Name: De célula inteira Recordings of Light Evocados Excitatórios Correntes Synaptic na Slice Retinal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:50:00.000+00:00
Duration: 19 min 33 s
Description: Aprenda a preparar fatias de retina de salamandra-tigre para gravações de patch clamp em neurociência visual. Este método demonstra técnicas de eletrofisiologia para estudar respostas sinápticas evocadas por luz em células ganglionares retinianas.

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Soluções <ul><li> Solução intracelular de células ganglionares (em mM): 100 K gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM Sulforhodamine B (para coloração), ajustada para pH = 7,4 com KOH </li><li> Solução intracelular de células bipolares (em mM): 90 K gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM Sulforhodamine B (para coloração), ajustada para pH = 7,4 com KOH </li><li> Solução de Ringer extracelular (em mM): 112 NaCl, Glicose 5, 5 HEPES, 2 KCl, CaCl 2 2, 1 MgCl 2, ajustada para pH = 7,75 com NaOH. Oxigenação da solução, não é necessário. </li></ul> Prepare câmaras de gravação Nossa câmara de gravação consiste de uma lâmina de microscópio com um adesivo bem em que blocos de silicone pequena cortada de um outro adesivo bem são colocados para dar estabilidade para as fatias de tecido. Preparação de fatias da retina Para evitar o branqueamento dos fotorreceptores, a dissecção é realizada à luz luz IR ou dim vermelho. Se alguém estiver interessado em gravar respostas da via vara, apenas a luz IR deve ser usada (IR microscópio de dissecação e nenhuma luz do quarto. Óculos de proteção adicional IR deve ser usada para procedimentos não realizados sob o microscópio). Se alguém está interessado principalmente na gravação de respostas cone de luz, a luz da sala escura vermelho ou um flash de luz vermelha podem ser usados. O microscópio, no entanto, ainda deve ter oculares IR. Se a entrada de fotorreceptores é irrelevante para o experimento, os procedimentos podem ser realizados em ambiente normal de luz usando um microscópio regular. <ol><li> Preparar duas lâminas de microscópio com um adesivo de silicone bem: criar duas faixas paralelas de graxa de silicone (cerca de 0,5 centímetros de distância) em cada slide e coloque um pedaço retangular de papel de filtro de um lado do slide, cruzando as duas bandas de graxa (push o filtro papel com parte de uma lâmina de barbear para que ele seja bem ligado ao slide) </li><li> Sacrifício uma salamandra de acordo com protocolos estabelecidos: o animal é colocado em um banho de gelo por 30 minutos, em seguida, decapitado e dê um duplo pithed. </li><li> Remover olhos da cabeça salamandra e colocá-la sob o microscópio de dissecação em um pedaço de lenço de papel umedecido com solução gelada de Ringer </li><li> Remover o tecido conjuntivo do olho </li><li> Use lâmina de barbear para fazer um pequeno corte na córnea </li><li> Segure corte da córnea com uma pinça, removendo-a com uma tesoura ao longo de sua ligação com o olho </li><li> Remova a lente com uma pinça </li><li> Segure a íris com uma pinça e corte ao longo da ora serrata para remover a íris </li><li> Cortar a ocular em dois pedaços retangulares </li><li> Pegue um dos pedaços e colocá-lo lado esclera em cima do papel de filtro (certifique-se de achatar a peça ao abaixá-la com muito cuidado) </li><li> Levante cuidadosamente a esclera fora da retina, que agora deve ser anexado ao papel filer </li><li> Adicionar rapidamente solução gelada de Ringer para o bem </li><li> Repita o mesmo para a segunda parte </li><li> Use uma lâmina de barbear colocado em um slicer feitos para cortar 200-300μm fatias de largura. </li><li> Use uma pinça para pegar as fatias ao lado do filtro de papel, entregá-los para as camadas da retina tornam-se visíveis, e colocá-los sobre as faixas de graxa de vácuo </li><li> Escolha uma fatia que se parece em bom estado e mostra faixas horizontais indicando as camadas da retina (as camadas são por vezes difíceis de ver sob o microscópio de dissecação como a ampliação não é alta o suficiente, porém, se pode reconhecer algumas camadas a fatia é geralmente suficiente. A decisão final sobre a possibilidade de usar o slice, no entanto, é feita uma vez que é visto sob o microscópio na posição vertical). Movê-lo para o slide câmara de gravação através da construção de uma ponte Ringer entre os dois slides </li><li> Verifique se o filtro de papel é empurrado contra os blocos de borracha na câmara de gravação para que a fatia não é inclinado (células ganglionares e fotorreceptores deve estar em foco ao mesmo tempo) </li></ol> Colocar o tecido na plataforma de gravação <ol><li> O slide de gravação é colocado sob o microscópio e perfundidos com soluções de Ringer através de uma perfusão syste gravidade </li><li> A preparação é visualizado com um microscópio na posição vertical com a objetiva de 10x e 40x de imersão em água. </li><li> Mais uma vez, só usamos luz IR para prevenir branqueamento dos fotorreceptores. Uma câmera de infravermelho é conectado à porta do lado do microscópio, que é conectado a uma tela de TV. </li></ol> Estimulação Visual Estímulos visuais são programados em Matlab usando o Psychtoolbox e são projetadas na retina, através da porta superior do microscópio utilizando um microscópio de imagem injector (MBF biociência). A Bits + + processador de vídeo digital (Cambridge Research Systems) é usado para obter uma escala de luminância 14bit e sincr.onize apresentação do estímulo com a aquisição de dados. Os estímulos visuais utilizados neste vídeo são bares claros ou escuros (width = 460μm) de contraste de 100%, que foram apresentados por dois segundos em um fundo uniforme constante (luminância = 8 * 10 4 fótons / M / s, tamanho: 1,84 x 1,38 milímetros). Eletrofisiologia <ul><li> Eletrodos patch são extraídos de vidro de borosilicato (OD:.. ID, 1,5 milímetros 84 milímetros) com um puxador de micropipeta. Para as células ganglionares, as resistências estão entre 2 e 4 Mohms. Para as células bipolares, resistências maiores entre 4 e 8 Mohms são usados. </li><li> Braçadeira de tensão gravações são realizadas usando um 700A Multiclamp (dispositivos Molecular), amplificador e laboratório de software interno programado em Labview. </li><li> Drogas são perfundidos por meio de um sistema de perfusão de 8 canais. O eletrodo é colocado próximo microperfusão à fatia (o tecido deve visivelmente se movem quando você liga a perfusão e desligar, mas é preciso ter cuidado para que a pressão não é forte demais para que a fatia pode-se destacar do papel de filtro). Durante os experimentos a microperfusão deve ser constantemente ligado (solução de controle de perfusão, se nenhuma droga são necessários) para que a gravação não fica perturbado com a mudança da perfusão ligado e desligado. </li></ul>

<ol><li>Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28C%29+receptors+control+adaptive+changes+in+a+glycinergic+inhibitory+pathway+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina.</a> Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).</li>
<li>Heflin, S. J., Cook, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrow+and+wide+field+amacrine+cells+fire+action+potentials+in+response+to+depolarization+and+light+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation.</a> Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).</li>
<li>Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+Channels+in+the+Transient+Retinal+Bipolar+Cells+Enhance+Visual+Responses+in+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.%22%5BJournal%5D)">Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells.</a> J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).</li>
</ol>

Benefícios: <ol><li> Todos os tipos de células são acessíveis </li><li> A fácil identificação de tipos de células, em particular se um corante fluorescente é adicionado à solução do eletrodo </li><li> Agentes farmacológicos pode chegar facilmente a células-alvo </li><li> A técnica de patch clamp permite investigar o papel dos canais iônicos em cálculos diferentes da retina. A mesma informação não pode ser obtida através de gravações extracelluar espiga ou gravações com eletrodos afiada. </li><li> Esta técnica pod...

<table><tbody><tr><td>Multiclamp 700A</td><td>Amplificador de Clamp de Patch</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>Microsscópio de Dissecação</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX50WI</td><td>Microsscópio Upright</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Equipado com objetivas de imersão em água de 40x e 10x, filtros fluorescentes e lâmpada de mercúrio</td></tr><tr><td>P-97</td><td>Puxador de Micropipetas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucivid</td><td>Injetor de imagem para microscópio</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusão de 8 canais</td><td>Microperfusão</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>Processador Digital de Vídeo</td><td>Cambridge Research Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oculares de Infravermelho</td><td>Outro</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas adesivas de silicone</td><td>Outro</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td>diâmetro de 20 mm, profundidade de 1,0 mm</td></tr><tr><td>Filtros de Membrana</td><td>Filtro</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWPO1300</td><td>.45&amp;#x03BC;m HA</td></tr><tr><td>Capilares de Vidro de Borossilicato</td><td>Vidro para Eletrodo</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Seringa</td><td>Filtro</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6789-0402</td><td>Filtros de 4 mm, membrana de Nylon .2um, carcaça de polipropileno</td></tr><tr><td>Câmera de infravermelho</td><td>Câmera acoplada ao microsscópio</td><td>Sony Corporation</td><td>SPT-M324</td><td>Câmera de vídeo Extrawave HAD, B7W</td></tr><tr><td>Picrotoxina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Estricnina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódico do ácido imidazol-4-acético</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7013</td><td></td></tr><tr><td>Salamandras tigre larvais</td><td>Animal</td><td>Charles E. Sullivan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de célula inteira recordings of light evocados excitatórios correntes synaptic na slice retinal

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

Usamos a técnica de célula inteira patch clamp para estudar os circuitos sinápticos que está por trás de processamento de informações visuais na retina. Neste vídeo, que irá guiá-lo através do processo de realização de célula inteira gravações de luz correntes evocados de células individuais na preparação fatia da retina. Usamos o tigre aquáticos salamandra como modelo animal. Começamos por descrever a dissecação do olho e mostrar como as fatias são montados para as gravações eletrofisiológicas. Uma vez que a fatia é colocada na câmara de gravação, que demonstram como executar de célula inteira gravações braçadeira de tensão. Em seguida, projeto de estímulos visuais sobre os fotorreceptores na fatia de obter luz evocou respostas atual. Durante a gravação que perfundir a fatia com agentes farmacológicos, no qual um sistema de perfusão de 8 canais nos permite alternar rapidamente entre diferentes agentes. A preparação fatia da retina é amplamente usado para gravações de patch clamp na retina, em particular para estudar ou células amácrinas bipolar, que não são acessíveis em uma preparação de todo o monte.

Este vídeo mostra o processo de whole-cell recording voltagem clamp na fatia da retina do tigre aquáticos salamandra. Nós demonstramos a preparação da fatia, bem como a forma de realizar gravações patch clamp durante a estimulação visual da retina.

De célula inteira Recordings of Light Evocados Excitatórios Correntes Synaptic na Slice Retinal

Utilizamos a técnica de patch clamp de célula inteira para estudar a circuitaria sináptica que fundamenta o processamento de informações visuais na retina. Neste vídeo, nós...

Hoje eu vou mostrar a você como preparar fatias da retina do salamandra-tigre para gravações com eletrodos de patch clamp. Primeiro, prepararei dois tipos de lâminas de microscópio. Usamos lâminas com um poço adesivo fixado a elas para que possamos utilizá-las como câmaras de fluido.No primeiro lâmina, coloco duas faixas paralelas de graxa de vácuo. Em seguida, pego um papel filtro e o corto em pedaços retangulares com uma lâmina afiada. Agora coloco um dos pedaços sobre os trilhos de graxa e o pressiono para baixo, de modo que fique bem preso ao lâmina.Eu faço o mesmo com o outro pedaço. O segundo tipo de lâmina possui pequenos blocos de borracha colados a ela. Por enquanto, adiciono apenas um pouco de graxa para vácuo entre os blocos; também coloco uma nova lâmina de barbear no cortador de tecidos.Por fim, preparo as ferramentas que precisarei durante a dissecação, que são dois pares de pinças, um par de tesouras e uma ferramenta para remover o olho da cabeça, a fim de registrar as correntes evocadas pela luz. A dissecação deve ser realizada sob luz infravermelha, mas para fins demonstrativos, agora trabalharei sob luz visível. Primeiro, removo o olho e o coloco sobre o microscóp

whole-cell-recordings-light-evoked-excitatory-synaptic-currents

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos um procedimento para a geração de adaptação ao escuro fatias da retina do rato para gravações eletrofisiológicas.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de agar-embedded fatias da retina que são adequados para eletrofisiologia e Ca2 + imagem. Este método permite que um estudo de fita do tipo sinapses em microcircuitos da retina usando direto de patch-clamp gravações de um único terminais nervosos pré-sinápticos.

Patch-clamp medidas de capacitância e Ca 2 + Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

Este artigo descreve a gravação de células individuais de fluorescente etiquetado populações neuronais na retina do rato intacto. Usando dois fótons infravermelhos excitação transgenetically células marcadas foram alvo de patch-clamp de gravação para estudar as respostas de luz, as propriedades de campo receptivo, e morfologia.

Caracterização eletrofisiológica de GFP-Expressando populações de células na retina intacta

O vídeo descreve o registro eletrofisiológico de sinapses retinogeniculadas e corticogeniculadas em fatias de cérebro de camundongos. Os cortes contendo o núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) são colocados em uma câmara de registro. Uma pipeta estimulante é posicionada no trato óptico para estimular as células ganglionares da retina (RGCs) e investigar sinapses retinogeniculadas ou no núcleo reticular tálamo para estimular neurônios corticais e investigar sinapses corticogeniculadas. Após a...

Um estudo eletrofisiológico de sinapses retinogeniculadas e corticogeniculadas em fatias de cérebro de camundongo

Este vídeo demonstra a gravação de respostas pós-sinápticas evocadas por luz em uma preparação de corte de tecido retiniano de camundongo adaptado ao escuro. A fatia da retina é colocada em uma câmara de gravação e uma pipeta de gravação é usada para estabelecer a continuidade elétrica com uma célula ganglionar da retina. Pulsos de luz são aplicados para gerar potenciais pós-sinápticos excitatórios nas células ganglionares, que são registrados pela pipeta.

Respostas pós-sinápticas evocadas por luz em neurônios de fatias de retina de camundongos

Este vídeo demonstra o procedimento para estudar a eficiência sináptica no córtex entorrinal lateral (LEC) estimulando optogeneticamente os axônios do córtex pré-frontal medial (mPFC) e registrando as respostas dos neurônios piramidais no LEC. Este método combina gravações de patch-clamp com ativação sináptica por estimulação de luz para estudar a plasticidade sináptica.

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Nós descrevemos a preparação de fatias finas de retina aquático salamandras tigre...

Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

Demonstraremos como preparar fatias de retina do olho do camundongo e registrar as respostas à luz nos neurônios da retina. Todo o procedimento é realizado em condições adaptadas ao escuro.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

Nós desenvolvemos uma preparação fatia horizontal da retina de mamífero adulto com o plano de corte paralelo à superfície da retina. campos dendríticos de neurônios da retina orientados nonradially não foram truncados, permitindo o estudo do processamento de sinal com técnicas de patch-clamp e de imagem.

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Este trabalho apresenta uma preparação alternativa de retina flatmount na qual a remoção de corpos celulares fotorreceptores permite uma difusão mais rápida de anticorpos e um melhor acesso da pipeta de remendo aos neurônios internos da retina para experimentos de imunohistoquímica, hibridização in situ e eletrofisiologia.

Split Retina como uma Preparação Flatmount Melhorada para o Estudo de Neurônios da Camada Nuclear Interna na Retina de Vertebrados

Aprenda a preparar fatias de retina de salamandra-tigre para gravações de patch clamp em neurociência visual. Este método demonstra técnicas de eletrofisiologia para estudar respostas sinápticas evocadas por luz em células ganglionares retinianas.

De célula inteira Recordings of Light Evocados Excitatórios Correntes Synaptic na Slice Retinal

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