Name: Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas início de murino saco vitelino e AGM (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-27T19:56:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco hematopoéticas de embriões de murinos através de microdissecação do saco vitelino e região AGM, seguida de citometria de fluxo. Este método permite obter populações puras para estudos de hematopoiese.

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Dissecção e isolamento das primeiras células-tronco hematopoéticas de camundongos saco vitelino e aorta-gônadas-mesonefro região <ol><li> Antes de começar, é importante ter todos os reagentes e as ferramentas necessárias para o procedimento: <ul><li> Tesoura </li><li> Fórceps, tamanho 4, e grau cirúrgico com ponta dobrada fórceps, tamanho 5 / 45 (opcional) </li><li> 30 agulhas com seringa </li><li> 35mm e 100 milímetros placas de Petri </li><li> PBS com 10% e 20% de soro fetal bovino </li><li> e, finalmente, colagenase </li></ul></li><li> Para começar a dissecção, precisamos colher os cornos uterinos de uma fêmea grávida em 10,5 concepção pós dias. </li><li> Os animais são sacrificados de acordo com os procedimentos aprovados. Usamos asfixia de dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical. </li><li> Abdômen da fêmea está molhado com etanol e da pele é aberto com uma tesoura. </li><li> Segurando a pele com uma pinça, cortes adicionais são feitas para abrir o peritônio. </li><li> O abdômen é aberto e os cornos uterinos podem ser visualizados. Utilizando uma pinça para segurar os cornos uterinos, corte cada extremidade distal e do centro de consumo tanto chifres. </li><li> Cornos uterinos são então colocados em uma placa de Petri contendo PBS frio com 10% de FBS de remoção dos tecidos uterinos. </li><li> Usando tamanho 4 pinças e trabalhando sob o microscópio, remova cuidadosamente a partir de tecido endometrial em torno de cada concepto embrião, tomando cuidado para não perfurar a placenta. </li><li> Depois de retirados, os embriões são colocados em um prato de doce com frio PBS e FBS 10%. </li><li> Remova cuidadosamente o tecido placentário para revelar o embrião envolto no saco vitelino, usando as pinças para cortar o embrião envolto saco vitelino longe da placenta em sua conjuntura. O saco vitelino contendo artérias vitelínico, e uma porção do cordão umbilical, pode ser gentilmente brincou longe do embrião e reserve na geladeira por dissociação. </li><li> O embrião é transferido para uma placa de Petri pequena, com níveis mínimos de PBS com FBS 10% - apenas o suficiente para molhar o embrião, mas não muito. Níveis ótimos manter o embrião estacionária enquanto a placa está lentamente agitada, mantendo-se o embrião firmemente no lugar durante a dissecção. </li><li> Mude para o 30 agulhas, que são usados ​​para remover as partes superiores e inferiores do embrião, cortando acima dos membros anteriores e abaixo dos membros posteriores. Tornando-se familiarizado com o uso das agulhas como instrumentos de corte pode ter alguma prática. Um método de uso repetido de pequenos cortes, atravessando as agulhas vão dissecar o tecido, com a agulha na mão dominante para agir como um guia de corte para a agulha que está na mão não-dominante. </li><li> Remover a parte dorsal do embrião. Este é o tecido que contém os somitos. Gentilmente cortar o tecido dorsal mais mantendo-se a uma distância suficiente da aorta (linha vermelha) para evitar qualquer Knicks. Corte da aorta resultaria em perda de sangue e pela incapacidade de visualizar facilmente a sua localização. Mais uma vez, fazendo pequenos cortes com as agulhas é vital para manter um local de corte preciso. </li><li> Empurrar o tecido extra para fora da vista e vire o embrião ao redor para cortar o tecido ventral, mais uma vez o corte o mais próximo da aorta quanto possível, sem knicking-lo. Cortes feitos muito longe de uma excelente localização resultaria em tecidos abdominal estar presente, o que pode ser removido uma vez que a AGM é isolado. </li><li> Posição do embrião com o lado dorsal para baixo ou as costas contra a placa. Suavemente splay o embrião aberto, empurrando os lados para baixo e visualizar a localização dos cumes gonadal. Estes estão localizados um pouco fora do centro, como tubo de estruturas semelhantes em ambos os lados da aorta. </li><li> Completar a dissecção, removendo o excesso de tecidos lado utilizando as técnicas de corte como antes. Uma vez que o tecido do lado do embrião é removido, então o embrião é virada de cabeça para baixo para remover o tecido lado restante. </li><li> Neste ponto, a AGM é inspecionado para qualquer excesso de tecido que pode ser removida facilmente com as agulhas sem lesão na aorta ou gônadas. Remover, tanto quanto o excesso resultados possíveis em melhor isolamento da população de células-tronco, uma vez que dependem de apenas uma célula de alguns marcadores de superfície para a purificação. </li><li> Usando a pinça de ponta curvada, gentilmente recolher cada AGM e coloque no frio PBS com FBS 10% até que esteja pronto para a dissociação. </li></ol> Dissociação e Análise FACS <ol><li> Para dissociar o tecido, sacos primeiro lugar gema e AGMs em tubos separados. </li><li> Girar rapidamente para tecidos pellet e descartar PBS com 10% de FBS. </li><li> Ressuspender tecidos colagenase 0,25% em PBS com FBS 20%, com volume suficiente para cobrir adequadamente os tecidos. </li><li> Incubar os tecidos a 37 graus. 25-30mins para AGMs e 35-40mins de gema de sacos. </li><li> No final da incubação, gentilmente pipeta tecidos para cima e para baixo para dissociação em suspensões única célula. </li><li> Lavar os tecidos com excesso de PBS wiº 10% FBS, agregar as células e ressuspender em fresco PBS estéril com 10% de FBS. </li><li> Para a análise FACS, as células são coradas de acordo com recomendações do fabricante. Nós usamos um FACSAria da BD Biosciences para executar citometria de fluxo. Devido ao tamanho e fragilidade das células embrionárias, a abertura de triagem é ajustado para um diâmetro maior do que para adultos células hematopoiéticas, que também estudo no laboratório. Da mesma forma, a pressão é ajustado para ser menor do que as condições exigidas pelo adulto células hematopoiéticas. Por exemplo, a triagem no FACSAria, o tamanho do bico seria 100 microns ea pressão espécie seria de 30 psi. </li><li> Para as análises de células-tronco, células positivas triple expressando a cKit marcadores, CD34, CD41 e são isoladas e classificadas a partir do saco vitelino e positivos duplo (cKit, CD34) são isolados a partir da AGM via FACS. Um gráfico típico ficaria assim: cKit células positivas são analisadas para CD34 e CD41 em simultâneo ou individualmente. Normalmente, células apresentam uma gradação de positividade para cada marcador com a população de células-tronco encontradas como um subconjunto das populações positivo. Estes gráficos mostram-nos que temos conseguido um bom rendimento celular com 100-300 células por saco vitelino e AGM por. </li></ol>

isolamento de células-tronco hematopoéticas início de murino saco vitelino e agm

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

No embrião de rato, hematopoiese precoce ocorre simultaneamente em múltiplos órgãos, que inclui o saco vitelino e aorta-gônadas-mesonefro região. Estas regiões são fundamentais na definição do sistema sanguíneo nos embriões e leva ao movimento eventual de células-tronco no fígado fetal e, em seguida, o desenvolvimento de células-tronco adultas na medula óssea. Início de células-tronco hematopoéticas podem ser isolados a partir desses órgãos através da microdissecção do embrião seguido de triagem de citometria de fluxo para obter uma população mais puro. Ainda não está claro como estas populações de células-tronco contribuem para a piscina fetal e células-tronco adultas. Além disso, nosso laboratório investiga como as células-tronco no início funcionalmente diferem fetal e adulto de células-tronco hematopoiéticas. Além disso, classifica o nosso laboratório de diferentes populações de células-tronco hematopoéticas e testar seu papel funcional no contexto de uma variedade de modelos genéticos. Neste vídeo, demonstramos o processo de micro-dissecção que utilizamos com freqüência e também mostrar os resultados de um plotfter FACS típico isolar estas populações raro, é possível executar uma variedade de testes funcionais, incluindo: testes de colônia e transplantes de medula óssea.

Este vídeo mostra como micro-dissecar o saco vitelino e aorta-gônadas-mesonefro região a partir de embriões e uso de citometria de fluxo para classificar as células-tronco hematopoiéticas.

Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas início de murino saco vitelino e AGM

No embrião de camundongo, a hematopoiese precoce ocorre simultaneamente em múltiplos órgãos, os quais incluem o saco vitelino e a região aorta-gônada-mesonefro. Estes...

No embrião de camundongo. A hematopoiese inicial ocorre simultaneamente em múltiplos órgãos, incluindo o saco vitelino, o aglomerado aórtico e a região meris. Mais importante ainda, as células-tronco hematopoiéticas iniciais podem ser isoladas desses órgãos por meio de microdissecação do embrião, seguida de separação por citometria de fluxo para obter uma população mais pura.Neste vídeo, demonstramos o procedimento de microdissecção que comumente utilizamos e também mostramos os resultados de um gráfico de fax típico. Olá, sou Kelly Morgan do laboratório do Dr. Gary Gilland no Instituto Médico Howard Hughes e no Departamento de Medicina do Hospital Brigham and Women's, e fui formalmente treinada por Elaine Dza no Centro Médico da Universidade de Rasmus, em Roterdã. Hoje vou mostrar a vocês o procedimento para dissecção embrionária com o objetivo de obter células-tronco hematopoiéticas precoces do saco vitelino e da região da aorta-gônadas-mesonefros, ou AGM. E eu sou Michael Care.Também do Go Lab. Vou mostrar como obter suspensões de células isoladas de células GM e de células do saco vitelino para CSHs usando fatos. Este procedimento envolve a dissecação de órgãos hematopoiéticos

isolation-early-hematopoietic-stem-cells-from-murine-yolk-sac

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar camundongos do sistema imunológico humano (HIS). As células-tronco hematopoiéticas CD34+ (HSCs) são isoladas de células do revestimento leucocitário do sangue do cordão umbilical humano usando esferas magnéticas revestidas com anticorpos. As HSCs CD34+ são expandidas em meio de crescimento enriquecido com citocinas e criopreservadas. Finalmente, os HSCs descongelados são injetados em um filhote de camundongo imunodeficiente para estabelecer o modelo...

Isolando células-tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical para gerar camundongos do sistema imunológico humano

células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

Este protocolo descreve o uso culto Aorta-gônada-Mesonephros para análises de expressão, unidades formadoras de colônia, na cultura e baço e reconstituição de longo prazo para determinar o efeito de fatores regulatórios e vias de sinalização no tronco hematopoiético desenvolvimento da célula. Isto foi demonstrado como um sistema eficaz para estudar a função e biologia de células-tronco hematopoiéticas.

Aplicação do sistema de cultura Aorta-gônada-mesonephros explante na hematopoiese do desenvolvimento

Aqui apresentamos a metodologia para a análise clonal de precursores de células-tronco hematopoéticas durante o desenvolvimento embrionário murino. Combinamos que o índice de classificação de células únicas da região de aorta-gônada-mesonephros embrionária com co-cultura de células endoteliais e transplante para caracterizar as propriedades fenotípicas e potencial de enxertia de precursores hematopoiéticos único.

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

Este método descreve a purificação por citometria de fluxo de MEP e MKp de fêmures, tíbias e ossos pélvicos.

Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato

Apresentamos um protocolo passo a passo para o isolamento de células-tronco hematopoéticas de longa duração (CT-HSCs) e CTHs de curta duração (CTH-ST) utilizando o sistema repórter Hoxb5.

Método de Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas de Longa e Curta Duração

Este estudo estabeleceu um método estável e eficiente para o isolamento, cultura e determinação funcional de células-tronco CD34+ residentes na parede vascular (CD34+ VW-SCs). Este método de isolamento fácil de seguir e eficaz em termos de tempo pode ser utilizado por outros investigadores para estudar os mecanismos potenciais envolvidos nas doenças cardiovasculares.

Isolamento imunomagnético das células-tronco CD34+ residentes na parede vascular de camundongos

Aqui apresentamos protocolos que permitem o isolamento de células estromais de osso murino, medula óssea, timo e tecido tímico humano compatível com multiômica de célula única.

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

Aprenda a isolar células-tronco hematopoéticas de embriões de murinos através de microdissecação do saco vitelino e região AGM, seguida de citometria de fluxo. Este método permite obter populações puras para estudos de hematopoiese.

Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas início de murino saco vitelino e AGM

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