Aplicação de um elegans dopamina C. Ensaio degeneração dos neurônios de Validação do Potencial Doença de Parkinson Genes

No Laboratório Caldwell, também conhecido como Worm Shack, estudamos os mecanismos das doenças neurológicas em *C. elegans*. E após um longo dia de experimentos produtivos, recompensamos a nós mesmos com alguma atividade recreativa. Olá, sou Adam Knight, aluno de graduação do Laboratório Calwell, do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade do Alabama.

Hoje, eu e outros mostraremos como realizar um ensaio de degeneração de neurônios dopaminérgicos em C. elegans. Realizarei o cruzamento de uma linhagem de vermes com neurodegeneração dopaminérgica com linhagens transgênicas que superexpressam genes candidatos relacionados à doença e neurônios dopaminérgicos. Olá, sou Adam Harrington, aluno de pós-graduação no Laboratório Caldwell.

Hoje vou mostrar a você como preparar os vermes transgênicos para a análise de neurônios dopaminérgicos. Olá, sou Shu Amichi e sou estudante de pós-graduação. Aqui, vou mostrar a você como analisar seus neurônios dopaminérgicos de C. elegans, que são chamados de ceps e aides.

De modo geral, os vermes que expressam apenas GFP nos neurônios dopaminérgicos não apresentam morte celular. No entanto, na presença de CLE, você observará neurodegeneração dependente da idade. Utilizando este ensaio, um transgene pode ser coexpressado nos neurônios dopaminérgicos para determinar se ele pode potencializar ou suprimir a toxicidade induzida por CLE. Então, vamos começar.

Antes de realizar a análise de neurônios dopaminérgicos, devemos primeiro cruzar as linhagens GaN apropriadas para colocar oito exemplares expressando tanto o nucleotídeo alfa quanto a GFP sob controle do promotor específico de neurônios dopaminérgicos, dat-1, em uma placa de cruzamento. Agora, adicione dois L4 transgênicos de C. elegans hermafroditas que exibem expressão específica de neurônios dopaminérgicos do nosso gene de interesse candidato, bem como expressão nas células do músculo da parede corporal do marcador fluorescente selecionável DSRed2. É importante observar que, para cada construto transgênico, geramos três linhagens transgênicas estáveis.

Portanto, esse cruzamento genético deve ser realizado individualmente para cada uma das três linhagens estáveis separadas criadas. Após dois dias, remova e descarte os machos após mais dois a três dias. Inspecione a geração F1.

Há várias proles machos e o cruzamento foi bem-sucedido. Em seguida, transfira individualmente para novas placas cinco animais L4 de Afrodite de cada cruzamento que exibam tanto o marcador fluorescente GFP herdado do progenitor macho quanto o marcador DS vermelho de dois músculos da parede corporal fluorescentes herdado do progenitor hamadi. Os animais transferidos precisam estar no estágio L4 para garantir que ainda não tenham M it.

Com os animais machos presentes na placa, permita que os animais se autofertilizem por três a quatro dias para produzir a prole F2. Agora, remova a prole F2 para fazer isso. Transfira cinco a 10 animais que exibem ambos os marcadores cent para placas individuais separadas.

Em seguida, examine a geração F3 em placas nas quais cem por cento dos animais expressam GFP em neurônios dopaminérgicos e nos quais alguns dos animais expressam o marcador fluorescente DS Red dois em células musculares da parede corporal. Esses animais serão homozigotos para os genes alfa-sinucleína e GFP e também transmitirão de forma estável o transgene recém-criado. Após a conclusão da triagem, estamos prontos para realizar a análise dos neurônios dopaminérgicos.

Para iniciar a análise dos neurônios, prepare uma placa fresca com os três animais transgênicos identificados na etapa anterior. Monte uma placa para cada uma das três linhagens transgênicas. Além disso, plaque a linhagem que expressa apenas a alfa-sinucleína GFP como controle e permita que os vermes cresçam até a fase adulta.

Uma vez que as minhocas atinjam a fase adulta, transfira de 30 a 40 animais transgênicos de cada linhagem para uma placa fresca. Deixe-os colocar ovos por cinco horas a 20 graus Celsius. Após cinco horas, remova e descarte os animais.

Os adultos permitem que os embriões se desenvolvam por três a quatro dias a 20 graus Celsius até atingirem o estágio L4. Em seguida, selecione cerca de cem animais transgênicos no estágio L4 para uma placa contendo 0,04 miligramas por mililitro de cinco fluoro-2-desoxiuridina.

Este análogo de nucleotídeo impede o desenvolvimento da próxima geração por meio da inibição da síntese de DNA. Como as placas de FDUR são sensíveis à luz, proteja-as da luz mantendo as placas cobertas e completamente embrulhadas. Prepare um tapete gross pad para a análise dos vermes.

Estes são usados frescos e não devem secar. Prepare dois lâminas de microscópio com um pedaço de fita adesiva atravessada sobre elas no sentido longitudinal. A fita serve como espaçador para obter almofadas de espessura equivalente.

Coloque uma terceira lâmina entre elas sobre a bancada. Elas estão posicionadas. Três lado a lado.

Coloque uma gota de arus fundido no lado central e coloque rapidamente outro lâmina por cima do agros perpendicularmente a duas e sobre todas as três lâminas. Repita para fazer várias almofadas adicionais, tantas quantas forem necessárias para o número de amostras a ser analisado. Uma vez que as almofadas de auger estejam prontas, coloque uma gota de seis microlitros de 11 mile de anestésico a três milimolar em um lamínula de 22 por 30 milímetros.

Coloque 40 animais adultos na gota e, em seguida, inverta o cubre-objetos sobre o suporte de ágar. Repita o procedimento para cada uma das outras linhagens. Avalie 30 animais por linhagem quanto à presença de cada CEP e de um neurônio D.

Usando um microscópio composto com fluorescência epiluminescente e um cubo de filtro que permite a visualização de FITC ou GFP, utilizaremos um cubo de filtro endo G-F-P-H-Y-Q para registrar os dados em uma ficha de pontuação. Animais selvagens retêm GFP completo nas terminações de todos os quatro neurônios CEP e dois neurônios ADE. Indivíduos que apresentam perda de sinal nos neurônios D são classificados como selvagens conhecidos ou degenerativos.

Esses neurônios são registrados como LG ou perda de GFP. Da mesma forma, o grau de degeneração pode ser pontuado contando-se o número total de neurônios perdidos em cada animal, bem como a população que repete a análise mais duas vezes. Utilizando mais 30 animais por linhagem por ensaio.

O número total de vermes que exibem neurônios dopaminérgicos do tipo selvagem nas três rodadas de análise é calculado em média. A análise estatística para neuroproteção é então realizada utilizando o teste t de Student com valor de P inferior a 0,05. Para comparar vermes controle com linhagens que superexpressam genes candidatos em neurônios dopaminérgicos, realize esta análise em diversos dias após a colocação dos ovos; os dias apropriados para análise são determinados empiricamente.

Por exemplo, determinamos que 77%, 87% e 90% dos animais alfa CLE mais GFP exibem neurônios dopaminérgicos degenerados no sexto, sétimo e décimo dia após o desenvolvimento, respectivamente. Portanto, se previrmos que o transgene de interesse possa potencializar a neurodegeneração, analisaremos no sexto dia. Da mesma forma, o transgene que possa suprimir a neurodegeneração será analisado no sétimo e décimo dia.

Acabamos de mostrar como realizar um ensaio de neurodegeneração dopaminérgica em *C. elegans*. Ao conduzir este procedimento, é importante lembrar-se de: primeiro, utilizar um marcador apropriado para seleção durante os cruzamentos genéticos; segundo, utilizar machos saudáveis e L4 *hed-1* para os cruzamentos.

E três, certifique-se de pontuar cuidadosa e consistentemente os neurônios CEP e DE. Este procedimento permitirá que você realize rapidamente ensaios para fatores genéticos que possam potencializar ou suprimir a neurodegeneração induzida por CLE alfa alfa. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.