Aplicação de um elegans dopamina C. Ensaio degeneração dos neurônios de Validação do Potencial Doença de Parkinson Genes

No Caldwell Lab, também conhecido como Worm Shack, estudamos os mecanismos de doenças neurológicas na elegância do mar. E depois de um longo dia de experimentação frutífera, nos recompensamos com alguma atividade recreativa. Olá, sou Adam Knight, estudante de graduação do Laboratório Calwell do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade do Alabama.

Hoje, eu e outros mostraremos como realizar um ensaio de degeneração do neurônio dopaminérgico em C Elegants. Estarei cruzando uma cepa de verme neurodegenerativo de dopamina com cepas transgênicas que superexpressam genes candidatos relacionados a doenças e neurônios de dopamina. Olá, sou Adam Harrington, um estudante de pós-graduação no Laboratório Caldwell.

Hoje vou mostrar como configurar os vermes transgênicos para análise de neurônios de dopamina. Olá, sou Shu Amichi e sou estudante de pós-graduação. Aqui eu estarei mostrando como testar a entrada de seus neurônios de dopamina de elegância C, que são chamados de ceps e aides.

Geralmente, os vermes que expressam apenas GFP nos neurônios da dopamina não exibem morte celular. No entanto, na presença de CLE, você observará aqueles e neurodegeneração dependente da idade Usando este ensaio, um transgene pode ser co-expresso nos neurônios dopaminérgicos para determinar se ele pode aumentar ou suprimir a toxicidade induzida por CLE. Então vamos começar.

Antes de realizar a análise do neurônio dopaminérgico, devemos primeiro cruzar as cepas GaN apropriadas para começar a colocar oito moinhos expressando o núcleo alfas e GFP sob o controle do promotor específico do neurônio dopaminérgico dat um na placa de acasalamento. Agora adicione dois L quatro estágios transgênicos ca afrodites que exibem a expressão específica do neurônio dopaminérgico de nosso gene candidato de interesse, bem como a expressão de células musculares da parede corporal do DS vermelho dois marcadores fluorescentes selecionáveis. É importante notar que, para cada construção transgênica, geramos três linhagens transgênicas estáveis.

Portanto, esse cruzamento genético deve ser realizado individualmente para cada uma das três linhas estáveis separadas criadas. Após dois dias, remova e descarte os machos após mais dois a três dias. Inspecione a geração F1.

Existem vários descendentes machos e o acasalamento foi bem-sucedido. Em seguida, transfira individualmente para novas placas cinco de Afrodite L quatro animais de cada cruzamento que exibem o marcador fluorescente GFP herdado do pai macho e o marcador muscular da parede corporal fluorescente vermelho DS dois herdado do pai hamadi. Os animais transferidos precisam estar no estágio L quatro para garantir que ainda não o tenham m.

Com os animais machos presentes na placa, permita que os animais se autofertilizem por três a quatro dias para produzir uma progênie Fdois. Agora limpe a progênie F dois para fazer isso. Transfira de cinco a 10 animais que exibem ambos os marcadores de centavos para suas próprias placas individuais.

Em seguida, rastreie a geração F três para placas nas quais cem por cento dos animais expressam GFP nos neurônios dopaminérgicos e em que alguns dos animais expressaram o vermelho DS dois marcadores fluorescentes e células musculares da parede corporal. Esses animais serão homozigotos para os genes alfa-sinucleína e GFP e também transmitirão de forma estável o transgene recém-criado. Assim que a triagem for concluída, estamos prontos para realizar a análise dos neurônios dopaminérgicos.

Para iniciar a análise dos neurônios, prepare uma nova placa dos três animais F identificados na etapa anterior. Configure uma placa para cada uma das três linhas transgênicas. Além disso, a cepa de alfa-sinucleína GFP sozinha como controle permite que os vermes cresçam até a idade adulta.

Quando os vermes atingirem a idade adulta, transfira de 30 a 40 animais transgênicos de cada linha para um novo prato. Deixe-os botar ovos por cinco horas a 20 graus Celsius. Após cinco horas, retire e descarte.

Os adultos permitem que os embriões se desenvolvam por três a quatro dias a 20 graus Celsius até atingirem o estágio L quatro. Em seguida, escolha cerca de cem animais transgênicos L quatro para uma placa contendo 0,04 miligramas por mililitro de cinco flúor. Duas uridinas desoxi

Este análogo de nucleotídeo impede o desenvolvimento da próxima geração por meio da inibição da síntese de DNA. Como as placas FDUR são sensíveis à luz, proteja-as da luz mantendo-as cobertas e totalmente embrulhadas. Faça uma almofada bruta para a análise do verme.

Estes são usados frescos e não podem secar. Coloque duas lâminas de microscópio com um pedaço de fita adesiva. Longitudinalmente. A fita serve como espaçador para almofadas de espessura equivalente.

Coloque um terceiro slide entre eles no banco. Eles estão posicionados. Três lado a lado.

Coloque uma gota de arus derretido no lado central e coloque rapidamente outra lâmina em cima das duas perpendiculares do agros e em todas as três lâminas. Repita para fazer várias almofadas adicionais quantas forem necessárias para o número de amostras a serem analisadas. Quando as almofadas do sem-fim estiverem prontas, coloque uma gota de seis microlitros de três milimolares, serra de 11 milhas e anestésico em uma lamínula de 22 por 30 milímetros.

Escolha 40 animais adultos na gota e, em seguida, inverta a lamínula na almofada agros. Repita para cada uma das outras linhas. Pontue 30 animais por linha para a presença de cada CEP e um neurônio D.

Usando um microscópio composto com epifluorescência em um cubo de filtro que permite a visualização de FITC ou GFP, usaremos um cubo de filtro endo G-F-P-H-Y-Q dados de registro em uma folha de pontuação. Animais do tipo selvagem retêm GFP completo para lições em todos os quatro neurônios CEP e dois neurônios A DE. Animais individuais que exibem perda de neurônios D são classificados como tipo selvagem conhecido ou degenerativo.

Esses neurônios são registrados como LG ou perda de GFP. Da mesma forma, a extensão da degeneração pode ser pontuada contando o total de neurônios perdidos em cada animal, bem como a população repete a análise mais duas vezes. Usando mais 30 animais por linha por teste.

O número total de vermes exibindo neurônios dopaminérgicos do tipo selvagem das três rodadas de análise é calculado. A análise estatística para neuroproteção é então realizada usando o valor P do teste T de Student menor que 0,05. Para comparar vermes de controle com cepas que superexpressam genes candidatos em neurônios dopaminérgicos, realize esta análise de vários dias após a pista do ovo, os dias apropriados de análise de determinados empiricamente.

Por exemplo, determinamos que 77%, 87% e 90% dos animais alfa CLE mais GFP exibem neurônios dopaminérgicos degenerados nos dias seis, sete e 10 após o desenvolvimento, respectivamente. Portanto, se prevermos que o transgene de interesse pode aumentar a neurodegeneração, analisaremos no sexto dia. Da mesma forma, o transgene que pode suprimir a neurodegeneração será analisado nos dias sete e 10.

Acabamos de mostrar como realizar um ensaio de neurodegeneração de dopamina na elegância do mar. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar um marcador apropriado para seleção durante cruzamentos genéticos. Dois, use machos saudáveis e L quatro HEDIS para os cruzamentos.

E três, certifique-se de pontuar com cuidado e consistência os neurônios CEP e DE. Este procedimento permitirá que você analise rapidamente o fator genético que pode aumentar ou suprimir a neurodegeneração induzida por alfa alfa CLE. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.