Name: Principal Dissociated Midbrain dopamina culturas de células de recém-nascidos de roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Aprenda a gerar culturas primárias de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo a partir de neonatos de roedores. Este método permite estudar a liberação de dopamina e características pré-sinápticas in vitro.

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O trabalho foi suportado por DK065872 (PEV), uma Smith Award Foundation Família de Excelência em Pesquisa Biomédica (PEV), F31 DA023760 (BMG, PEV) e P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research).

<ol><li>Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+defective+mesolimbic+dopamine+exocytosis+in+obesity-prone+rats%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats.</a> FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).</li>
<li>Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dopamine+quantal+size+in+midbrain+and+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons.</a> Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).</li>
<li>Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+transporter+expression+regulates+vesicle+phenotype+and+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).</li>
<li>Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+recording+of+quanta+from+midbrain+dopamine+neurons+and+modulation+of+the+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+mechanisms+that+regulate+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Presynaptic mechanisms that regulate quantal size.</a> Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).</li>
</ol>

Os métodos descritos aqui permitem resolução fina de características morfológicas e neuroquímicas dos neurônios dopaminérgicos centrais que não estão disponíveis de outra forma em uma abordagem sistêmica ou em vivo.

Materiais estão incluídos no texto do protocolo.

principal dissociated midbrain dopamina culturas de células de recém-nascidos de roedores

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

A capacidade de criar culturas de células primárias de neurônios de dopamina permite o estudo das características pré-sináptica dos neurônios de dopamina no isolamento da entrada sistêmica de outras partes do cérebro. Em nosso laboratório, usamos esses neurônios para avaliar a cinética de liberação de dopamina usando amperometria de fibra de carbono, bem como níveis de expressão de genes relacionados a dopamina e proteínas usando PCR quantitativo e imunocitoquímica. Neste vídeo, vamos mostrar como podemos gerar essas culturas de recém-nascidos de roedores. O processo envolve várias etapas, incluindo o revestimento de astrócitos corticais glial, o condicionamento de meios de cultura de células neuronais pelo substrato glial, a dissecção do mesencéfalo em recém-nascidos, a digestão, extração e cultivo de neurônios de dopamina e da adição de fatores neurotróficos para garantir a sobrevivência da célula. As aplicações adequadas para tal preparação incluem eletrofisiologia, imunocitoquímica, PCR quantitativo, a microscopia de vídeo (ou seja, em tempo real de fusão vesicular com a membrana plasmática), ensaios de viabilidade celular e outras telas toxicológicos.

Principal dissociada mesencéfalo culturas de células de dopamina permitir o estudo das características pré-sináptica dos neurônios dopaminérgicos. Eles podem ser usados ​​para monitorar em tempo real a cinética de liberação de dopamina e proteína / mRNA níveis de reguladores de exocitose dopamina. Aqui, nós mostrar-lhe como gerar essas culturas de recém-nascidos de roedores.

Principal Dissociated Midbrain dopamina culturas de células de recém-nascidos de roedores

A capacidade de criar culturas primárias de células de neurônios dopaminérgicos permite o estudo das características pré-sinápticas de neurônios dopaminérgicos isoladamente ...

Olá, sou Lauren Frank do Laboratório de Emmanuel Pothos, do departamento de Farmacologia e Terapêutica Experimental na Escola de Medicina da Tufts University. E eu sou Emmanuel Pothos. Hoje vamos mostrar um procedimento para gerar culturas primárias de células dopaminérgicas do mesencéfalo a partir de roedores neonatos.Este procedimento inclui as seguintes etapas: preparar ferramentas e reagentes, dissecar o mesencéfalo de cérebros de roedores P0 a P2, seccionar os segmentos cerebrais e semear os neurônios dissociados. Então, vamos começar.Este procedimento envolve uma série de etapas de preparação que devem ser realizadas com antecedência, de duas a três semanas antes da geração do cultivo de neurônios dopaminérgicos. As células gliais devem ser semeadas para que tenham tempo de proliferar e cobrir o fundo das placas. Os neurônios dopaminérgicos primários serão cultivados sobre uma monocamada de células gliais de um a sete dias antes do cultivo primário de células neuronais. Remova o meio das células gliais e substitua por dois mililitros de meio neuronal fresco no dia anterior ao cultivo de AC; todos os itens, exceto os instrumentos de dissecação, devem ser esterilizados usando l

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método para gerar fatias organotípicas da E12.5 mesencéfalo embrionário murino é descrito. As culturas fatia organotípicas pode ser usado para observar o comportamento de neurônios dopaminérgicos ou outros neurônios do mesencéfalo ventral.

Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

Este vídeo descreve um método para cultivar neurônios dopaminérgicos a partir de tecido cerebral embrionário de camundongo. O processo inclui o tratamento do mesencéfalo com uma enzima proteolítica, destacando as células e cultivando-as em lamínulas revestidas de polímero em um meio rico em nutrientes com antibióticos para seu crescimento e viabilidade a longo prazo.

Cultura e manutenção de neurônios dopaminérgicos do tecido cerebral embrionário de camundongos

O vídeo demonstra o processo de isolamento e cultura de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo de embriões de camundongos. Os assoalhos do mesencéfalo ventral isolados são dissociados usando enzimas. Os neurônios dopaminérgicos resultantes são colhidos e transferidos para micro-ilhas dentro de placas de vários poços. As células são incubadas com um meio de neurônio dopaminérgico para manter as células em alta densidade dentro das micro-ilhas.

Isolamento e cultura de neurônios dopaminérgicos embrionários primários do mesencéfalo de camundongos

Este vídeo demonstra o processo de quantificação do acúmulo de alfa-sinucleína em neurônios de dopamina embrionários de camundongos pré-tratados com fibrilas pré-formadas de alfa-sinucleína. Ele descreve as etapas para fixar, corar e quantificar os neurônios dopaminérgicos contendo agregados de alfa-sinucleína usando imunofluorescência.

Estudando o acúmulo de alfa-sinucleína em neurônios embrionários primários de dopamina de camundongo

Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Os neurônios dopaminérgicos desempenham um papel regulador vital no cérebro. Sua perda está associada à doença de Parkinson. Neste vídeo, mostramos como gerar culturas primárias de neurônios dopaminérgicos centrais a partir de mesencéfalo embrionário de camundongo. Tais culturas são úteis para estudar a extrema vulnerabilidade desses neurônios a vários estresses.

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

As causas da degeneração dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo durante a doença de Parkinson não são totalmente compreendidas. Os sistemas de cultura celular fornecem uma ferramenta essencial para o estudo das propriedades neurofisiológicas desses neurônios. Aqui apresentamos um protocolo otimizado, que pode ser utilizado para modelagem in vitro da neurodegeneração.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Na doença de Parkinson (PD), substância negra (SNC) neurónios dopaminérgicos degenerar, conduzindo a disfunção motora. Aqui nós relatamos um protocolo para a cultura de neurônios do mesencéfalo ventral de um ratinho expressando eGFP impulsionado por uma sequência de promotor de tirosina hidroxilase (TH), a colheita neurônios fluorescentes individuais das culturas, e medir o seu transcriptoma usando RNA-seq.

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

O protocolo apresenta a reprogramação de células mononucleares do sangue periférico para induzir células-tronco neurais por infecção pelo vírus de Sendai, diferenciação de iNSCs em neurônios dopaminérgicos, transplante de precursores da DA na unilateralmente lesionada Modelos do rato da doença de Parkinson, e avaliação da segurança e da eficácia de precursores DA DA do iNSC-derivados para o tratamento do paládio.

Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para estudar o acúmulo neuronal de α-sinucleína em neurônios primários de dopamina de camundongos. Os agregados fosforilados de α-sinucleína em neurônios são induzidos com fibrilas pré-formadas de α-sinucleína. Imagens automatizadas de células imunofluorescentamente rotuladas e análise de imagem imparcial tornam este protocolo robusto adequado para a triagem de rendimento médio a alto de drogas que inibem o acúmulo de α-sinucleína.

Estudando o acúmulo de α-sinucleína induzida por fibril pré-formado em neurônios de dopamina de cérebro médio do camundongo embrionário primário

Este protocolo descreve a cultura celular de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo humano, seguida de coloração imunológica e geração de perfis fenotípicos neuronais a partir de imagens microscópicas adquiridas de alto conteúdo, permitindo a identificação de variações fenotípicas devido a modulações genéticas ou químicas.

Perfil Fenotípico de Neurônios Dopaminérgicos do Mesencéfalo Derivados de Células-Tronco Humanas

Aprenda a gerar culturas primárias de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo a partir de neonatos de roedores. Este método permite estudar a liberação de dopamina e características pré-sinápticas in vitro.

Principal Dissociated Midbrain dopamina culturas de células de recém-nascidos de roedores

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