Name: Labeling retrógrada de células ganglionares da retina através da aplicação de Fluoro-Gold na superfície do colículo superior (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:19:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Aprenda a rotulagem retrógrada de células ganglionares da retina usando Fluoro-Gold aplicado no colículo superior. Esta técnica permite visualizar vias neuronais e avaliar efeitos de drogas na sobrevivência celular.

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Os autores gostariam de agradecer o apoio do Programa Nacional de Glaucoma da Fundação Americana de Saúde Adjunto.

<ol><li> Anestesiar o rato por injeção intra-peritoneal de cetamina (80mg/kg) e xilazina (8mg/kg) (relação de volume de 2:1). Aplicar pomada lubrificante estéril olho para evitar o ressecamento das córneas durante a cirurgia. </li><li> Raspar os pêlos da cabeça (do olho ao nível do ouvido) e fixar a cabeça no palco cabeça por uma cabeça de fixação e defina seu incisivos na barra incisivo. </li><li> A área de operação desinfectados com solução de iodo povidona 10% seguido pelo álcool 70%. </li><li> Cortar a pele e os músculos para expor crânio e suturas (sagital, coronal e transversal suturas) (Figura 1). Aplicar analgésico, bupivicaine como um respingo para a área de incisão (não exceder 2 mg / kg). </li><li> Furar um buraco crânio (ø mm 2x2, 0,5 mm de ambas as suturas sagital e transversal) de cada lado da sutura sagital. Evitar a ruptura das meninges e do seio deitada debaixo das suturas. <img src="/files/ftp_upload/old/819_2008_6_18_3/ratSkull.png" alt="Marcas no crânio de ratos vivos." width="469" height="317" /> Figura 1. Marcas no crânio de ratos vivos. </li><li> Cortar as meninges por tesouras primavera, evitar rasgar. </li><li> Aspirar o conteúdo cerebral que se encontra sobre a superfície dorsal do colículo superior cuidadosamente pela bomba de vácuo e três pontos de verificação podem ser observadas: <ol><li> a cor do tecido cerebral muda de cinza para branco ao cinza </li><li> parar quando a aspiração do líquido cefalorraquidiano incolor sair </li><li> cuidadosamente ampliar o nível mais baixo de sucção horizontal para expor o colículo amarelada superiores abrangidos pela dura </li></ol></li><li> Aspirar o conteúdo do cérebro ao longo SC até quatro bordas de SC podem ser observados diretamente sob o microscópio. A porção do córtex cerebral removido deve ser o mínimo para evitar efeitos colaterais indesejáveis ​​(por exemplo, disfunção motora). Tenha cuidado para não tocar o seio. </li><li> Absorver o líquido no buraco com listra fina de algodão estéril para tornar a superfície do SC tão seca quanto possível. Em seguida, coloque uma camada fina de gelatina esponja pré-embebidas com 6% Fluoro-Gold na superfície de SC (FG é absorvido pelos terminais dos axônios de células ganglionares da retina bilateralmente e transportados retrogradamente à sua somas na retina). </li><li> Encha o buraco com gelfoam e fechar a ferida da pele com clips de sutura. </li><li> Os animais foram autorizados a se recuperar com luz incandescente para manter aquecido. Analgésico, a buprenorfina (100mcg/kg), é aplicada por via oral na água de beber durante 5 dias após a rotulagem SC. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+double+labeling+of+retinal+ganglion+cells+in+the+newborn+and+adult+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat.</a> Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
<li>Forrester, J., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibers+in+the+optic+nerve+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerve fibers in the optic nerve of rat.</a> Nature. 214, 245-247 (1967).</li>
<li>Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF+promotes+survival+of+retinal+ganglion+cells+after+induction+of+ocular+hypertension+in+rats%3A+the+possible+involvement+of+STAT3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway.</a> European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).</li>
<li>Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells+Are+More+Injury-Resistant+in+a+Chronic+Ocular+Hypertension+Model.+Investigative%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative.</a> Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).</li>
</ol>

<ol><li> Por que usar este método cirúrgico para a contagem de células ganglionares da retina? Em ratos cerca de 98% das células ganglionares da retina (RGC) são conhecidas por projeto para o colículo contralateral superior (SC). Aplicação de flúor em dourado sobre a superfície do SC pode rotular quase todos os RGCs, para que possamos concentrar-se neste neurônio mais vulneráveis ​​da retina em glaucoma. Compare com rotulagem retrógrado de RGC colocando FG no coto do nervo óptico seccionado por 2 dias, a interferência de sobrevivên...

labeling retrógrada de células ganglionares da retina através da aplicação de fluoro-gold na superfície do colículo superior

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus

Contagem de células ganglionares da retina (RGC) é essencial para avaliar a degeneração da retina especialmente em glaucoma. Rotulagem RGC confiável é fundamental para avaliar os efeitos de qualquer tratamento. Em ratos, cerca de 98% do RGCs é conhecido por projeto para o colículo contralateral superior (SC) (Forrester e Peters, 1967). Aplicando fluoro-gold (FG) na superfície de SC pode rotular quase todos os RGCs, para que possamos concentrar-se neste neurônio mais vulneráveis ​​da retina em glaucoma. FG é ocupada pelos terminais dos axônios de células ganglionares da retina bilateralmente e transportados retrogradamente à sua somas na retina. Compare com rotulagem retrógrado de RGC colocando FG no coto do nervo óptico seccionado por 2 dias, a interferência de sobrevivência RGC é minimizado. Compare com coloração violeta cresil que as manchas RGCs, células amácrinas e endotélio dos vasos sanguíneos na camada de células ganglionares da retina, este método de marcação é mais específico para o RGC. Este vídeo descreve o método de rotulagem retrógrado de RGC aplicando FG sobre a superfície de SC. Os procedimentos cirúrgicos incluem a perfuração do crânio; aspiração do córtex para expor a SC e aplicação de esponja de gelatina sobre a superfície dorsal inteiro de SC são mostrados. Dicas úteis para evitar hemorragia intracraniana maciça e aspiração do SC foram dadas.

Este vídeo descreve o método de rotulagem retrógrado de RGC aplicando fluoro-gold (FG) na superfície do colículo superiores (SC). Técnica envolve a perfuração do crânio, aspiração do córtex, e aplicação de esponja de gelatina sobre a superfície dorsal de toda SC.

Labeling retrógrada de células ganglionares da retina através da aplicação de Fluoro-Gold na superfície do colículo superior

A contagem de células ganglionares da retina (CGR) é essencial para avaliar a degeneração retiniana, especialmente no glaucoma. A marcação confiável de CGR é fundamental para...

Olá, sou Tu do Laboratório GOSO na Universidade de Hong Kong. Hoje vou apresentar como rotular retrogradamente rato. Célula ganglionar da retina.As células ganglionares da retina serão retrogradamente marcadas pela aplicação de corante fluorescente na superfície do colículo superior, de modo que posteriormente possamos contar as células ganglionares da retina na preparação planar da retina para avaliar a morte celular ou o efeito do fármaco aplicado. Esta é uma foto que ilustra a via do nervo óptico da retina até o colículo superior. O corante fluorescente CLE pode ser transportado retrogradamente do colículo superior CLE através do trato óptico.Cruze o quiasma óptico através do nervo óptico até a retina no olho. Utilizamos microscópio cirúrgico para realizar a cirurgia. Use a bomba para aspirar o córtex cerebral sobre a superfície dorsal do estágio de cabeça CLE, a fim de manter o chapéu vermelho em posição.Ke e seno para fixar o ratinho para abertura da calota craniana e ponta de ciúme absorvível para aplicar o corante fluorescente FG sobre a superfície do clickless. Os instrumentos foram autoclavados antes da operação, incluindo pinças finas, tesoura de mola, agulha de vácuo, ponta de broca e clipes de sutura. Lâmina cirúrgica para cortar a pele, régua para medição e algodão também estão em condição esterilizada.Analisamos o vermelho por injeção tónica de cetamina e gel de sine. Após a depilação da região desde o nível dos olhos até o nível das orelhas, desinfetamos a área cirúrgica com iodo de própano, seguido de álcool 70%. Em seguida, posicionamos o boné vermelho na plataforma craniana.Corte a pele ao longo da linha mediana da cabeça, começando do nível do olho até o nível das orelhas. Em seguida, temos uma boa exposição da sutura coronal, sutura sagital, sutura transversa, e este é o BMA e este é o Lambda. Marque o parafuso a 0,5 a um milímetro da extremidade anterior da sutura transversa e, em seguida, rotule-os em ambos os lados, espelhando novamente para garantir que a marcação esteja a pelo menos 0,5 milímetro de distância das suturas.Então podemos começar a fazer um furo ao longo do lado marcado, controlando a velocidade e a direção da broca até obter uma ruptura ampla das meninges e do revestimento do seio abaixo da sutura. Interrompa a perfuração quando o diâmetro atingir cerca de dois milímetros. Em seguida, iniciamos novamente o outro lado espelhado para garantir que o furo tenha o tamanho e a localização corretos.Corte as meninges com a tesoura de anel, use uma pinça fina para remover os detritos ósseos do orifício. Agora podemos iniciar a aspiração utilizando a bomba de vácuo. A primeira camada do BR é a substância verde, cortada juntamente com as meninges novamente.Então você pode observar a cor da célula T mudando para branco. Essas são as substâncias brancas do cérebro. Realize a aspiração com cuidado e lentamente.Agora podemos ver novamente as substâncias cinzentas. A cor está ficando menos branca. É possível observar que é cinza na parte inferior.Entendo. Então, você pode ver ali que o LCR claro está saindo. Isso significa que estamos alcançando a superfície dorsal do corpo caloso superior.Novamente, um orifício alargado nesse nível. E então, na parte inferior, podemos observar a dura revestindo o clus superior com coloração amarelada. Realiza-se a aspiração horizontal nesse nível para evitar danificar o conteúdo do clus superior.Então podemos começar o processo como um todo. Veja a matéria verde. Na verdade, é de cor verde.E então chegamos à substância branca. A cor do tecido é branca. Agora você pode ver o LCR surgindo abaixo dessa cor cinzenta tão nitidamente.Remova aquela última camada de matéria cinzenta e então a dura-máter amarela será exposta. Tenha cuidado para romper a dura-máter sobre os cliques separados e, em seguida, alargue o orifício. Tente garantir que toda a borda dos cliques possa ser observada ao microscópio.Você pega o suporte da cabeça do estágio em diferentes ângulos e realiza alguma aspiração final até que as quatro bordas do CLE possam ser observadas diretamente sob o microscópio. Absorva o líquido no orifício com uma tira fina de algodão para tornar a superfície do CLE tão resistente quanto possível. Pegue um pedaço de gelatina, pontue aquela previamente silicada com ouro a 6% e separe-a em pedaços ecológicos.Transforme-o em uma camada fina, com tamanho um pouco maior que toda a superfície dorsal da parte superior. Coloque-o cuidadosamente sobre a superfície dos cliques superiores e, em seguida, do lado oposto. Posicione-o dentro do orifício, cobrindo toda a superfície do clus, passando pelos orifícios com jatos cada vez menores.Por fim, feche a ferida na pele com clipes cirúrgicos e limpe a ferida após a cirurgia, coloque o animal de volta em uma gaiola limpa e permita que se recupere. E mantenha as condições aquecidas. O animal comporta-se normalmente após a operação enquanto estiver acordado.Sete dias após a marcação por via subcutânea, dissecamos a retina e a montamos plana, em seguida contamos as células ganglionares retinianas e o microscópio epinal utilizando filtro UV. Como 98% das células ganglionares retinianas projetam para os colículos superiores, uma marcação confiável no ST é fundamental para a avaliação da progressão da doença e do efeito de fármacos. Este é um exemplo de célula ganglionar retiniana marcada retroalimentadamente em uma retina montada plana.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Noventa por cento das células ganglionares da retina (RGCs) cujos axônios são completamente seccionado (axotomia) morrem dentro de 14 dias após a axotomia. Esse modelo se adequa facilmente a manipulações experimentais e altamente reprodutível.

Transecção do nervo óptico: Um Modelo de Apoptose Neuron Adultos no Sistema Nervoso Central

Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Este modelo é ideal para a realização de uma série de manipulações experimentais que visam a retina globalmente ou diretamente a população-alvo feridos neuronal de células ganglionares da retina.

Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos

Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

Transporte retrógrado de corante fluorescente rotula uma sub-população de neurónios baseado em projecção anatómica. Axônios rotulados pode ser alvo...

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

Fonte: Inal, M. A. et. al., Rastreamento retrógrado de Drosophila neurônios motores embrionários usando corantes fluorescentes lipofílicos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o método de rotulagem retrógrada de Drosophila neurônios motores usando corantes lipofílicos. O corante entra no axônio, viaja retrógrada e rotula os neurônios em verde, permitindo a visualização detalhada de sua morfologia e projeções sob um microscópio confocal.

Marcação retrógrada de neurônios motores de Drosophila usando corantes lipofílicos fluorescentes

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/ single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere, et. al. RNA-seq de célula única de subconjuntos definidos de células ganglionares da retina. J. Vis. exp. (2017). Este vídeo demonstra uma técnica de rastreamento fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares da retina (RGC) em uma retina de camundongo transgênico. O processo envolve proteger a retina isolada em uma...

Identificação de subtipos de células ganglionares da retina de camundongos por meio de rastreamento fluorescente

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Marcação retrógrada de células ganglionares da retina em Zebrafish Adulto com corantes fluorescentes

O método de imunoouro pós-incorporação é uma das maneiras mais eficazes de fornecer análises de alta resolução da localização subcelular de moléculas específicas. Aqui descrevemos um protocolo para analisar quantitativamente os receptores de glutamato nas sinapses da fita retiniana.

High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses

Milhões de pessoas sofrem de doenças degenerativas da retina que resultam em cegueira irreversível. Um elemento comum de muitas dessas doenças é a perda de células ganglionares da retina (RGCs). Este protocolo detalhado descreve o isolamento de RGC murinos primários por seleção positiva e negativa com citometria de fluxo.

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Secundária degeneração das células ganglionares da retina (RGCs) comumente ocorre no glaucoma. Este estudo descreve uma abordagem inovadora e operativa para transecção parcial nervo óptico. O uso dessa abordagem operativa de economia de espaço amplia gama de aplicação do modelo e permite a exploração dos mecanismos de lesão secundária em RGCs de uma maneira nova.

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Aprenda a rotulagem retrógrada de células ganglionares da retina usando Fluoro-Gold aplicado no colículo superior. Esta técnica permite visualizar vias neuronais e avaliar efeitos de drogas na sobrevivência celular.

Labeling retrógrada de células ganglionares da retina através da aplicação de Fluoro-Gold na superfície do colículo superior

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