De célula inteira Recordings of Light Evocados Excitatórios Correntes Synaptic na Slice Retinal

Hoje eu vou mostrar a você como preparar fatias da retina do salamandra-tigre para gravações com eletrodos de patch clamp. Primeiro, prepararei dois tipos de lâminas de microscópio. Usamos lâminas com um poço adesivo fixado a elas para que possamos utilizá-las como câmaras de fluido.

No primeiro lâmina, coloco duas faixas paralelas de graxa de vácuo. Em seguida, pego um papel filtro e o corto em pedaços retangulares com uma lâmina afiada. Agora coloco um dos pedaços sobre os trilhos de graxa e o pressiono para baixo, de modo que fique bem preso ao lâmina.

Eu faço o mesmo com o outro pedaço. O segundo tipo de lâmina possui pequenos blocos de borracha colados a ela. Por enquanto, adiciono apenas um pouco de graxa para vácuo entre os blocos; também coloco uma nova lâmina de barbear no cortador de tecidos.

Por fim, preparo as ferramentas que precisarei durante a dissecação, que são dois pares de pinças, um par de tesouras e uma ferramenta para remover o olho da cabeça, a fim de registrar as correntes evocadas pela luz. A dissecação deve ser realizada sob luz infravermelha, mas para fins demonstrativos, agora trabalharei sob luz visível. Primeiro, removo o olho e o coloco sobre o microscópio, apoiado em um pedaço de papel-toalha umedecido com solução de Ringer gelada.

Em seguida, removo o tecido conjuntivo extra do globo ocular para garantir que ele não danifique o olho. Sempre corto ao longo da superfície. Isto é o que se vê através do microscópio.

Em seguida, utilizo uma lâmina de barbear para fazer um pequeno corte na córnea. Para isso, seguro o olho com a pinça enquanto pressiono a borda da lâmina de barbear contra a córnea. Então, seguro a córnea com a pinça enquanto a removo com a tesoura para retirar a lente.

Aplico uma leve pressão nas bordas da cúpula ocular para que eu possa acessar facilmente a lente com minha pinça. Em seguida, removo a íris. Seguro a íris com a pinça enquanto corto ao longo da auréola serata até que apenas a cúpula ocular permaneça.

Em seguida, corto a taça I em dois pedaços retangulares. Primeiro corto ao meio e depois aparar as bordas superior e inferior. Agora pego uma das lâminas que preparei anteriormente, pego um pedaço da taça I e o coloco com o lado da retina voltado para baixo sobre o papel filtro.

Em seguida, puxo esta esclera de modo que apenas a retina permaneça sobre a lâmina. Depois disso, adiciono rapidamente a nossa solução ao compartimento, em forma de anel. Vamos repetir o procedimento para o segundo fragmento de retina.

Mas desta vez você pode observar pelo microscópio enquanto coloca a retina sobre o papel filtro. Uso a pinça com a mão esquerda para pressionar cuidadosamente a esclera. Por fim, corto a retina em fatias com largura de 200 a 300 micrômetros.

Em seguida, escolho uma fatia para usar nos meus experimentos. Para selecionar uma fatia adequada, preciso girar as fatias em 90 graus para poder observar as camadas da retina. Escolho uma fatia que pareça não danificada e que mostre faixas horizontais distintas, indicando as diferentes camadas.

Para mover as lâminas de uma para outra, crio uma ponte de Ringer e, em seguida, movo cuidadosamente as lâminas através da solução. Quando coloco o corte, empurro-o contra os blocos de borracha para que o papel-filtro fique orientado verticalmente em relação ao vidro. Agora estou pronto para o registro com patch clamp.

Armazenamos a solução intracelular em pequenas porções no congelador para que descongelemos apenas a quantidade que realmente precisamos em um dia. Antes de preencher os eletrodos, filtramos a solução para remover partículas pequenas que poderiam obstruir a ponta do eletrodo. Os eletrodos de patch são puxados a partir de capilares de vidro de borossilicato para registrar atividade de células ganglionares.

Escolho uma configuração de puxar que produzirá resistências de eletrodo entre dois e quatro megaohms. Ao preencher os eletrodos, quero garantir que não haja bolhas de ar na ponta do eletrodo. Dar pequenos toques no vidro com o dedo ajuda a remover as bolhas.

Este é o suporte do eletrodo fixado ao estágio da cabeça. O rolo eletrodo contém um fio de cloreto de prata. Este é o eletrodo de terra com uma ponte niga.

Aqui está a pipeta de perfusão. Ela está conectada a um sistema de microperfusão de oito canais. A perfusão principal é conduzida pela gravidade, então é apenas um frasco cheio com wingers, e a solução desce através deste tubo até a câmara de registro.

Para poder gravar no escuro, tenho uma câmera de infravermelho conectada à porta lateral do microscópio, que por sua vez está ligada a uma tela de TV. Na porta superior, conectei um projetor de imagens, que me permite projetar estímulos visuais sobre a retina. E, finalmente, o amplificador de patch clamp.

Agora coloco a fatia retiniana sob o microscópio e adiciono o eletrodo de terra ao banho para configurar a principal perfusão. Em seguida, adiciono o tubo do sistema de perfusão por gravidade. O tubo de vidro no outro lado está conectado à sucção a vácuo, o que mantém o nível do fluido constante.

Também verifico se um tubo de sucção está conectado ao eletrodo de ombro. Em seguida, posiciono a pipeta de microperfusão. Abaixo-a na câmara, acompanhando com o objetivo do microscópio.

Quando me aproximo da fatia, eu a puxo um pouco para trás, para que a solução atinja a fatia. Quando ligo a perfusão, devo ver a fatia se movendo levemente, como aqui. Vamos agora procurar uma boa célula para registrar.

Estamos procurando células ganglionares, que estão na parte inferior da fatia. Agora preparo o eletrodo antes de introduzi-lo no banho; adiciono uma pressão positiva. Assim que localizo o eletrodo sob o microscópio, eu o desço até ficar logo acima da fatia para realizar o selamento em uma célula.

Mudei para a objetiva de 40 x. Agora, zero a corrente de linha de base e verifico a resistência do eletrodo. O teste de selamento consiste em uma sequência de pulsos de 10 milivolts, o que me ajuda a verificar se estabeleci um selamento apertado entre o eletrodo e a célula.

Agora, posiciono meu eletrodo sobre a célula-alvo. Assim que vejo um reentrância no corpo celular, libero a pressão positiva do tubo, o que estabelece um selamento firme. A resistência está agora tão alta que o traçado da corrente parece plano.

Os pequenos picos são artefatos de capacitância provenientes do eletrodo. Eles podem ser compensados desta forma, então agora desapareceram. Agora vou tentar penetrar na célula.

Para fazer isso, apliquei cuidadosamente pequenos pulsos de sucção no tubo conectado ao ombro do eletrodo, e se tudo funcionar corretamente, você verá a mudança no traçado da corrente como este. Os picos que agora podem ser vistos são atravessados pela capacitância da membrana e também podem ser compensados. Esta é uma preparação que foi feita no escuro. Vamos ver se conseguimos registrar respostas evocadas pela luz.

O traço que você pode ver no osciloscópio é a resposta de corrente de uma célula ganglionar com potencial fixado em menos 60 milivolts. Os estímulos luminosos que utilizamos são barras claras e escuras apresentadas sobre um fundo uniforme e constante. O software do nosso laboratório mostra o registro completo de um único ensaio.

Pode-se observar que esta é uma célula off pela resposta ao início de uma barra escura e ao desaparecimento de uma barra clara. A linha branca na parte superior indica a duração do estímulo. Agora podemos realizar experimentos nos quais perfundimos diferentes agentes farmacológicos.

Por exemplo, podemos bloquear a inibição sinérgica GABAérgica e glicinérgica. Após esperar menos de um minuto, geralmente podemos começar a observar os efeitos da droga aqui. A resposta tornou-se mais forte e mais prolongada.

A preparação de fatias retinianas tem sido amplamente utilizada para registrar as correntes sinápticas de diferentes células na retina, e se adiciona-se um corante fluorescente à solução do eletrodo, o tipo celular pode ser facilmente confirmado. Anatomicamente, utilizamos aqui o salamandra larval TGA como modelo animal. O fato de as salamandras serem animais pecilotérmicos e possuírem células retinianas grandes proporciona condições de gravação vantajosas, mas a mesma técnica pode ser aplicada a preparações de mamíferos.