Name: De MEFs para Matrigel 2: hESCs Divisão de MEFs para Matrigel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-09T18:48:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda a manter células-tronco embrionárias humanas em condições livres de células alimentadoras, incluindo passagens contínuas e confirmação de pluripotência por microscopia de imunofluorescência.

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Humana estudos de células-tronco embrionárias no laboratório Teitell são suportados por um Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM), as sementes conceder RS1-00313. Agradecemos a membros do Centro de Medicina Regenerativa Broad e Investigação em Células Estaminais na Universidade da Califórnia, especialmente Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, e membros do Instituto Broad Stem UCLA Facility núcleo celular para o seu apoio de nossos estudos.

manutenção CTEh cultura diária <ol><li> meios de cultura CTEh deve ser trocada a cada 24 hrs. Do frasco estoque ES mídia armazenada a 4 ° C, retire a quantidade de solução necessária (~ 20ml por 6 bem-prato), coloque em um tubo falcon 50ml, e aquecido a 37 ° C em banho-maria. Uma vez que a mídia está aquecido, adicione bFGF armazenadas a 4 ° C para uma concentração final de 10ng/ml. Coloque o estoque bFGF volta a 4 ° C imediatamente após o uso! </li><li> Remover das placas de 6-bem todos, mas ~ 500μl dos meios de comunicação. Certifique-se de rodar o prato cultura para suspender a remoção de detritos. Verifique se o bFGF nos meios de cultura CTEh é bem misturado e adicionar 3 ml de mídia fresco volta a cada poço de uma placa de seis poços. Volte a colocar a placa na incubadora. </li></ol> HESCs divisão de MEFs para Matrigel Normalmente, uma placa de 6 bem-confluentes de hESCs em MEFs pode ser dividida 01:02 - 01:03 para Matrigel placas 6-bem, com os poços se tornar confluentes novamente 4-5 dias após a divisão. <ol><li> Quando hESCs divisão em Matrigel, MEF-condicionado media (CM) é usado para manter pluripotência. MEF-condicionado mídia é feito antecipadamente. No primeiro dia, 1,5 × 10 7 γ irradiados MEFs são semeadas num frasco T75. No segundo dia, MEFs são lavadas uma vez com temperatura ambiente 1 × PBS, pH 7,4, e em seguida 15ml de mídia ES suplementado com 5ng/ml bFGF é adicionado ao balão. (NOTA: MEFs pode ser banhado em frascos menores ou maiores, mas proporção entre a densidade das células e volume de mídia ES deve ser constante.) O balão é incubados a 37 ° C por mais 24 hrs. No terceiro dia, o CM é coletado e substituído com 15ml de mídia ES fresco suplementado com 5ng/ml bFGF. O CM coletadas são armazenadas a 4 ° C. MEF-condicionado media de um revestimento de MEFs são colhidas ao longo de sete dias consecutivos para gerar 15 × 7 = 105ml. Após sete dias, todas as frações CM são combinados, estéril filtrado, aliquotado e armazenado a -20 ° C. Media CM preparado como descrito podem ser armazenadas e usadas por 1 mês. </li><li> Um dia antes de se separarem CTEh, coloque Matrigel alíquotas em tubos eppendorf a 4 ° C para descongelar durante a noite (uma alíquota contém 76.2mg de Matrigel, e esta é a quantidade necessária para uma placa de 6 poços). No dia da divisão, tome um frasco do Matrigel descongelado para uma placa de 6 poços, coloque o frasco e 6ml de frio DMEM/F12 media no gelo. Transferir o Matrigel no DMEM/F12 mídia e misture bem. Adicionar 1 ml da solução a cada poço de uma placa de seis poços. Redemoinho a placa para distribuir Matrigel na superfície e incubar a placa Matrigel coberto em temperatura ambiente por pelo menos 1 hr antes da divisão do hESCs. </li><li> hESCs em MEFs são lavadas uma vez com 1 × PBS, pH 7.4. Posteriormente 1ml de quente colagenase IV (1mg/ml) é adicionado a cada poço da placa 6-bem e, em seguida, a placa é incubada a 37 ° C por 5-10 min. </li><li> Adicionar 1ml de mídia ES sem bFGF a cada poço. Use uma pipeta de 1ml para fundir as células-tronco fora do prato. Recolher todos os meios contendo aglomerados de hESCs e MEFs mortos em um tubo falcon 50ml. Deixe aglomerados de células grandes contentar com 5-10 min para que as touceiras CTEh formar um pellet no fundo do tubo, enquanto a MEFs permanecem suspensas no sobrenadante. Desprezar o sobrenadante e lavar pela ressuspensão do pellet CTEh usando mídia ES faltando bFGF, seguido por centrifugação a temperatura ambiente em 200g por 5 min. </li><li> Para a placa de células-tronco em placas Matrigel, primeiro lave os pratos Matrigel com temperatura ambiente DMEM/F12 (1 ml por poço) e adicionar 2,5 ml de CM suplementado com 10ng/ml bFGF por poço. Ressuspender o sedimento em um volume adequado de CM suplementado com 10ng/ml bFGF, pipetar a suspensão célula para cima e para baixo várias vezes até que os pedaços se tornar uniforme e de pequena dimensão. Alíquota da suspensão de 0,5 ml por poço na placa Matrigel. Note-se que a densidade de colônia em Matrigel é maior do que a densidade de colônias, dividindo usual em MEFs. Coloque a placa em um 37 ° C de cultura de tecidos incubadora. </li><li> Para manter a hESCs em Matrigel, media CM suplementado com 10ng/ml bFGF é trocada a cada 24 horas até 4-5 dias. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts++%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Este vídeo demonstra como hESCs passagem de placas MEF para as placas de alimentação livre de células Matrigel. Note-se que a densidade de colônia em Matrigel é maior do que a densidade de colônias, dividindo usual em MEFs. Imunofluorescência e citometria de fluxo para microscopia ou marcadores CTEh pluripotência, como Oct-4 e SSEA-4, são necessários para confirmar a manutenção de hESCs em um estado indiferenciado em condições de alimentação livre de cultura.

<table><tbody><tr><td>Substituto de Soro para Depleção (KSR)</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Reagente</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Reagente</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina </td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reagente</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Oct-4</td><td>Reagente</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-h/mSSEA-4 conjugado com Fitoc&amp;#8211;eritrina, IgG3 de camundongo</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário IgG de coelho conjugado com FITC</td><td>Reagente</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

de mefs para matrigel 2: hescs divisão de mefs para matrigel

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em fibroblastos de rato embrionárias (MEF), as células de alimentação, como hESCs passagem de placas MEF para alimentação livre de células placas Matrigel.

Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 2 de 3.

De MEFs para Matrigel 2: hESCs Divisão de MEFs para Matrigel

Este vídeo demonstra como cultivar células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em células alimentadoras de fibroblastos embrionários de camundongo (MEF), como realizar a passagem de hESCs de MEF...

Para manter a cultura de células-tronco embrionárias humanas, o meio de cultura deve ser trocado a cada 24 horas. Para isso, inicie com um frasco estoque de meio para células-tronco embrionárias armazenado a quatro graus Celsius. Retire a quantidade de solução necessária, que geralmente é de cerca de 20 mililitros por seis.Placa de poços e coloque essa quantidade em um tubo Falcon de 50 mililitros e aqueça o tubo com o conteúdo a 37 graus Celsius em banho-maria. Uma vez aquecido o meio, adicione o FGF, que foi armazenado a quatro graus Celsius, até uma concentração final de 10 nanogramas por mililitro. Certifique-se de lembrar de devolver imediatamente o estoque de BFGF a quatro graus Celsius após o uso.Certifique-se de que o BFGF no meio de cultura de células-tronco humanas esteja completamente misturado. Em seguida, remova todo o meio de cada poço, deixando cerca de 500 microlitros por poço. Depois, adicione três mililitros de meio fresco novamente a cada poço de uma placa de seis poços e coloque a placa de volta no incubador.Agora que mostramos a você como manter células-tronco embrionárias humanas em ONMs, em seguida mostraremos como transferi-las para matrigel. Para repicar células-tronco embrionárias humanas cultivadas em ONMs para matrigel, começamos com uma placa de seis poços confluente de células-tronco em mes, que pode ser repicada de um para dois ou de um para três em matrigel. Placas de seis poços.Isso permitirá que os poços fiquem novamente confluentes quatro a cinco dias após a divisão. Ao repicar células-tronco embrionárias humanas sobre matrigel, utilize meio condicionado por met (meth conditioned media) para manter a pluripotência. O meio condicionado por met é preparado com antecedência. Isso é feito coletando diariamente, durante sete dias, o meio suplementado com cinco nanogramas por mililitro de BFGF a partir de uma cultura em crescimento de met; o meio para células-tronco embrionárias é então usado para substituir o meio condicionado por met removido.Todos os dias. O meio condicionado com metionina deve ser usado por até um mês após sua coleta e armazenamento congelado. No dia anterior à divisão de células-tronco embrionárias humanas, transferimos alíquotas de matrigel em tubos EOR de menos 20 graus Celsius para quatro graus para descongelar durante a noite.Uma alíquota contém dois miligramas de gel de matri, que é a quantidade necessária para uma placa de seis poços. No dia da repartição, pegue um frasco do gel de matri descongelado.Para cada placa de seis poços, misture cada frasco com seis mililitros de meio D-M-E-M-F 12 frio. Lembre-se de manter isso sobre gelo. Adicione um mililitro da solução a cada poço de uma placa de seis poços.Em seguida, agite suavemente a placa para distribuir o matrigel sobre a superfície e incube a placa recoberta com matrigel à temperatura ambiente por pelo menos uma hora antes de dividir as células-tronco embrionárias humanas. Antes de dividir as células-tronco embrionárias humanas, lave as células-tronco em MES uma vez com um XPBS pH 7,4. Em seguida, adicione um mililitro de colagenase quatro quente a um miligrama por mililitro em cada poço dos poços que estão sendo divididos e, depois, incube a placa a 37 graus Celsius por cinco a dez minutos.Após a incubação, adicione um mililitro de meio para células-tronco embrionárias sem BFGF a cada poço, utilizando uma pipeta de um mililitro para descolar as células-tronco da placa. Colete todo o meio contendo agregados de células-tronco e MES e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe os agregados maiores de células sedimentarem por cinco minutos, de modo que os agregados de células-tronco formem um pellet no fundo do tubo, enquanto os MES permaneçam em suspensão no sobrenadante.Uma vez que as células pareçam ter sedimentado, descarte o sobrenadante e lave as células ressuspendendo o pellet de células-tronco embrionárias. Usando meio para células-tronco embrionárias sem BFGF, centrifugue em seguida à temperatura ambiente a 200 vezes G durante cinco minutos. Enquanto as células estiverem em centrifugação, podemos preparar as placas de matrigel para o plaqueamento de células-tronco lavando as placas com D-M-E-M-F 12 à temperatura ambiente, utilizando um mil por poço, e adicionando 2,5 mililitros de meio condicionado suplementado com 10 nanogramas por mil.BFGF por poço após a centrifugação. Resuspenda o pellet em um volume apropriado de meio condicionado de metionina suplementado com 10 nanogramas por mililitro de BFGF, pipetando a suspensão celular para cima e para baixo várias vezes até que os agregados fiquem uniformes e pequenos em tamanho.Em seguida, alíquota a suspensão em 0,5 mililitros por poço na placa de matrigel para obter três mililitros por poço como volume final. Para o matrigel, utilizamos uma densidade de colônias mais alta do que na divisão usual em placas, uma vez que as células tenham sido adicionadas. Coloque a placa em um incubador de cultura de tecidos a 37 graus Celsius.Para manter as células-tronco embrionárias humanas na condição de metilgel. O meio suplementado com 10 nanogramas por mililitro de FGFb é trocado a cada 24 horas, por até quatro a cinco dias.As células-tronco embrionárias humanas geralmente são contaminadas com quantidades residuais de MEFs após a primeira divisão em Matrigel; a segunda divisão de Matrigel para Matrigel eliminará completamente quaisquer vestígios de células alimentadoras que contaminem o cultivo de células-tronco.

from-mefs-to-matrigel-2-splitting-hescs-from-mefs-onto-matrigel

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Biology

Biologia

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina.

MATIZ Passaging-tronco embrionárias humanas Cell-linhas com Tripsina

Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em células embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) alimentador. Parte 1 de 3.

De MEFs para Matrigel I: hESCs Passaging na Presença de MEFs

Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 3 de 3.

De MEFs para Matrigel 3: hESCs Passaging de Matrigel em Matrigel

Este artigo incidirá sobre a geração de endoderme hepática humana de populações humanas de células-tronco embrionárias.

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

A qualidade de fibroblastos embrionários (MEFs) é ditada pela estirpe direito de rato tal como CF-1. Pluripotência-MEFs apoio e meios condicionados (CM), obtida a partir destes deve conter concentrações ótimas de Activin A, Gremlin e TGF-p1 necessários para a Activin / Nodal e vias FGF para co-operatório manter a auto-renovação e pluripotência.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

Apesar dos esforços em curso para as culturas de transição para a alimentação livres de condições, a derivação ea cultura de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) permanecem em grande parte dependente de co-culturas com alimentadores embrionárias (MEFs). Aqui, mostramos uma nova metodologia para a rápida remoção de alimentadores de culturas CTEh antes da experimentação.

A remoção rápida de fibroblastos de Alta Densidade Humanos culturas de células estaminais embrionárias

Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em reprogramação epigenética de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para a geração de uma população homogênea de células progenitoras musculares esqueléticas que, sob condições de cultura permissiva formam aglomerados tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres), que recapitulam características biológicas do ser humano músculos esqueléticos.

Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC), com base no crescimento de monocamada do tipo não colônia (NCM) de células individuais dissociadas. Este novo método, utilizando inibidores de quinase associados a Rho ou a isoforma de laminina 521 (LN-521), é adequado para produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneos, manipulação genética e descoberta de medicamentos.

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

Linhas celulares Repórter oferecer um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse de populações heterogêneas. No entanto, utilizando a recombinação homóloga convencional em células estaminais embrionárias humanas-alvo do gene é extremamente ineficiente. Relata-se alvo CNS mesencéfalo específico fator de transcrição PITX3 loco com EGFP usando zinc-finger nuclease reforçada recombinação homóloga.

Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando proteína morfogênica óssea 4 e inibidores das vias Activina/Nodal. Este método é adequado para a diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas e pode gerar grandes quantidades de células para manipulação genética.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

Proteínas, muitas vezes contêm vários domínios que podem exercer diferentes funções celulares. Gene knock-out (KO) não consideram essa diversidade funcional. Aqui, relatamos uma abordagem de estrutura-função com base na troca de cassete mediada por recombinação (RMCE) em KO células estaminais embrionárias que permite a dissecação molecular de vários domínios funcionais ou variantes de uma proteína.

Estudos de estrutura-função em células estaminais embrionárias Rato Usando recombinase mediada por troca cassete

Aprenda a manter células-tronco embrionárias humanas em condições livres de células alimentadoras, incluindo passagens contínuas e confirmação de pluripotência por microscopia de imunofluorescência.

De MEFs para Matrigel 2: hESCs Divisão de MEFs para Matrigel

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