De célula inteira Recordings of Light Evocados Excitatórios Correntes Synaptic na Slice Retinal

Hoje vou mostrar como preparar fatias retinianas da salamandra tigre para gravações de patch clamp. Primeiro, prepararei dois tipos de lâminas de microscópio. Usamos lâminas que possuem um adesivo bem preso a elas para que possamos usá-las como câmaras de fluido.

No primeiro slide, coloco duas bandas paralelas de graxa a vácuo. Em seguida, pego um pouco de papel de filtro e corto em pedaços retangulares com um aumento de luz. Agora coloco uma das peças nos trilhos de graxa e empurro para baixo para que fique bem presa ao slide.

Eu faço o mesmo para a outra peça. O segundo tipo de slide tem pequenos blocos de borracha colados a ele. Por enquanto, eu apenas adiciono um pouco de graxa a vácuo Entre os blocos, também coloco um novo pedaço de lâmina de barbear no cortador de tecido.

Finalmente, apresentei as ferramentas de que precisarei durante a dissecação, que são dois pares de pinças, uma tesoura e uma ferramenta para remover o olho da cabeça para registrar as correntes evocadas pela luz. Deve-se realizar a dissecação sob luz infravermelha, mas para fins de demonstração, agora trabalharei na luz. Primeiro removo o olho e coloco o microscópio em um pedaço de papel de seda, que umedeci com solução de ringer gelada.

Em seguida, removo o tecido conjuntivo extra do globo ocular para ter certeza de que não danificará o olho. Eu sempre corto ao longo da superfície. Isso é o que você vê através do microscópio.

Em seguida, uso uma lâmina de barbear para fazer uma pequena fenda na córnea. Para fazer isso, eu seguro o olho com a pinça enquanto empurro para baixo a borda da lâmina de barbear na córnea. Em seguida, seguro a córnea com minha pinça enquanto a removo com a tesoura para retirar a lente.

Coloquei um pouco de pressão nas bordas da ocular para poder acessar facilmente a lente com minha pinça. Em seguida, removo a íris. Eu seguro a íris com a pinça enquanto corto ao longo da aura serato até que apenas a ocular permaneça.

Em seguida, cortei o copo I em dois pedaços retangulares. Primeiro cortei ao meio e depois apare as bordas superior e inferior. Agora eu pego um dos slides que preparei anteriormente, pego um pedaço de copo I e coloco com o lado retina voltado para baixo no papel de filtro.

Em seguida, puxo essa esclera para que apenas a retina permaneça na lâmina. Depois disso, acrescento rapidamente, toque nossa solução para a câmara. Vamos repetir O procedimento para o segundo pedaço de retina.

Mas desta vez você pode assistir através do microscópio enquanto coloca a retina no papel de filtro. Eu uso a pinça na minha mão esquerda para empurrar cuidadosamente a esclera. Finalmente, cortei a retina em fatias de 200 a 300 micrômetros de largura.

Em seguida, escolho uma fatia para usar em meus experimentos. Para escolher uma boa fatia, preciso girar as fatias em 90 graus para poder ver as camadas da retina. Eu escolho uma fatia que parece intacta e mostra faixas horizontais distintas indicando as diferentes camadas.

Para mover os slides de um slide para outro, crio uma ponte de toque e, em seguida, movo cuidadosamente os slides pela solução. Quando coloco a fatia, empurro-a contra os blocos de borracha para que o papel de filtro fique orientado verticalmente em relação ao vidro. Agora estou pronto para a gravação do patch clamp.

Armazenamos a solução intracelular em pequenas porções no freezer para que só vejamos a quantidade que realmente precisamos em um dia. Antes de encher os eletrodos, filtramos a solução para remover pequenas partículas que podem registrar a ponta do eletrodo. Os eletrodos de remendo são retirados do vidro capilar de silicato de broca para registrar as células ganglionares.

Eu escolho um puxar uma configuração que produzirá resistências de eletrodo entre dois e quatro mega ohms. Quando encho os eletrodos, quero ter certeza de que não há bolhas de ar na ponta do eletrodo. Sacudir o copo com o dedo ajuda a remover bolhas.

Este é o suporte do eletrodo preso ao estágio da cabeça. O rolo elétrico contém um fio de cloreto de prata. Este é o eletrodo de aterramento com uma ponte niga.

Aqui está a pipeta de perfusão. Ele está conectado a um sistema de microperfusão de oito canais. A perfusão principal é impulsionada pela gravidade, então é apenas uma garrafa cheia de alas, e a solução desce por esse tubo até a câmara de gravação.

Para poder gravar no escuro, tenho uma câmera IR conectada à porta lateral do microscópio, que está conectada a uma tela de TV. Na porta superior, conectei um projetor de imagem, que me permite projetar estímulos visuais na retina. E, finalmente, o amplificador de grampo de remendo.

Agora coloco a fatia da retina sob o microscópio e adiciono o eletrodo de aterramento ao banho para configurar a profusão principal. E em seguida, adicione o tubo do sistema de profusão por gravidade. O tubo de vidro do outro lado é conectado à sucção a vácuo, o que mantém o nível do fluido constante.

Também me certifico de que um tubo de sucção esteja conectado ao ombro elétrico. Em seguida, posiciono a pipeta de microperfusão. Eu o abaixo no banho Seguindo com a objetiva do microscópio.

Quando chego perto da fatia, puxo-a um pouco para trás para que a solução atinja a fatia. Quando ligo a perfusão, devo ver a fatia se mover um pouco como aqui. Vamos agora procurar uma boa célula para gravar.

Estamos procurando células ganglionares, que estão na parte inferior da fatia. Agora eu preparo o eletrodo antes de entrar no banho com o eletrodo, adiciono um pouco de pressão positiva. Assim que encontrei o eletrodo sob o microscópio, abaixo-o à direita acima da fatia para remendar uma célula.

Mudei para a objetiva de 40 x. Agora eu zero a corrente de linha de base e verifico a resistência do eletrodo. O teste de vedação é uma sequência de pulsos de 10 milivolts, o que me ajuda a ver se estabeleci uma vedação firme entre o eletrodo e a célula.

Agora abaixo meu eletrodo na célula-alvo. Assim que vejo uma covinha no corpo da célula, libero a pressão positiva do tubo, o que estabelece uma vedação hermética. A resistência agora é tão alta que o traço atual parece plano.

Os pequenos picos são artefatos de capacitância do eletrodo. Estes podem ser compensados assim, então agora eles se foram. Então agora vou tentar invadir a cela.

Para fazer isso, coloquei cuidadosamente pequenos pulsos de sucção no tubo conectado ao ombro do eletrodo e, se tudo der certo, você verá o traço atual mudar assim. Os picos que você pode ver agora são atravessados pela capacitância da membrana e também podem ser compensados por isso agora é uma preparação que foi preparada no escuro. Vamos ver se podemos registrar respostas evocadas por luz.

O traço que você pode ver no osciloscópio é a resposta atual de uma tensão de célula ganglionar fixada em menos 60 milivolts. Os estímulos de luz que usamos são barras claras e escuras apresentadas em um fundo uniforme e estável. Nosso software de uso de laboratório mostra o registro completo de um teste.

Pode-se ver que esta é uma célula fora como uma resposta ao início de uma barra escura e ao deslocamento de uma barra brilhante. A linha branca na parte superior indica a duração do estímulo. Agora podemos realizar experimentos nos quais perfundimos diferentes agentes farmacológicos.

Por exemplo, podemos bloquear a inibição sinérgica GABAérgica e Gly. Depois de esperar menos de um minuto, geralmente podemos começar a ver os efeitos da droga aqui. A resposta tornou-se mais forte e prolongada.

A preparação da fatia de retina tem sido amplamente utilizada para registrar as correntes sinápticas de diferentes células da retina e, se alguém adicionar um corante fluorescente à solução do eletrodo, o tipo de célula pode ser facilmente confirmado. Anatomicamente, aqui usamos a salamandra larval TGA como modelo animal. O fato de as salamandras serem animais de sangue frio e possuírem grandes células da retina fornece condições de registro vantajosas, mas a mesma técnica pode ser aplicada a preparações de mamíferos.