Name: Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-25T18:13:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprenda a cultivar células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea de camundongo. Este método demonstra isolamento, diferenciação in vitro e análise por citometria de fluxo para estudos de imunologia e desenvolvimento de vacinas.

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JB é apoiada por bolseiros das Ciências Naturais e Engenharia do Conselho (NSERC). Apoio para este projeto foi fornecido pela Canadian Institutes of Health Research, Grant MOP-67066.

Este protocolo foi adaptado de Lutz et al 1. Colheita e processamento de medula óssea <ol><li> Isolamento da tíbia e fêmur: Euthanize o mouse doador e pulverizar as pernas com etanol 70%. Segure o tornozelo primeiro firmemente com uma pinça sem corte e começar a cortar a pele e musculatura subjacente para expor a tíbia. Para evitar danos ao osso, cortados de forma lenta e paralelamente à tíbia, deixando intacta a articulação do joelho. Para limpar o fêmur, imobilizar a articulação do joelho, segurando com uma pinça sem corte. Limpe a musculatura com um par de tesouras e pinças curvas. Continue para cima até que a articulação do quadril é exposto e tesoura pode ser colocado entre a cabeça do fêmur e do quadril. Retire os ossos, cortando entre o fêmur ea articulação do quadril e coloque em tampão fosfato salino (PBS) no gelo. </li><li> Remoção de medula óssea: Limpe musculatura restantes dos ossos usando tesouras e pinças curvas. Cortar as epífises de cada osso e localizar a cavidade central. Usando uma seringa de 10 ml carregado com PBS e uma 25G0.5 agulha &quot;, lave a medula óssea em uma placa de Petri não-tecido revestido. </li><li> Processamento de medula óssea: Use a ponta de borracha do êmbolo de uma seringa de 1ml para dissociar a medula óssea em uma suspensão de uma única célula (use um para cima e para baixo, não raspagem de movimento). Colete de medula óssea em um tubo falcon cônica, e enxágüe da medula óssea residual com PBS. </li></ol> Cultura de células dendríticas <ol><li> Ressuspender as células em DC mídia e precursores contar DC em um hemocitômetro (Figura 1). Você vai ver as células de tamanhos variados; os precursores DC são as maiores e mais brilhantes. Diferencialmente contar apenas essas células. A partir de dois fêmures e duas tíbias de um tipo selvagem C57BL / 6 mouse (6-8 semanas de idade), você deve esperar entre 25-40 x 10 6 precursores DC total. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_3/article769_figure_1.jpg" alt="" width="218" height="217" /> Figura 1 </li><li> Células de cultura a uma densidade de 2 x 10 5 precursores DC / DC mL em meio suplementado com 40 ng / mL recombinante murino GM-CSF. Células em placa não-tecido revestido placas de Petri de poliestireno. </li></ol> Adicionar mídia (dia 3) Para atualizar os meios de comunicação, adicione metade do volume total de mídia fresco suplementado com 40 ng / mL GM-CSF. Substituir um terço dos meios de comunicação (dia 6) e maturação Para atualizar os meios de comunicação, remova cuidadosamente um terço do volume total dos meios de comunicação e substituir esse volume com a mídia fresco DC suplementado com 40 ng / mL GM-CSF no dia 6 de cultura. Se desejar, células dendríticas podem ser estimuladas para a maturação usando citocinas ou ligantes toll-like receptor. No vídeo, DCs foram maturados por estimulação durante a noite com 5 ng / mL CpG. Colheita de células dendríticas Cultura DC está completo (Figura 2). Células serão tanto em suspensão e frouxamente aderido à placa. Células aderidas pode ser removido raspando o prato com um raspador de cultura de tecidos e lavagem com PBS. O número total de células aumenta 5-8 vezes durante a semana de cultura e período de diferenciação, portanto, esperar para colher 1-1,6 x 10 6 células / mL. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_5/article769_figure_2.jpg" alt="Figura 2" width="407" height="358" /> Figura 2 Reagentes <ol><li> DC media <ol><li> RPMI-1640 mídia, suplementado com: </li><li> 10% de soro fetal bovino </li><li> 100 UI / mL de penicilina </li><li> Estreptomicina 100 mg / mL </li><li> 1% L-glutamina </li><li> 0,1% 2-mercaptoetanol </li><li> 1X não-aminoácidos essenciais </li><li> 1X piruvato de sódio </li></ol></li><li> Recombinante murino GM-CSF <ol><li> rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, nenhum catálogo. 315-03) </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">DC-based cancer vaccines.</a> J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).</li>
</ol>

DCs são úteis para estudos de interações inata e adaptativa imune, e pode ser utilizado como um vetor de vacina. Neste vídeo, demonstramos os passos para isolar medula óssea e mielóide diferenciar células dendríticas in vitro. Após o período de cultura, essas células podem ser visualizados ao microscópio ambas as células como aderentes, que muitas vezes possuem dendrites, e células não-aderentes rodada. Os DCs pode ser ainda mais manipulados para apresentação de antígenos por pulsando com antígeno ou estimulados para a produção de citocinas...

<table><tbody><tr><td>GM-CSF murino recombinante</td><td>Reagente</td><td>Peptrotech</td><td>315-03</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Mielóide células dendríticas (DCs) são frequentemente usados ​​para estudar as interações entre inata e adaptativa mecanismos imunológicos e da resposta inicial à infecção. Porque estes são os antígenos mais potentes células apresentadoras, as DCs são cada vez mais usado como um vetor de vacina para estudar a indução do antígeno específico respostas imunes. Neste vídeo, demonstramos o procedimento para a colheita tíbias e fêmures de um camundongo doador, o processamento da medula óssea e diferenciando DCs in vitro. As propriedades de mudança DCs após a estimulação: células dendríticas imaturas são fagócitos potente, enquanto DCs maduras são capazes de apresentação de antígenos e interação com CD4 + e CD8 + T. Essa mudança na atividade funcional corresponde à regulação alta de marcadores de superfície celular e produção de citocinas. Muitos agentes podem ser usados ​​para DCs maduras, incluindo citocinas e ligantes toll-like receptor. Neste vídeo, demonstramos comparações de citometria de fluxo da expressão de duas moléculas co-estimulatórias, CD86 e CD40, e citocinas, IL-12, após a estimulação durante a noite com o tratamento CpG ou mock. Depois de diferenciação, DCs pode ser ainda mais manipulado para uso como um vetor de vacina ou para gerar antígeno-específicos respostas imunológicas in vitro por pulsos utilizando peptídeos ou proteínas, ou transduzidas utilizando vetores virais recombinantes.

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

As células dendríticas (DCs) mieloides são frequentemente utilizadas para estudar as interações entre os mecanismos imunes inatos e adaptativos e a resposta precoce a...

Meu nome é Jeanette Boudreaux, e hoje gostaria de mostrar os passos para cultivar células dendríticas mieloides com espelhamento a partir de precursores da medula óssea. A linhagem de DC mieloides está sendo cada vez mais valorizada em estudos sobre a interação entre imunidade inata e adaptativa, além de ser crescentemente utilizada como plataforma para o desenvolvimento de vacinas. Hoje vamos demonstrar os passos para isolar as células precursoras, colocá-las em cultura e diferenciá-las em células dendríticas.Em seguida, mostrarei uma análise por citometria de fluxo das células antes e após a maturação. Com o ligante do receptor tipo toll, as células proliferam in vitro durante o período de cultura, portanto, espera-se um aumento de cinco a oito vezes no número total de células em comparação com os precursores que você colocou no dia zero. Os procedimentos que mostrarei hoje serão demonstrados em uma bancada de laboratório aberta, mas, para manter a esterilidade, recomendo realizar suas culturas em uma câmara de segurança biológica ou em uma capela de fluxo laminar.Para começar, você precisará de uma seringa de 10 mil com uma agulha de 25 gauge preenchida com PBS, um par de pinças

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Apresentação de antígenos em órgãos linfóides secundários pelas células dendríticas é crucial para o início da célula T mediada resposta imune adaptativa. Aqui demonstramos a cultura de medula óssea células dendríticas derivadas de camundongos, ativação e de rotulagem para os dois fótons de imagem.

Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

Este vídeo descreve um protocolo para a geração de células dendríticas - células-chave apresentadoras de antígenos que ativam as células T - da medula óssea de um camundongo adulto.

Geração de células dendríticas derivadas da medula óssea: um método para gerar células dendríticas a partir da medula óssea de camundongos

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para gerar células dendríticas plasmocitoides (pDCs) a partir de células progenitoras linfóides comuns (CLPs). Após a co-cultura de CLPs purificados com células alimentadoras irradiadas com γ na presença de ligante tirosina quinase-3 (FL) semelhante a Fms, os CLPs se diferenciam em pDCs não aderentes, cuja presença é confirmada por citometria de fluxo.

Geração in vitro de células dendríticas plasmocitoides a partir de progenitores linfóides comuns

As células dendríticas imaturas podem ser diferenciadas seletivamente em células dendríticas tolerogênicas ou maduras para regular o equilíbrio entre imunidade e tolerância. Este trabalho apresenta um meio de gerar a partir de células dendríticas derivadas de monócitos imaturos (moDCs), moDCs tolerogênicas in vitro e maduras que diferem em fenótipos metabólicos.

Geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos Metabolic

Células da medula óssea cultivadas com fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF) geram uma cultura heterogênea contendo macrófagos e células dendríticas (DCs). Este método destaca o uso da ligação de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar macrófagos das DCs na cultura GM-CSF. Os macrófagos nesta cultura têm muitas semelhanças com os macrófagos alveolares.

Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

Aqui, demonstramos como os monócitos são isolados por separação de esferas magnéticas de células mononucleares do sangue periférico após centrifugação por gradiente de densidade de sangue anticoagulado humano. Após a incubação por 5 dias, os monócitos humanos são diferenciados em células dendríticas imaturas e estão prontos para procedimentos experimentais em um ambiente não clínico.

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Aqui nós fornecemos um método para identificar e isolar um grande número de GM-CSF dirigido pilhas myeloid usando a classificação de células de alta velocidade. Cinco populações distintas (comuns progenitores mieloides progenitoras granulócitos/macrófagos, monócitos, macrófagos derivados de monócitos e DCs derivados de monócitos) podem ser identificadas com base na expressão Ly6C e CD115.

Geração de um grande número de progenitores mieloides e células dendríticas precursores de murino medula óssea usando um celular romance classificação estratégia

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Aqui, descrevemos as condições de cultivo in vitro , isolamento e aumento da geração de vesículas extracelulares (EVs) de Echinococcus granulosus. Os pequenos EVs foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão. A captação por células dendríticas derivadas da medula óssea e sua modulação fenotípica foram estudadas por meio de microscopia confocal e citometria de fluxo.

Isolamento e captação de células dendríticas de pequenas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Aprenda a cultivar células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea de camundongo. Este método demonstra isolamento, diferenciação in vitro e análise por citometria de fluxo para estudos de imunologia e desenvolvimento de vacinas.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

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