea de células cancerígenas em camundongos para a formação de tumores, são injetados anticorpos marcados com fluorescência que se ligam a receptores específicos do tumor, permitindo a avaliação in vivo da localização do anticorpo por meio de imagens.

Uma técnica para avaliar a localização in vivo de anticorpos específicos do tumor

O vídeo demonstra um ensaio para avaliar a atividade de sequestro autofágico em massa em células de mamíferos. Ele utiliza eletroporação para liberar proteínas citosólicas, incluindo lactato desidrogenase (LDH). As frações LDH sequestradas e LDH celular total são determinadas para avaliar o sequestro de LDH, fornecendo informações sobre a atividade geral de sequestro em massa.

Quantificando a atividade de sequestro autofágico em massa em células de mamíferos

Este vídeo demonstra um protocolo para isolar e cultivar células primárias do córtex cerebral do telencéfalo dorsolateral de embriões de camundongos.

Isolamento e Cultura de Células de Telencéfalos Dorsolaterais de Embriões de Camundongos

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Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Nós descrevemos os procedimentos de rotulagem e genotipagem de ratos recém-nascidos e gerando culturas neuronais primárias a partir deles. A genotipagem é rápido, eficiente e fiável e permite a extracção de ácido nucleico automatizado. Isto é especialmente útil para os ratos neonatally letais e suas culturas que exigem a conclusão prévia de genotipagem.

Rápido genotipagem dos animais Seguido por Estabelecer culturas primárias de neurônios do cérebro

O objetivo deste protocolo é isolar os queratinócitos epidérmicos da pele dorsal de camundongos adultos para uma variedade de aplicações a jusante, como biologia molecular, bioquímica, triagem de células ativadas por fluorescência e usos primários in vitro (por exemplo, clonogênicos queratinócitos).

Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro

Apresentamos uma técnica para estabilizar rapidamente complexos translacionais (biossíntese de proteínas) com formaldeído interligando em leveduras vivas e células mamíferas. A abordagem permite dissecar intermediários transitórios e interações dinâmicas de RNA:protein. Os complexos interligados podem ser usados em vários aplicativos a jusante, como em métodos de perfil baseados em sequenciamento profundo, microscopia e espectrometria de massa.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

A Biotinilação Iluminada Restrita por Localização específica (ALIBi) é um método optogeneticamente ativado inovador desenvolvido para marcar e purificar populações subcelulares de ribossomos para sequenciamento a jusante e análise proteômica.

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

Aprenda técnicas de subcultura para células aderentes e em suspensão usando tripsina e meio de cultura. Este método demonstra como manter a viabilidade celular e prevenir a morte celular por confluência excessiva em laboratório.

Trypsinizing e Subcultura células de mamíferos

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