Name: Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-22T00:31:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprenda a técnica de imunoprecipitação de cromatina em células estaminais embrionárias humanas. Este método permite analisar interações proteína-DNA e investigar mudanças na estrutura da cromatina durante a diferenciação celular.

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O trabalho apresentado é apoiado por uma subvenção (RS1-00477-1) do Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM) para FS

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+complexes+repress+developmental+regulators+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells.</a> Nature. 441, 349-353 (2006).</li>
<li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+developmental+regulators+by+Polycomb+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 301-313 (2006).</li>
<li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+the+nucleosome%2C+fundamental+particle+of+the+eukaryotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryotic chromosome.</a> Cell. 98, 285-294 (1999).</li>
<li>Guenther, M. G., Jenner, R. G., Chevalier, B., Nakamura, T., Croce, C. M., Canaani, E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+Hox-specific+roles+for+the+MLL1+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A.%22%5BJournal%5D)">Global and Hox-specific roles for the MLL1 methyltransferase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8603-8608 (2005).</li>
<li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nat. Protoc. 1, 729-748 (2006).</li>
<li>Sanchez-Elsner, T., Gou, D., Kremmer, E., Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNAs+of+trithorax+response+elements+recruit+Drosophila+Ash1+to+Ultrabithorax%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ash1 to Ultrabithorax.</a> Science. 311, 1118-1123 (2006).</li>
</ol>

Cromatina imunoprecipitação (CHIP) oferece uma técnica valiosa para a dissecção da cromatina processos baseados durante a diferenciação celular. Pré-requisitos para o sucesso deste método são anticorpos boa ea disponibilidade de cromatina a partir de células ou tecidos de controle que não têm o antígeno de interesse. Através da combinação de chip com DNA microarray tecnologia, grandes quantidades de informação pode ser obtida. A validação dos resultados ChIP depende da disponibilidade de sistemas de teste adequado, que pode ligar a associação dinâmica de proteínas, modificações de proteínas e / ou RNA com a execução de processos biológicos durante o desenvolvimento celular.

<table><tbody><tr><td>Poteinase-K</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>#EO0491</td><td></td></tr><tr><td>RNase-A</td><td>Reagente</td><td>Fermentas</td><td>#EN0531</td><td></td></tr><tr><td>formaldeído 37%</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>FX040-13</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>3150</td><td></td></tr><tr><td>Etanol </td><td>Reagente</td><td>Goldshield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fenol:clorofórmio:álcool isoamílico</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>SA, fração V</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>4050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 </td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>9410</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Reagente</td><td>JT Baker</td><td>4095-02</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de lítio</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>5910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>9230</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Reagente</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>Ácido desoxicólico, sal de sódio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amônio</td><td>Reagente</td><td>Applichem</td><td>631-61-8</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>dynalbeads, proteína A</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>100.02D</td><td></td></tr><tr><td>dynalbeads, proteína G</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>Tubos microcônicos de baixa retenção, 1,5 ml, Xtreme</td><td>Outro</td><td>Phenix Research Products</td><td>MAX-815S</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 2,0 ml</td><td>Reagente</td><td>Eppendorf</td><td>955154037</td><td></td></tr></tbody></table>

cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

A complexidade estrutural e funcional da miríade de células em organismos metazoários surge de um pequeno número de células-tronco. Células-tronco são caracterizadas por duas propriedades fundamentais: a auto-renovação e multipotency que permite que uma célula-tronco de se diferenciar em virtualmente qualquer tipo de célula 1. A célula-tronco para a progressão de células diferenciadas é caracterizada pela perda das mudanças multipotency, estruturais e morfológicas ea atividade hierárquica dos fatores de transcrição e moléculas de sinalização, cujas atividades estabelecer e manter células-tipo padrões de expressão gênica específicos. No nível molecular, diferenciação celular envolve mudanças dinâmicas da estrutura e composição da cromatina ea detecção dessas mudanças dinâmicas podem fornecer informações valiosas sobre as características funcionais de células-tronco eo processo de diferenciação das células 2,3. Cromatina altamente compactada é um complexo DNA-proteína que se forma quando as células de DNA cromossômico pacote com proteínas, principalmente histonas 4. Stemcellness e diferenciação celular tem sido correlacionada com a presença de matrizes específicas das proteínas reguladoras, tais como fatores epigenéticos, variantes da histona, e fatores de transcrição 2,3,5. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) fornece um método valioso para monitorar a presença de RNA, proteínas e modificações na cromatina da proteína 6,7. A comparação da cromatina de diferentes tipos de células pode elucidar mudanças dinâmicas em proteínas da cromatina-associações que ocorrem durante a diferenciação celular. Imunoprecipitação da cromatina envolve a purificação da cromatina in vivo cruzada. A cromatina isolada é reduzida a fragmentos menores por digestão enzimática ou força mecânica. Fragmentos de cromatina são precipitados usando anticorpos específicos para proteínas-alvo ou proteína e modificações do DNA. O DNA precipitado ou RNA é purificado e usado como um molde para PCR ou ensaios de microarranjos de DNA baseado. Pré-requisitos para um chip bem sucedidos são os anticorpos de alta qualidade para o antígeno desejado ea disponibilidade de cromatina a partir de células de controle que não expressam a molécula-alvo. Chip pode correlacionar a presença de proteínas, proteína e modificações RNA, DNA e RNA com alvo específico, e, dependendo da escolha da ferramenta outread, detecta a associação de moléculas-alvo em genes-alvo específico ou no contexto de um genoma inteiro. A comparação da distribuição de proteínas na cromatina de células de diferenciação pode elucidar a dinâmica de mudança da composição da cromatina que coincidem com a progressão de células ao longo de uma linhagem celular.

A diferenciação do ESC coincide com células tipo mudanças específicas na estrutura e composição da cromatina. A detecção dessas mudanças fornece informações valiosas sobre os mecanismos que definem stemcellness e diferenciação celular. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) representa um método valioso para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes à diferenciação de células-tronco.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

A complexidade funcional e estrutural da miríade de células em organismos metazoários origina-se de um pequeno número de células-tronco. As células-tronco são...

Olá, sou Stefan Burani do laboratório do Dr. Frank Zawa, do Departamento de Bioquímica da Universidade da Califórnia em Riverside. Hoje vamos mostrar um procedimento de imunoprecipitação de cromatina. Então, vamos começar.Este procedimento inicia-se com a reticulação por formaldeído de células-tronco embrionárias humanas. Antes da reticulação, as células-tronco embrionárias humanas são descongeladas a partir de nitrogênio líquido por cinco minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, lavadas com meio de cultura. As células são então semeadas em placas de seis poços revestidas com gelatina e mantidas para expansão por dois a três dias.Para cada reação de imunoprecipitação, precisaremos iniciar com 50 a 100 milhões de células. As células são primeiramente lisadas e coletadas em suspensão. O aldeído fresco é adicionado a cada suspensão celular numa concentração de 1% e incubado por 10 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, adicione um volume igual a um décimo de glicina 1,25 M para neutralizar o formaldeído e incubar por 10 minutos. Lave as células duas vezes com 10 mililitros de PBS e, então, recolha-as em tubos cónicos de 50 mililitros. Centrifugue os tubos a 1000 RPM durante cinco minutos a quatro graus Celsius para recolher as células em um pellet.Após a centrifugação, despreze o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1,5 mililitros de tampão lise. Por fim, transfira as células para um tubo microfuge de 1,5 mililitro. Após a transferência das células, congele-as rapidamente três vezes em nitrogênio líquido e, em seguida, utilize um homogeneizador de tecidos para rompê-las.Uma vez que as células são reticuladas, elas estão prontas para a imunoprecipitação ou podem ser armazenadas congeladas a menos 80 graus Celsius indefinidamente. Após reticular as células, você precisa preparar as microesferas magnéticas para fazer isso. Adicione 50 microlitros de microesferas DI a tubos microcêntrifugos de baixa retenção de 1,5 mililitro, preparando um tubo de microesferas para cada imunoprecipitação.Em seguida, adicione um mililitro de solução bloqueadora. Agora, colete os grânulos DYAL usando o MPC DYAL. Coloque os tubos no suporte magnético.Deixe as esferas acumularem na lateral do tubo. Isso deve levar cerca de 15 segundos. Você pode inverter o suporte duas vezes para ajudar no acúmulo das esferas.Uma vez que as microesferas tenham sido coletadas, você pode remover o sobrenadante com uma pipeta. Após a remoção do sobrenadante, adicione um mililitro de solução bloqueadora e ressuspenda suavemente as microesferas removendo a barra magnética do suporte e invertendo o suporte. Com o tubo ainda no lugar, repita este procedimento de 10 a 20 vezes ou até que as microesferas estejam uniformemente distribuídas.Resuspenda e recolha as microesferas como fez anteriormente. Após o recolhimento, você pode remover o sobrenadante com uma pipeta. Repita essa lavagem usando 1,5 mililitros de solução bloqueadora.Após a segunda lavagem, você pode ressuspender as esferas em 750 microlitros de solução bloqueadora e então adicionar 10 microgramas de anticorpo. Em nossa pesquisa, utilizamos um anticorpo contra a proteína MLL, incubando a mistura a quatro graus Celsius por um mínimo de seis horas ou durante a noite em um agitador rotativo. Durante essa incubação, você pode sonificar sua cromatina reticulada, o que demonstraremos logo após a incubação noturna.Remova a solução de anticorpo e, em seguida, lave as microesferas três vezes. Utilize um mililitro de tampão lisante, como fez anteriormente, usando o suporte magnético para recolher as microesferas. Após as lavagens, você está pronto para adicionar sua cromatina saturada.Antes de iniciar a sonicação, você precisa primeiro retirar os pellets celulares congelados do congelador a menos 80 graus Celsius e deixá-los descongelar. Prepare um tubo cônico de 15 mililitros para sonicação. Isso é feito cortando o tubo em duas partes na marca de cinco mililitros e descartando a metade superior.Os tubos podem ser cobertos com parafina ou com a tampa do tubo. Ao preparar, use um suporte para tubos e posicione o tubo de modo que a sonda ator fique aproximadamente 0,5 a um centímetro acima do fundo do tubo.Certifique-se de que a sonda está centralizada e não entra em contato com a lateral do tubo para evitar a formação de espuma na solução. Agora, sonique a suspensão por seis ciclos de 20 segundos. Cada amostra deve ser mantida em banho de gelo entre os ciclos de sonicação para reduzir a formação de espuma.Inicialmente, ajuste a potência para zero e, em seguida, aumente manualmente até a potência final durante o primeiro pulso. Após algum tempo, transfira o material para um tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 13.000 RPM por 10 minutos a quatro graus Celsius. Para sedimentar os detritos e coletar o sna.Transfira a SINA para um novo tubo de 1,5 mililitro. Guarde 50 microlitros do lisado celular de cada amostra como DNA de entrada. Isso será usado posteriormente para verificar o tamanho da cromatina compartilhada.Isso pode ser armazenado a menos 20 graus Celsius. Pelo menos uma alíquota de DNA de entrada deve ser mantida por lote de lisado sonicado. Agora estamos prontos para imunoprecipitar a cromatina para amino precipitar a cromatina.Primeiro, adicione o equivalente de cromatina de 50 a 100 milhões de células do sobrenadante coletado na etapa anterior ao mix magnético de anticorpos de 50 microlitros que preparamos anteriormente, ajustando o volume final para um mililitro. Se necessário, este volume pode ser ajustado com tampão lyce invert para ressuspendê-lo. Incube esta mistura com as microesferas durante a noite no mutator a quatro graus Celsius.Após a incubação, colete as esferas usando o dyl MPC, colocando os tubos na grade, permitindo que as esferas se acumulem na lateral do tubo. Isso deve levar aproximadamente 20 segundos. Incline a grade duas vezes para ajudar a reunir todas as esferas.Em seguida, remova o sobrenadante com uma pipeta, trocando as ponteiras entre as amostras. Depois, precisamos lavar as esferas. Para isso, adicione um mililitro de tampão lisador a cada tubo e ressuspenda suavemente as esferas.Isso pode ser feito removendo a tira magnética do suporte e invertendo o suporte com os tubos ainda no lugar de 10 a 20 vezes, ou até que as microesferas sejam ressuspendidas uniformemente. Em seguida, recolha as microesferas recolocando a tira magnética. Remova o sobrenadante com uma pipeta.Repita esta lavagem de três a cinco vezes adicionais. Lembre-se de trocar as ponteiras entre cada lavagem. Em seguida, lave as microesferas de quatro a seis vezes em um mililitro do tampão IP um, conforme descrito anteriormente.Em seguida, da mesma forma, lave as microesferas quatro a seis vezes em um mililitro de tampão IP dois. Por fim, lave as microesferas quatro a seis vezes em um mililitro de tampão TE com pH 8,0, como feito nas outras lavagens. Remova o TE após a lavagem final.Agora, centrifugue a 3000 RPM durante três minutos a quatro graus Celsius para remover qualquer resíduo de tampão TE. As esferas estão agora prontas para a eluição para remover a cromatina. Primeiro, adicione 210 microlitros de tampão de eluição e elua o material das esferas incubando os tubos em um agitador térmico a 65 graus Celsius a 800 RPM, por 15 minutos ou até 30 minutos para melhorar a recuperação do eluato.Centrifugue as microesferas a 13.000 rpm por um minuto. Após a centrifugação, remova 200 microlitros do sobrenadante e transfira para um novo tubo, e então adicione 200 microlitros de TE 0,0. Agora nossas amostras estão prontas para a descrosslinkagem e recuperação do DNA precipitado.Incube o sobrenadante em banho-maria a 65 graus Celsius por um mínimo de seis horas e um máximo de 15 horas. Esta incubação pode ser realizada em banho-maria para minimizar a condensação. Em seguida, siga com 50 microlitros de DNA de entrada.Isso foi reservado após a sonicação para reverter a ligação cruzada deste DNA de entrada, incubando-o a 65 graus Celsius, como foi feito com o eluato. Agora estamos prontos para purificar o DNA. O DNA é então purificado e precipitado utilizando extração com fenol-clorofórmio, seguida por técnicas de precipitação com etanol.Os pellets de DNA precipitados são ressuspendidos em água e podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius. Para uso futuro, o DNA de entrada purificado pode ser analisado em um gel de corrida em agarose para verificar o tamanho da cromatina fragmentada. Idealmente, o fragmento de cromossomo deve ter entre 250 e 750 bases.Acabamos de mostrar como realizar uma imunoprecipitação de cromatina a partir de células-tronco embrionárias humanas. Ao realizar este experimento, é importante usar um anticorpo de alta afinidade para cromatina, com a faixa de tamanho adequada, e etapas de lavagem de alta rigidez. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte em seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós demonstramos uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) para identificar as interações fator em tecido-específicos genes durante ou após o início da tecido-específicos de expressão gênica em camundongos tecido embrionário. Este protocolo deve ser amplamente aplicáveis ​​para o estudo do tecido-específicos ativação do gene como ocorre durante o desenvolvimento embrionário normal.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

Nós descrevemos um método robusto para cromatina imunoprecipitação utilizando células T primárias. O método baseia-se em métodos normais, mas utiliza um conjunto específico de condições e reagentes que melhoram a eficiência de uma quantidade limitada de células. Importante, é apresentada uma descrição detalhada da fase de análise de dados.

Imunoprecipitação da Cromatina eficiente usando Limitando quantidades de biomassa

A questão de como os reguladores e os estados de cromatina cromatina afetar o genoma in vivo é essencial para a nossa compreensão de como o diagnóstico precoce decisões destino celular são feitas no embrião em desenvolvimento. Abordagem mais popular para investigar características de cromatina em um nível-se global definida aqui para embriões de Xenopus o chip-Seq-.

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões por Chip-Seq

Um regulamento ajuste fino da transcrição do gene subjacente a decisão destino da célula embrionária. Aqui, descrevemos ensaios de imunoprecipitação de cromatina utilizados para investigar regulação epigenética de ambos diferenciação cardíaca de células estaminais e desenvolvimento cardíaco de embriões de camundongos.

Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos

Aqui, descrevemos uma imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e protocolo de preparação ChIP-seq biblioteca para gerar perfis de epigenomic global de amostras embrionárias de galinha baixa abundância.

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Aqui, descrevemos os métodos para executar o ChIP-Seq e CARIP-Seq, incluindo preparação de biblioteca para o sequenciamento de última geração, para gerar epigenomic global e cromatina associada RNA mapas em pilhas do ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias

Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Este método é projetado para seguir a formação de domínios de cromatina mediada por PRC2 em linhas celulares, e o método pode ser adaptado para muitos outros sistemas.

Um método para estudar a formação de novo dos domínios da cromatina

Este protocolo concentra-se na preparação de cromatina a partir de tecidos congelados instantâneos e é adequado para Imunoprecipitação de Cromatina de Reticulação (X-ChIP) seguida de análise quantitativa de PCR (X-ChIP-qPCR) ou abordagens de sequenciamento de próxima geração (X-ChIP-seq).

Extração de cromatina de tecido hepático quimérico congelado para análise de imunoprecipitação de cromatina

Este protocolo descreve o método Capture Hi-C usado para caracterizar a organização 3D de regiões genômicas alvo de tamanho megabaseado em alta resolução, incluindo limites de domínios topologicamente associados (TADs) e interações de cromatina de longo alcance entre elementos regulatórios e outros elementos de sequência de DNA.

Decifrando a organização da cromatina 3D de alta resolução via captura Hi-C

Aprenda a técnica de imunoprecipitação de cromatina em células estaminais embrionárias humanas. Este método permite analisar interações proteína-DNA e investigar mudanças na estrutura da cromatina durante a diferenciação celular.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

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