Principal Dissociated Midbrain dopamina culturas de células de recém-nascidos de roedores

Olá, sou Lauren Frank do Laboratório de Emmanuel Pothos, do departamento de Farmacologia e Terapêutica Experimental na Escola de Medicina da Tufts University. E eu sou Emmanuel Pothos. Hoje vamos mostrar um procedimento para gerar culturas primárias de células dopaminérgicas do mesencéfalo a partir de roedores neonatos.

Este procedimento inclui as seguintes etapas: preparar ferramentas e reagentes, dissecar o mesencéfalo de cérebros de roedores P0 a P2, seccionar os segmentos cerebrais e semear os neurônios dissociados. Então, vamos começar.

Este procedimento envolve uma série de etapas de preparação que devem ser realizadas com antecedência, de duas a três semanas antes da geração do cultivo de neurônios dopaminérgicos. As células gliais devem ser semeadas para que tenham tempo de proliferar e cobrir o fundo das placas. Os neurônios dopaminérgicos primários serão cultivados sobre uma monocamada de células gliais de um a sete dias antes do cultivo primário de células neuronais. Remova o meio das células gliais e substitua por dois mililitros de meio neuronal fresco no dia anterior ao cultivo de AC; todos os itens, exceto os instrumentos de dissecação, devem ser esterilizados usando luz UV, incluindo 12 placas de dissecação.

Dois frascos de dissociação com um bastão magnético micro. Duas tampas de frasco com dois pequenos orifícios furados na parte superior. Anéis deslizantes dispostos separadamente.

E a caixa do anel deslizante, lembre-se de deixá-la aberta. Todas essas ferramentas são revestidas com etanol 70% antes do início do dia do cultivo. Primeiro, pegue todos os constituintes da solução de pepane que serão usados para dissociar a solução de neurônios primários do congelador e deixe-os descongelar.

Configure uma placa aquecedora para aquecer um béquer com água até 34 graus Celsius para a digestão e prepare água saturada com carbogênio para oxigenação da solução de pepane. Durante a digestão, 15 tubos estéreis contendo quatro a seis mililitros de PBS estéril para lavagem dos cérebros antes da dissecação são preparados e colocados em gelo. Vinte a trinta mililitros de meio neuronal fresco são separados e colocados no incubador.

Em seguida, prepara-se o frasco de dissociação utilizando uma unidade de filtração estéril com tampa articulada para filtrar a solução de pepanase, que é então transferida para o frasco de dissociação com uma tampa rosqueável de 25 mililitros; insere-se uma seringa estéril, faz-se um orifício na tampa, o qual é conectado a um filtro de 0,2 mícron. Conecta-se o carbogênio ao filtro e fixa-se com filme parafilm. Coloca-se o frasco sobre o disco de isopor.

Uma vez que o frasco de dissociação esteja no lugar, certifique-se de que o agitador magnético esteja em movimento. O gás está entrando no frasco e a temperatura está estabilizada a 34 graus Celsius. O microscópio de dissecação é colocado na cabine e os instrumentos de dissecação são dispostos sobre uma folha de papel alumínio.

Em seguida, disponha um quadrado grande de papel alumínio e 12 quadrados menores. Deixe um par de tesouras para decapitações junto ao papel alumínio. Coloque uma caixa de isopor com água gelada fora da cabine de segurança.

Em seguida, prepare o anestésico, que é uma mistura de 0,075 mililitro de ketamina e 0,075 mililitro de xilazina. Depois, obtenha pelo menos 12 filhotes de P zero a P dois para placas de 135 milímetros com um disco de vidro de 23 milímetros. No caso de camundongos, certifique-se de que haja compatibilidade de genótipo para toda a ninhada.

Se o genótipo for desconhecido, as células de cada animal precisarão ser semeadas em placas separadas e registros precisos deverão ser mantidos para associar as células aos resultados subsequentes de genotipagem. Para iniciar a dissecção, anestesie o primeiro animal com uma injeção intraperitoneal de ketamina xilazina. Quando o animal não responder ao teste de reflexo da cauda, coloque-o em água com gelo por 30 segundos até que fique hipotérmico.

Em seguida, enxágue uma pequena folha de papel alumínio, bem como a tesoura de decapitação e a cabeça do animal, com etanol 70% para evitar contaminação do tecido cerebral durante a dissecação. Decapite com a tesoura, deixe a cabeça cair sobre a folha de papel alumínio e transfira-a para sob a capela. Remova cuidadosamente o cérebro, primeiro cortando a pele com a tesoura pequena para expor o crânio. Corte ao redor do crânio em 360 graus.

Em seguida, retire a calota craniana com pinça. Remova o cérebro do crânio utilizando uma espátula pequena e coloque-o em um tubo de 15 mililitros com gelo. PBS frio, coloque o tubo de volta no gelo antes de remover o próximo cérebro S.

Repita as dissecações até haver três cérebros em tubos separados sobre gelo. Despeje um cérebro e PBS sobre o primeiro recipiente de dissecação. Sob o microscópio, posicione o cérebro sobre uma plataforma de cola sill guard que servirá de amortecedor para manter a lâmina afiada.

Use uma pipeta de transferência para colocar os segmentos em um tubo novo com PBS, a fim de lavar os segmentos antes de transferi-los para a solução de pepain. Inicie um cronômetro quando os primeiros segmentos forem colocados e continue as dissecações até que todos os cérebros estejam em digestão. Na papaina.

Os primeiros segmentos cerebrais terão estado em digestão por cerca de uma hora. Até o momento em que os últimos segmentos forem adicionados, permita que a digestão prossiga por mais uma hora durante o processo. Certifique-se de que a temperatura no banho de pepanase esteja estabilizada a 34 graus Celsius.

Para iniciar a etapa de centrifugação, use uma pipeta de transferência para colocar os segmentos cerebrais em um tubo estéril de 15 mililitros. Tente evitar o excesso de solução de pepane. No entanto, se isso ocorrer, remova o excesso de pepane.

Em seguida, lave os segmentos adicionando dois mililitros de meio neuronal aquecido proveniente da estufa. Deixe os segmentos sedimentarem e, então, descarte cuidadosamente o máximo de solução possível sem perturbar os segmentos. Realize um total de três lavagens.

Lembre-se de trocar as pipetas entre as lavagens para evitar contaminação, utilizando uma pipeta nova a cada transferência. Inicie as iterações em dois mililitros de meio neuronal. Triture 25 vezes, evitando a entrada de bolhas de ar.

Em seguida, deixe os segmentos não associados sedimentarem por três minutos. Utilize uma pipeta de transferência para coletar o máximo possível do sobrenadante sem perturbar os segmentos no fundo. Mantenha o sobrenadante em um novo tubo estéril de 15 mililitros.

Repita o passo anterior utilizando uma ponteira de pipeta de 1000 microlitros e, em seguida, uma ponteira de 200 microlitros, após o que os segmentos devem parecer completamente dissociados a olho nu. O sobrenadante de todas as etapas é coletado no mesmo tubo de 15 mililitros. Estamos prontos para semear as células, que finalmente são homogeneizadas 10 vezes com uma pipeta de transferência para obter uma suspensão celular homogênea para contagem.

Usando uma ponta de pipeta amarela estéril, cubra cada ponta da pinça. Coloque cuidadosamente um anel de lâmina o mais centralizado possível sobre o vidro. Dentro de cada placa, esses anéis serão usados para isolar uma área dentro da placa de cultura onde os neurônios serão semeados.

Use a ponta de pipeta para deslizar os anéis sobre o poço central de cada placa. Em seguida, adicione cuidadosamente o volume apropriado de células à placa. Adicione as células ao centro do anel que você já colocou na placa.

Lembre-se de trocar as ponteiras para cada placa. Em seguida, adicione cem microlitros de solução diluída de GDNF o mais próximo possível da parte externa do anel em cada placa para auxiliar na proliferação de neurônios. Em seguida, o inibidor da mitose fluoro-2-desoxiuridina ou FDU é adicionado fora do anel para impedir o crescimento excessivo de células gliais.

As pontas de pipeta frequentemente retornam ao incubador e permitem que as células sedimentem durante a noite no dia seguinte; utilize pontas de pipeta estéreis para cobrir as pontas da pinça, remova os anéis, devolva as placas ao incubador e perturbe-as o mínimo possível até o momento dos experimentos. Verifique as placas diariamente quanto à possível contaminação e, se observada, remova imediatamente as placas problemáticas. Os cultivos estarão prontos para uso em eletrofisiologia, experimentos de biologia molecular e imunocitoquímica dentro de três semanas.

Agora que as células foram semeadas, vamos analisar alguns exemplos representativos das células em cultura. Aqui estamos observando uma cultura primária que foi semeada há 14 dias. Este é um exemplo de uma boa cultura, pois é possível ver corpos celulares distintos com prolongamentos saindo deles.

Além disso, observe a ausência de qualquer crescimento de mofo ou fungo na placa, o que indicaria uma infecção. Acabamos de mostrar como gerar culturas primárias dissociadas de células dopaminérgicas do mesencéfalo a partir de roedores neonatos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter um ambiente estéril, utilizar apenas neonatos de P zero a P dois, semear em substratos gliais saudáveis com meio condicionado por células gliais e manter uma densidade de semeadura consistente.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.