Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas
22 de julho de 2008
A diferenciação do ESC coincide com células tipo mudanças específicas na estrutura e composição da cromatina. A detecção dessas mudanças fornece informações valiosas sobre os mecanismos que definem stemcellness e diferenciação celular. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) representa um método valioso para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes à diferenciação de células-tronco.
Olá, sou Stefan Burani do laboratório do Dr. Frank Zawa, do Departamento de Bioquímica da Universidade da Califórnia em Riverside. Hoje vamos mostrar um procedimento de imunoprecipitação de cromatina. Então, vamos começar.
Este procedimento inicia-se com a reticulação por formaldeído de células-tronco embrionárias humanas. Antes da reticulação, as células-tronco embrionárias humanas são descongeladas a partir de nitrogênio líquido por cinco minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, lavadas com meio de cultura. As células são então semeadas em placas de seis poços revestidas com gelatina e mantidas para expansão por dois a três dias.
Para cada reação de imunoprecipitação, precisaremos iniciar com 50 a 100 milhões de células. As células são primeiramente lisadas e coletadas em suspensão. O aldeído fresco é adicionado a cada suspensão celular numa concentração de 1% e incubado por 10 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, adicione um volume igual a um décimo de glicina 1,25 M para neutralizar o formaldeído e incubar por 10 minutos. Lave as células duas vezes com 10 mililitros de PBS e, então, recolha-as em tubos cónicos de 50 mililitros. Centrifugue os tubos a 1000 RPM durante cinco minutos a quatro graus Celsius para recolher as células em um pellet.
Após a centrifugação, despreze o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1,5 mililitros de tampão lise. Por fim, transfira as células para um tubo microfuge de 1,5 mililitro. Após a transferência das células, congele-as rapidamente três vezes em nitrogênio líquido e, em seguida, utilize um homogeneizador de tecidos para rompê-las.
Uma vez que as células são reticuladas, elas estão prontas para a imunoprecipitação ou podem ser armazenadas congeladas a menos 80 graus Celsius indefinidamente. Após reticular as células, você precisa preparar as microesferas magnéticas para fazer isso. Adicione 50 microlitros de microesferas DI a tubos microcêntrifugos de baixa retenção de 1,5 mililitro, preparando um tubo de microesferas para cada imunoprecipitação.
Em seguida, adicione um mililitro de solução bloqueadora. Agora, colete os grânulos DYAL usando o MPC DYAL. Coloque os tubos no suporte magnético.
Deixe as esferas acumularem na lateral do tubo. Isso deve levar cerca de 15 segundos. Você pode inverter o suporte duas vezes para ajudar no acúmulo das esferas.
Uma vez que as microesferas tenham sido coletadas, você pode remover o sobrenadante com uma pipeta. Após a remoção do sobrenadante, adicione um mililitro de solução bloqueadora e ressuspenda suavemente as microesferas removendo a barra magnética do suporte e invertendo o suporte. Com o tubo ainda no lugar, repita este procedimento de 10 a 20 vezes ou até que as microesferas estejam uniformemente distribuídas.
Resuspenda e recolha as microesferas como fez anteriormente. Após o recolhimento, você pode remover o sobrenadante com uma pipeta. Repita essa lavagem usando 1,5 mililitros de solução bloqueadora.
Após a segunda lavagem, você pode ressuspender as esferas em 750 microlitros de solução bloqueadora e então adicionar 10 microgramas de anticorpo. Em nossa pesquisa, utilizamos um anticorpo contra a proteína MLL, incubando a mistura a quatro graus Celsius por um mínimo de seis horas ou durante a noite em um agitador rotativo. Durante essa incubação, você pode sonificar sua cromatina reticulada, o que demonstraremos logo após a incubação noturna.
Remova a solução de anticorpo e, em seguida, lave as microesferas três vezes. Utilize um mililitro de tampão lisante, como fez anteriormente, usando o suporte magnético para recolher as microesferas. Após as lavagens, você está pronto para adicionar sua cromatina saturada.
Antes de iniciar a sonicação, você precisa primeiro retirar os pellets celulares congelados do congelador a menos 80 graus Celsius e deixá-los descongelar. Prepare um tubo cônico de 15 mililitros para sonicação. Isso é feito cortando o tubo em duas partes na marca de cinco mililitros e descartando a metade superior.
Os tubos podem ser cobertos com parafina ou com a tampa do tubo. Ao preparar, use um suporte para tubos e posicione o tubo de modo que a sonda ator fique aproximadamente 0,5 a um centímetro acima do fundo do tubo.
Certifique-se de que a sonda está centralizada e não entra em contato com a lateral do tubo para evitar a formação de espuma na solução. Agora, sonique a suspensão por seis ciclos de 20 segundos. Cada amostra deve ser mantida em banho de gelo entre os ciclos de sonicação para reduzir a formação de espuma.
Inicialmente, ajuste a potência para zero e, em seguida, aumente manualmente até a potência final durante o primeiro pulso. Após algum tempo, transfira o material para um tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 13.000 RPM por 10 minutos a quatro graus Celsius. Para sedimentar os detritos e coletar o sna.
Transfira a SINA para um novo tubo de 1,5 mililitro. Guarde 50 microlitros do lisado celular de cada amostra como DNA de entrada. Isso será usado posteriormente para verificar o tamanho da cromatina compartilhada.
Isso pode ser armazenado a menos 20 graus Celsius. Pelo menos uma alíquota de DNA de entrada deve ser mantida por lote de lisado sonicado. Agora estamos prontos para imunoprecipitar a cromatina para amino precipitar a cromatina.
Primeiro, adicione o equivalente de cromatina de 50 a 100 milhões de células do sobrenadante coletado na etapa anterior ao mix magnético de anticorpos de 50 microlitros que preparamos anteriormente, ajustando o volume final para um mililitro. Se necessário, este volume pode ser ajustado com tampão lyce invert para ressuspendê-lo. Incube esta mistura com as microesferas durante a noite no mutator a quatro graus Celsius.
Após a incubação, colete as esferas usando o dyl MPC, colocando os tubos na grade, permitindo que as esferas se acumulem na lateral do tubo. Isso deve levar aproximadamente 20 segundos. Incline a grade duas vezes para ajudar a reunir todas as esferas.
Em seguida, remova o sobrenadante com uma pipeta, trocando as ponteiras entre as amostras. Depois, precisamos lavar as esferas. Para isso, adicione um mililitro de tampão lisador a cada tubo e ressuspenda suavemente as esferas.
Isso pode ser feito removendo a tira magnética do suporte e invertendo o suporte com os tubos ainda no lugar de 10 a 20 vezes, ou até que as microesferas sejam ressuspendidas uniformemente. Em seguida, recolha as microesferas recolocando a tira magnética. Remova o sobrenadante com uma pipeta.
Repita esta lavagem de três a cinco vezes adicionais. Lembre-se de trocar as ponteiras entre cada lavagem. Em seguida, lave as microesferas de quatro a seis vezes em um mililitro do tampão IP um, conforme descrito anteriormente.
Em seguida, da mesma forma, lave as microesferas quatro a seis vezes em um mililitro de tampão IP dois. Por fim, lave as microesferas quatro a seis vezes em um mililitro de tampão TE com pH 8,0, como feito nas outras lavagens. Remova o TE após a lavagem final.
Agora, centrifugue a 3000 RPM durante três minutos a quatro graus Celsius para remover qualquer resíduo de tampão TE. As esferas estão agora prontas para a eluição para remover a cromatina. Primeiro, adicione 210 microlitros de tampão de eluição e elua o material das esferas incubando os tubos em um agitador térmico a 65 graus Celsius a 800 RPM, por 15 minutos ou até 30 minutos para melhorar a recuperação do eluato.
Centrifugue as microesferas a 13.000 rpm por um minuto. Após a centrifugação, remova 200 microlitros do sobrenadante e transfira para um novo tubo, e então adicione 200 microlitros de TE 0,0. Agora nossas amostras estão prontas para a descrosslinkagem e recuperação do DNA precipitado.
Incube o sobrenadante em banho-maria a 65 graus Celsius por um mínimo de seis horas e um máximo de 15 horas. Esta incubação pode ser realizada em banho-maria para minimizar a condensação. Em seguida, siga com 50 microlitros de DNA de entrada.
Isso foi reservado após a sonicação para reverter a ligação cruzada deste DNA de entrada, incubando-o a 65 graus Celsius, como foi feito com o eluato. Agora estamos prontos para purificar o DNA. O DNA é então purificado e precipitado utilizando extração com fenol-clorofórmio, seguida por técnicas de precipitação com etanol.
Os pellets de DNA precipitados são ressuspendidos em água e podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius. Para uso futuro, o DNA de entrada purificado pode ser analisado em um gel de corrida em agarose para verificar o tamanho da cromatina fragmentada. Idealmente, o fragmento de cromossomo deve ter entre 250 e 750 bases.
Acabamos de mostrar como realizar uma imunoprecipitação de cromatina a partir de células-tronco embrionárias humanas. Ao realizar este experimento, é importante usar um anticorpo de alta afinidade para cromatina, com a faixa de tamanho adequada, e etapas de lavagem de alta rigidez. É isso aí.
Obrigado por assistir e boa sorte em seus experimentos.
Visão Geral
Este artigo discute a diferenciação de células-tronco embrionárias (ESC) e as alterações associadas na estrutura e composição da cromatina. Destaca a importância da imunoprecipitação de cromatina (ChIP) para compreender os mecanismos moleculares da diferenciação de células-tronco.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia de Células-Tronco
- Dinâmica da Cromatina
Antecedentes
- As células-tronco embrionárias podem diferenciar-se em vários tipos celulares.
- A estrutura da cromatina desempenha um papel crucial na regulação da expressão gênica.
- Compreender as alterações na cromatina pode fornecer insights sobre a biologia das células-tronco.
- ChIP é uma técnica utilizada para estudar interações proteína-DNA.
Objetivo do Estudo
- Investigar as alterações na cromatina durante a diferenciação de ESC.
- Utilizar a ChIP para analisar os mecanismos moleculares da diferenciação.
- Aprimorar a compreensão da "pluripotência" das células-tronco.
Métodos Utilizados
- Reticulação com formaldeído de células-tronco embrionárias humanas.
- Preparação de microesferas magnéticas para imunoprecipitação.
- Sonicação da cromatina reticulada.
- Imunoprecipitação da cromatina utilizando anticorpos específicos.
Resultados Principais
- Realização bem-sucedida da reticulação e imunoprecipitação de cromatina.
- Identificação de alterações na cromatina associadas à diferenciação.
- Compreensão do papel de proteínas específicas na biologia das células-tronco.
- Demonstração da eficácia da técnica ChIP no estudo de células-tronco embrionárias.
Conclusões
- A imunoprecipitação da cromatina é um método valioso para o estudo da diferenciação de células-tronco.
- Compreender a dinâmica da cromatina é essencial para a pesquisa com células-tronco.
- Estudos futuros poderiam aprimorar o conhecimento sobre os mecanismos das células-tronco.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) a partir de células-tronco embrionárias humanas permite que equipes de biofármacos investiguem interações proteína-DNA e RNA-cromatina que sustentam decisões do destino celular. Essa capacidade é fundamental para reduzir riscos na validação precoce de alvos e compreender a regulação epigenética durante a diferenciação, impactando diretamente a confiança preditiva em programas de descoberta baseados em células-tronco. A integração de informações derivadas da ChIP apoia a triagem de portfólios e orienta estratégias translacionais para pipelines de terapias regenerativas e celulares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a mapeamento direto da ocupação de fatores de transcrição e reguladores epigenéticos em locos gênicos durante o comprometimento de linhagem.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao correlacionar alterações da cromatina com estados funcionais de expressão gênica.
- Facilita a identificação de elementos regulatórios essenciais para manter a pluripotência ou impulsionar a diferenciação.
- Fornece evidências de engajamento do alvo e modulação de vias em sistemas relevantes para doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Estabelece estados de cromatina validados como leituras quantitativas para telas de perturbação genética ou com compostos.
- Permite a detecção reprodutível de interações proteína-DNA utilizando anticorpos de alta afinidade e controles padronizados.
- Apóia a escalabilidade do ensaio e a reutilização da plataforma ao definir parâmetros robustos de entrada e saída.
- Aprimora a prontidão para triagem ao garantir a fragmentação da cromatina e a qualidade da imunoprecipitação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha assinaturas de cromatina com biomarcadores traducionais para validação de modelos pré-clínicos.
- Garante continuidade do descobrimento até estudos pré-clínicos, rastreando alterações epigenéticas ao longo dos estágios de diferenciação.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base em evidências moleculares da modulação do alvo.
- Apoia a desvinculação preditiva para aplicações em terapia celular e medicina regenerativa.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
ChIP de células-tronco embrionárias humanas se integra ao contínuo de descoberta desde os primeiros testes de hipóteses até a identificação de alvos e validação pré-clínica, fornecendo uma capacidade analítica reutilizável para estudos mecanicistas.
- Biologia Descritiva: Apoia a investigação orientada por hipóteses sobre a dinâmica da cromatina e a função de proteínas reguladoras.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis da associação proteína-DNA em diferentes condições.
- Análises: Permite análise comparativa de estados da cromatina e avaliação estatística do enriquecimento.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas moleculares a vias de diferenciação relevantes para doenças e ao desenvolvimento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado, adaptável a diversos modelos de células-tronco e de diferenciação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e reduz a ambiguidade mecanicista na fase inicial de descoberta.
- Valor Operacional: Promove padronização, reprodutibilidade e escalabilidade entre equipes de P&D.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar e melhora a eficiência do capital ao fundamentar o progresso em evidências moleculares.
- Impacto no Portfólio: Permite priorização ajustada ao risco e apoia a transferência de conhecimento entre programas.
Considerações de Implementação
- Exige conhecimento especializado em biologia da cromatina, imunoprecipitação e análise molecular quantitativa.
- Requer anticorpos de alta qualidade, controles validados e acesso a equipamentos de sonicação e instrumentação analítica.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes quanto ao material de entrada e condições de lavagem.
- Deve ser adaptado conforme necessário para diferentes linhagens de células-tronco e protocolos de diferenciação.
- Depende da especificidade do anticorpo e da eficiência da fragmentação da cromatina para resultados ideais.
