Congelamento, descongelamento e Células de embalagem para transporte
2 de julho de 2008
Cultura de células de mamíferos são amplamente utilizados em estudos de biologia celular. Este vídeo descreve as habilidades básicas necessárias para congelar e armazenar as células e como recuperar estoques congelados.
Os cultivos celulares são utilizados em uma ampla variedade de aplicações de pesquisa e diagnóstico. Às vezes, é desejável armazenar linhagens celulares para trabalhos futuros, a fim de preservar as células, evitar a senescência, reduzir o risco de contaminação e minimizar os efeitos da deriva genética. As linhagens celulares podem ser congeladas para armazenamento de longo prazo.
Neste vídeo, mostramos como congelar células cultivadas tanto em monocamada quanto em suspensão, e como descongê-las para crescimento novamente. Olá, sou Ricky, do laboratório do Dr. LAN, nas Instalações de Laboratórios de Patologia Molecular no Leste do Tennessee. Hoje vou mostrar como congelar células para armazenamento de longo prazo e como descongê-las do nitrogênio líquido.
Para congelar células aderentes humanas, comece por destacá-las da placa como faria caso estivesse preparando-as para o congelamento. Lembre-se de que é melhor utilizar células na fase logarítmica de crescimento para criopreservação. Após as células terem se destacado e você ter interrompido a reação da tripsina adicionando soro ou meio contendo soro, transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga estéril e acrescente dois mililitros.
O meio completo com soro de células de três ou mais placas da mesma subcultura da mesma origem pode ser combinado em um único tubo. Centrifugue as células por cinco minutos a 300–350 Gs em temperatura ambiente. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mL a quatro graus Celsius.
Meio completo, adicione um volume igual de meio de congelação a quatro graus, misture bem as células e, em seguida, coloque o tubo no gelo para contagem celular. Utilizando um hemocitômetro, dilua a suspensão com mais meio de congelação para obter uma concentração final de 1 milhão ou 10 milhões de células por mililitro. Para congelar células de um frasco quadrado de 25 centímetros quase confluente, ressuspenda-as em aproximadamente três mililitros de meio de congelação e pipete alíquotas de um mililitro da suspensão celular para frascos criogênicos de dois mililitros previamente identificados.
Certifique-se de apertar bem as tampas dos frascos. Coloque os frascos por uma hora a durante a noite em um congelador a menos 80, depois transfira-os para um congelador de armazenamento em nitrogênio líquido. O congelamento de células de cultura em suspensão é semelhante, em princípio, ao congelamento de células de uma monocamada.
A principal diferença é que os cultivos em suspensão não precisam ser tripsinizados primeiro; transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga e centrifugue por 10 minutos a 300-350 ×g, em temperatura ambiente. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio de congelação a quatro graus, numa densidade de 1 milhão a 10 milhões de células por mililitro.
Em seguida, transfira alíquotas de um mililitro da suspensão celular para frascos criogênicos e congele. Como feito para os cultivos em monocamada, que foram demonstrados no capítulo anterior para descongelar e recuperar frascos congelados. Primeiro, retire o frasco com as células do freezer de nitrogênio líquido e coloque-o imediatamente em um banho-maria a 37 graus.
Agite o frasco continuamente até que o meio esteja descongelado, o que geralmente leva menos de 60 segundos. Após o descongelamento, limpe a parte superior do frasco com etanol 70% antes de abri-lo. Em seguida, transfira a suspensão de células descongeladas para um tubo de centrífuga estéril contendo dois mililitros de meio completo morno e 20% de soro bovino fetal.
Este passo por 10 minutos a 150-200 ×g, à temperatura ambiente. Esta etapa removerá qualquer DMSO residual após a centrifugação; descarte o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet celular em um pequeno volume, cerca de um mil, de meio completo com 20% de FBS, e transfira para uma placa de cultura devidamente rotulada, contendo a quantidade apropriada de meio. Geralmente, é necessário um mil de suspensão celular em cinco a 20 mils de meio.
Agora, você pode colocar as células em uma incubadora a 37 graus Celsius para crescerem após 24 horas. Você deverá garantir que as células tenham se aderido à placa após cinco a sete dias, ou quando o indicador de pH no meio mudar de cor, será necessário trocar o meio. Você deverá manter as culturas em um meio contendo 20% de FBS até que a linhagem celular seja reestabelecida.
Se a taxa de recuperação for extremamente baixa, apenas uma subpopulação da cultura original pode estar crescendo. Tenha especial cuidado com isso ao trabalhar com linhagens celulares conhecidas por serem mosaicas. Se as culturas precisarem ser enviadas, isso pode ser feito facilmente tanto para culturas em monocamada quanto em suspensão.
Em frascos de cultura de tecidos de 25 centímetros, as células são cultivadas até atingir quase a confluência em uma monocamada ou até a densidade desejada em suspensão. Para culturas em monocamada, o meio é primeiro removido e, em seguida, o frasco é preenchido com meio fresco. É essencial que o frasco seja completamente preenchido com meio para evitar que as células sequem caso os frascos sejam invertidos durante o transporte.
Para a suspensão, meio fresco é adicionado para preencher o frasco. A tampa é apertada e fixada no lugar usando parafina. O frasco é lacrado em um saco plástico à prova de vazamentos ou outro recipiente à prova de vazamentos projetado para evitar derramamentos.
No caso de o frasco ficar danificado, o recipiente primário é colocado em um recipiente isolado secundário para protegê-lo de temperaturas extremas durante o transporte. Um rótulo de perigo para o comprador é fixado na parte externa da embalagem. Geralmente, as culturas são transportadas na mesma noite ou no dia seguinte por couriers.
Acabamos de mostrar como congelar e descongelar culturas de células humanas, tanto para células aderentes quanto em suspensão. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte em todos os seus experimentos.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra técnicas essenciais para o congelamento e armazenamento de células de mamíferos cultivadas, bem como para a recuperação dessas células a partir de estoques congelados. O armazenamento adequado das células é crucial para preservar linhagens celulares para pesquisas futuras.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Técnicas de Cultura Celular
- Preservação Celular
Contexto
- Células de mamíferos cultivadas são amplamente utilizadas em pesquisas.
- O congelamento de células ajuda a evitar senescência e contaminação.
- O armazenamento de longo prazo de linhagens celulares é essencial para experimentos futuros.
- Técnicas de descongelamento são necessárias para reanimar células congeladas.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o processo de congelamento de células para armazenamento de longo prazo.
- Explicar como descongelar células congeladas para crescimento subsequente.
- Fornecer habilidades práticas para pesquisadores que trabalham com culturas celulares.
Métodos Utilizados
- Congelamento de células cultivadas em monocamada e em suspensão.
- Uso de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.
- Procedimentos de descongelamento para recuperação de células congeladas.
- Demonstração das técnicas em um ambiente laboratorial.
Resultados Principais
- Congelamento e armazenamento bem-sucedidos de células de mamíferos.
- Técnicas eficazes de descongelação demonstradas.
- Preservação da viabilidade celular após o descongelamento.
- Orientações sobre como evitar armadilhas comuns no armazenamento de células.
Conclusões
- As técnicas de congelamento e descongelamento são fundamentais para o trabalho com cultivo celular.
- Métodos adequados podem aumentar a longevidade das linhagens celulares.
- Essas habilidades são fundamentais para pesquisadores em biologia celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A preservação e recuperação confiáveis de células são fundamentais para manter modelos pré-clínicos consistentes e garantir a reprodutibilidade nos fluxos de trabalho de validação de alvos e desenvolvimento de ensaios. A criopreservação adequada minimiza a deriva genética e os riscos de contaminação, apoiando a integridade de linhagens celulares a longo prazo para pesquisas translacionais. Essas técnicas permitem o fornecimento escalonável e padronizado de células ao longo das fases de descoberta e pré-clínica, reduzindo a variabilidade em estudos mecanicistas e nos esforços de identificação de compostos promissores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a preservação de linhagens celulares geneticamente estáveis para análise consistente do engajamento de alvos e de vias metabólicas.
- Valor Operacional: Reduz a necessidade de subcultivos frequentes, minimizando a deriva fenotípica e a variabilidade experimental.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Fornece estoques celulares renováveis e de baixo número de passagens para triagens de alto rendimento e qualificação de ensaios reproduzíveis.
- Valor Operacional: Apoia a consistência entre lotes em ensaios baseados em células, melhorando a confiabilidade dos dados ao longo de campanhas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Garante a continuidade de modelos celulares relevantes para doenças, desde a descoberta até a validação pré-clínica.
- Valor Operacional: Facilita a distribuição padronizada de células entre equipes e locais, apoiando a colaboração multifuncional.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A criopreservação de células se integra ao continuum de descoberta ao permitir a obtenção confiável de células para validação de alvos, desenvolvimento de ensaios e testes pré-clínicos, assegurando a consistência do modelo em todas as etapas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao fornecer linhagens celulares estáveis e bem caracterizadas para validação de alvos e elucidação de vias metabólicas.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de estoques celulares padronizados e livres de contaminação, adequados para triagem reprodutível de compostos.
- Análises: Gera insumos celulares quantificáveis e consistentes que aumentam a confiabilidade dos resultados de resposta à dose e viabilidade celular.
- Pesquisa Translacional: Mantém a fidelidade do modelo desde as fases iniciais de descoberta até estudos pré-clínicos, reduzindo os riscos biológicos no avanço de candidatos promissores.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade centralizada e reutilizável de bancos celulares que padroniza a origem das células em diferentes projetos e regiões geográficas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao minimizar a deriva genética e garantir consistência fenotípica em ensaios baseados em células.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio de protocolos padronizados de congelação, descongelação e embalagem.
- Valor Estratégico: Reduz o risco de falhas em estágios avançados ao assegurar modelos pré-clínicos confiáveis e saídas biológicas consistentes.
- Impacto no Portfólio: Permite tomadas de decisão ajustadas ao risco ao fornecer sistemas celulares confiáveis para validação de alvos e otimização de compostos líderes.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em técnica asséptica e manipulação de crioprotetores para manter a viabilidade celular.
- Depende do acesso a equipamentos de congelamento com taxa controlada e infraestrutura de armazenamento em nitrogênio líquido.
- Necessita de procedimentos operacionais padronizados entre as equipes para garantir taxas consistentes de recuperação celular.
- Requer adaptação do meio de congelamento e da densidade celular com base no tipo celular e nas características de crescimento.
- Limitado pela sensibilidade da linhagem celular a crioprotetores e ao estresse de congelação-descongelação, o que pode afetar a eficiência de recuperação.
