Name: Aplicação de um elegans dopamina C. Ensaio degeneração dos neurônios de Validação do Potencial Doença de Parkinson Genes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-18T23:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de degeneração de neurônios dopaminérgicos em C. elegans para estudar a doença de Parkinson. Este método permite identificar fatores genéticos neuroprotetores e mecanismos de neurodegeneração.

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Gostaríamos de agradecer o espírito cooperativo de todos os membros Caldwell Lab. Pesquisa distúrbios do movimento no laboratório tem sido apoiado pela distonia Bachmann-Strauss &amp; Parkinson Foundation, Parkinson United Foundation, Parkinson Disease Association americana, doença de Parkinson Associação de Alabama, a Michael J. Fox Foundation for Research de Parkinson, e um de Iniciação Científica

A. Construção Expressão Plasmid Dois plasmídeos são necessários: um para expressão tecido específico do gene de interesse e um segundo como marcador de transformação selecionável (embora o marcador plasmídeo é geralmente disponível a partir de dentro da comunidade de pesquisa). Experimental Plasmid <ol><li> Selecione um promotor que se expressa no tipo de tecido / células de interesse, neste caso, o transportador de DA (PDAt-1) promotor é usado. Esta expressão plasmídeo foi criado como um gateway Invitrogen sistema compatível com vector de destino (pDEST-DAT-1) para permitir a inserção de qualquer gene de interesse a jusante do promotor por clonagem recombinational 1. </li><li> O cDNA do gene de interesse é amplificado PCR usando primers que contêm o Gateway att seqüência B recombinational. O cDNA amplificado é primeiro recombinados no vetor doador pDONR201 para criar o vetor de entrada e depois transformado em E. coli estirpe DH5α. Após a selecção de recombinantes de sucesso e mini-prep isolamento de DNA, o vetor de entrada é recombinado na pDEST-DAT-1 vector de destino para criar a expressão plasmídeo. Detalhes sobre a clonagem recombinational estão disponíveis a partir de qualquer manual de gateway da Invitrogen ou em Caldwell et al. 5. </li></ol> Marcador selecionável Plasmid Um marcador de transgênicos plasmídeo consiste de um vetor com um promotor dirigindo a expressão de uma proteína fluorescente em um tecido óbvio. Neste procedimento, o promotor unc-54 drives expressão da proteína cereja no músculo do corpo de parede (pon-54:: cereja). B. A geração de transgênicos C. elegans através de microinjeção Ver artigo relacionado JOVE: <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833">https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833</a> C. Genética cruzes para DA Análise de neurodegeneração <ol><li> Worms são cultivadas utilizando procedimentos padrão 6. </li><li> Coloque 10 PDAt-1:: α-syn; PDAt-1:: machos GFP 1, 2 em uma placa de acasalamento com 04/03 L4 hermafroditas estágio transgênicos (expressando PDAt-1:: gene X e punção-54:: cereja) . Esta deve ser realizada individualmente para cada uma das três linhas separadas estável criado. Depois de dois dias, retire os machos. </li><li> Inspecionar a geração F1, se há descendência masculina diversas, o acasalamento foi bem sucedida. </li><li> Clone com 5 hermafrodita L4 animais de cada cruz que apresentam ambos os PDAt-1:: GFP marcador fluorescente (herdadas do pai do sexo masculino) e os pon-54:: cereja fluorescentes corpo marcador músculo da parede (herdadas do pai hermafrodita). Os animais precisam ser clonado no estágio L4 para garantir que eles ainda não tenham acasalado com animais machos presentes na placa. Permitir-lhes a auto-cross e produzir progênie F2. </li><li> Animais F2 produzidos no passo 3 são clonados para fora. Especificamente, a transferência ~ 5-10 animais que apresentam ambos os marcadores fluorescentes para os seus próprios pratos individuais. Tela da geração F3 para placas onde 100% dos animais expressam GFP em DA neurônios e alguns dos animais são expressas cereja em células do corpo muscular da parede. Estes animais serão homozigotos para o PDAt-1:: α-syn; PDAt-1:: gene GFP estavelmente enquanto transmitindo o transgene recém-criado (gene X). </li></ol> D. dopaminérgicos Neuron Análise <ol><li> Prepare um prato de doce para cada uma das três linhas criadas acima, bem como a PDAt-1:: α-syn; PDAt-1:: GFP sozinho tensão. Permitir-lhes a crescer até a idade adulta. </li><li> Transferência de 30-40 adultos transgênicos de cada linha em um prato doce. Lhes permitem colocar os embriões durante 4 horas a 20 º C. </li><li> Remove os adultos. Permitir que os embriões a desenvolver por 3-4 dias a 20 º C até atingirem o estágio L4. </li><li> Escolha ~ 100 transgênicos L4 animais a uma placa contendo 0,04 mg / ml 5-fluoro-2&#39;-deoxiuridina (FUDR). Este nucleotídeo desenvolvimento blocos analógicos de próxima geração através da inibição da síntese de DNA, impedindo assim a descendência de esmagadora dos animais experimentais 7. Proteger as placas FUDR da luz, uma vez que é sensível à luz. </li><li> Animais adultos serão analisados ​​em vários dias seguintes postura de ovos. Os dias apropriados de análise são determinados empiricamente. Por exemplo, nós determinamos que 77%, 87% e 90% do PDAt-1:: α-syn; PDAt-1:: GFP animais apresentam neurônios degenerados DA nos dias 6, 7 e 10 pós-desenvolvimento, respectivamente. Portanto, se nós prevemos que o transgene de interesse pode aumentar neurodegeneração, vamos analisar no dia 6 e / ou 7. Da mesma forma, transgenes que poderia suprimir neurodegeneração serão analisados ​​nos dias 7 e 10. </li><li> Fazer 4 almofadas frescas agarose (ao contrário do agar microinjeção almofadas, elas são usadas frescas e não estão autorizados a secar). Definiu dois lâminas de microscópio que possuem um pedaço de fita entre eles; a fita serve como espaçador para blocos equivalente de espessura. Lay terzodeslize entre eles no banco (eles estão posicionados lado a lado três). Coloque uma gota de agarose derretida no slide centro e rapidamente estava outro slide em cima do agarose, perpendicular e em todos os três slides. Fazer várias almofadas adicionais, deixando os dois slides juntos até o bloco está pronto para uso. </li><li> Para analisar os neurônios verme DA, coloque uma gota 6 mL de 3 mM levamisole (um anestésico) em uma tampa de vidro 22 x 30 mm. Escolha 40 animais adultos (10 extras além da 30 a ser marcado) para a queda, então inverter a tampa de vidro sobre o bloco de agarose. Repita o procedimento para cada uma das outras linhas. </li><li> Pontuação 30 animais por linha para a presença de cada CEP e neurônio ADE usando um microscópio composto com epifluorescência e um cubo de filtro que permite a visualização de FITC ou GFP. Usamos um Dotar GFP HYQ filtro cubo (Tecnologia Chroma). Registro de dados na folha de pontuação em anexo. Do tipo selvagem animais reterá a fluorescência da GFP completa em todos os CEP 4 e 2 neurônios ADE. Animais individuais apresentando perda de neurônios DA são marcados como não-WT ou &quot;degenerando&quot;. Da mesma forma, o grau de degeneração pode ser marcado pela contagem do total de neurônios perdidos em cada animal, bem como da população. </li><li> Repetir a análise mais 2 vezes (30 animais a mais por linha por julgamento). O número total de vermes exibindo neurônios do tipo selvagem DA das três rodadas de análises é média. Análise estatística para a neuroproteção é então realizada usando o teste t de Student (p &lt;0,05) para comparar worms controle (PDAt-1:: α-syn; PDAt-1:: GFP) com cepas que o excesso de expressar genes candidatos em neurônios DA . </li></ol>

<ol><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis-based+RNAi+screening+identifies+neuroprotective+genes+in+a+Parkinson%E2%80%99s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model.</a> PNAS. 105, 728-733 (2008).</li>
<li>Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-synuclein+blocks+ER-golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> PNAS. 105, 145-150 (2008).</li>
<li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Genomics%3A+A+Discovery-Based+Laboratory+Course%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course.</a> , John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+maintaining+large%2C+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).</li>
</ol>

A perda idade-dependentes de neurônios de dopamina é um marco clínico da doença de Parkinson e tem sido associada com a acumulação ou misfolding de uma proteína chamada alfa-sinucleína. Aqui demonstramos como rótulo, através de um transgene fluorescente, a neurônios dopaminérgicos da C. elegans e imitar a neurodegeneração visto na doença de Parkinson por coexpressing humana alfa-sinucleína nestas células. Este vídeo mostra a metodologia para a travessia de crescimento, genética, montagem e pontuação de nematóides transgênic...

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas para microscópio</td><td>Simples, 3x1&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico com fluorescência</td><td>Microscópio</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Microscópio</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio epifluorescente</td><td>Microscópio</td><td>Nikon Instruments</td><td>Modelo E-800</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro, GFP HYQ</td><td>Endow Bandpass</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aplicação de um elegans dopamina c. ensaio degeneração dos neurônios de validação do potencial doença de parkinson genes

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Melhorias para o diagnóstico e tratamento da doença de Parkinson (DP) são dependentes de conhecimentos sobre os fatores que tornam a susceptibilidade populações em risco. No processo de tentar identificar novos fatores genéticos associados com a DP, os cientistas têm gerado muitas listas de genes candidatos, polimorfismos, e proteínas, que representam avanços importantes, mas estas ligações permanecem mecanicamente indefinido. Nosso trabalho estará voltado para a redução significativa tais listas, explorando as vantagens de um sistema simples de animais modelo. Enquanto os seres humanos têm bilhões de neurônios, a lombriga microscópica Caenorhabditis elegans tem precisamente 302, dos quais apenas oito produzir dopamina (DA) em hemaphrodites. Expressão de um gene humano que codifica a proteína PD-associados, alfa-sinucleína, em C. elegans resultados DA neurônios na dose e idade-dependente neurodegeneração. Worms expressar humana alfa-sinucleína em neurônios DA são isogênicos e expressar tanto GFP e humano alfa-sinucleína sob o promotor transportador DA (PDAt-1). A presença de GFP serve como um marcador facilmente visualizado por seguir neurodegeneração DA nesses animais. Inicialmente demonstrou que alfa-sinucleína neurodegeneração induzida DA poderia ser resgatado nestes animais por torsinA, uma proteína com atividade chaperone molecular 1. Além disso, o candidato relacionados com a DP genes identificados em nosso laboratório através de esforços em larga escala de triagem RNAi usando um ensaio misfolding alfa-sinucleína foram, então, sobre-expressa em C. elegans DA neurônios. Determinou-se que cinco dos sete genes testados representada moduladores candidato significativa de PD como eles resgatados alfa-sinucleína neurodegeneração induzida DA 2. Além disso, o Lab Lindquist (esta questão de Jove) realizou telas de fermento em que a alfa-sinucleína dependentes de toxicidade é usado como uma leitura de genes que podem aumentar ou suprimir citotoxicidade. Nós posteriormente examinou os genes candidatos fermento em nossa C. elegans ensaio neurodegeneração alfa-sinucleína induzida e validado com sucesso muitos destes três metas, 4. Nossa metodologia envolve a geração de um elegans DA C. vetor de expressão neurônio-específicos usando a clonagem de cDNAs recombinational gene candidato sob o controle do PDAt-1 promotor. Estes plasmídeos são então microinjeção no tipo selvagem (N2) worms, juntamente com um marcador selecionável para transformação de sucesso. Múltiplas estáveis ​​linhagens transgênicas de produzir a proteína nos neurônios DA candidato são obtidas de forma independente e depois cruzou para a cepa alfa-sinucleína degenerativas e avaliados quanto à neurodegeneração, tanto o animal eo nível de neurônio individual, ao longo do envelhecimento.

Este vídeo demonstra como usar C. elegans para avaliar neurônio dopaminérgico neurodegeneração como um modelo para a doença de Parkinson. Além disso, as telas genéticos são usados ​​para identificar os fatores que quer aumentar a degeneração ou neuroprotetor.

Aplicação de um elegans dopamina C. Ensaio degeneração dos neurônios de Validação do Potencial Doença de Parkinson Genes

Melhorias no diagnóstico e tratamento da doença de Parkinson (DP) dependem do conhecimento sobre os fatores de suscetibilidade que tornam as populações...

No Laboratório Caldwell, também conhecido como Worm Shack, estudamos os mecanismos das doenças neurológicas em Caenorhabditis elegans. E após um longo dia de experimentação produtiva, recompensamo-nos com alguma atividade recreativa. Olá, sou Adam Knight, aluno de graduação do Laboratório Calwell, do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade do Alabama.Hoje, eu e outros mostraremos como realizar um ensaio de degeneração de neurônios dopaminérgicos em C. elegans. Realizarei o cruzamento de uma linhagem de vermes com neurodegeneração dopaminérgica com linhagens transgênicas que superexpressam genes candidatos relacionados à doença e neurônios dopaminérgicos. Olá, sou Adam Harrington, aluno de pós-graduação no Laboratório Caldwell.Hoje vou mostrar a você como preparar os vermes transgênicos para análise de neurônios dopaminérgicos. Olá, sou Shu Amichi e sou estudante de pós-graduação. Aqui, vou mostrar a você como analisar seus neurônios dopaminérgicos de C. elegans, que são chamados de ceps e aides.De modo geral, os vermes que expressam apenas GFP nos neurônios dopaminérgicos não apresentam morte celular. No entanto, na presença de CLE, você observará neurodegeneração depen

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Biology

Biologia

Nos distúrbios da doença de Parkinson e de movimento, em geral, os ensaios comportamentais sensíveis e fiáveis ​​são essenciais para testar novas terapêuticas potenciais. Aqui, descrevemos uma bateria gerenciável de testes sensório-motores para os ratos que são sensíveis a diferentes graus de lesão no sistema nigroestriatal e útil para estudos pré-clínicos.

Avaliação da função sensório-motora em rato modelos de doença de Parkinson

Aqui nós descrevemos dois ensaios que foram estabelecidos para estudar neurodegeneração idade-dependente de dopaminérgicos (DA)...

Avaliando fenótipos Neurodegenerativas em<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios dopaminérgicos subindo Ensaios e toda Imunocoloração Cérebro

Os isozimos lipoxygenase (LOX) podem gerar produtos que podem aumentar ou diminuir a neuroinflamação e neurodegeneração. Um estudo de interação gene-ambiente poderia identificar efeitos específicos da isozyme lox. Utilizando o modelo 1-metil-4-fenil-1,2,3,3,6-tetrahidropyridine (MPTP) de dano nigrostriatal em duas linhas transgênicas deficientes de isozim lox permite comparar a contribuição de isozimes LOX na integridade e inflamação do dopaminérgico.

Modelos de interação gene-ambiente para desmasca mecanismos de suscetibilidade na doença de Parkinson

Na doença de Parkinson (PD), substância negra (SNC) neurónios dopaminérgicos degenerar, conduzindo a disfunção motora. Aqui nós relatamos um protocolo para a cultura de neurônios do mesencéfalo ventral de um ratinho expressando eGFP impulsionado por uma sequência de promotor de tirosina hidroxilase (TH), a colheita neurônios fluorescentes individuais das culturas, e medir o seu transcriptoma usando RNA-seq.

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

Aqui, introduzimos e descrevemos metodologias amplamente acessíveis utilizando alguns modelos versáteis de nematoides, incluindo necrose induzida por canal de íon hiperativado e neurotoxicidade induzida por proteínas, para monitorar e dissecar os fundamentos celulares e moleculares de doenças neurodegenerativas associadas à idade.

Modelagem de Doenças Neurodegenerativas Associadas à Idade em Caenorhabditis elegans

Aqui descrevemos o sistema RatWalker, construído redesenhando o aparelho MouseWalker para acomodar o aumento do tamanho e peso dos ratos. Este sistema usa reflexão interna total frustrada (FTIR), captura de vídeo de alta velocidade e software de análise de acesso aberto para rastrear e quantificar os parâmetros da marcha.

Aplicando o Sistema RatWalker para Análise de Marcha em um Modelo de Rato Genético da Doença de Parkinson

Neste artigo, mostramos como usar um sistema de pontuação de sete pontos para quantificar consistentemente mudanças na morfologia de dendrite do neurônio dopaminérgico em C. elegans. Este sistema destina-se a análises de ensaios de neurodegeneração dopaminérgico utilizando modelos genéticos, químicos e baseados em idade de distúrbios neurodegenerativos.

Quantificando níveis de alteração morfológica e degeneração do neurônio dopaminérgico em Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve a cultura celular de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo humano, seguida de coloração imunológica e geração de perfis fenotípicos neuronais a partir de imagens microscópicas adquiridas de alto conteúdo, permitindo a identificação de variações fenotípicas devido a modulações genéticas ou químicas.

Perfil Fenotípico de Neurônios Dopaminérgicos do Mesencéfalo Derivados de Células-Tronco Humanas

Este protocolo detalha um ensaio quantitativo de defecação em jovens mutantes RAC1/ CED-10 Caenorhabditis elegans, fornecendo um modelo direto para estudar os estágios da doença prodrômica de Parkinson. Ela supera limitações de outros modelos animais e facilita o teste de estratégias terapêuticas que visam a patologia parkinsoniana precoce.

Avaliação da Motilidade Gastrointestinal em Mutantes RAC1/CED-10 de Caenorhabditis elegans como uma ferramenta para estudar a doença de Parkinson precoce

Ole Isacson dá uma visão geral concisa da doença de Parkinson é, suas causas, as estratégias terapêuticas e avanços na pesquisa de Parkinson.

Ole Isacson: desenvolvimento de novas terapias para a doença de Parkinson

Aprenda a realizar ensaios de degeneração de neurônios dopaminérgicos em C. elegans para estudar a doença de Parkinson. Este método permite identificar fatores genéticos neuroprotetores e mecanismos de neurodegeneração.

Aplicação de um elegans dopamina C. Ensaio degeneração dos neurônios de Validação do Potencial Doença de Parkinson Genes

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