Paradigmas para Caracterização farmacológica de C. elegans Mutants Transmissão Sináptica

Olá, sou Cody Locke, do Laboratório Caldwell do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade do Alabama. Eu sou Kyle Lee e mostrarei como preparar minhocas para ensaios de exposição a carboidratos e PTZ. Eu sou Bernard Tu e vou demonstrar a você como realizar ensaios de carboidratos.

Eu sou Kaylin Berry e sou responsável pelos vídeos do Sea Elegance. Nesta apresentação, estarei narrando esta apresentação e demonstrando o ensaio de exposição PTZ. Hoje, meus colegas e eu mostraremos como caracterizar mutantes de transmissão sináptica com um modelo de epilepsia de elegância marítima após exposição a PTZ e Alde carb com uma série de cepas mutantes representativas.

Então vamos começar. Kyle Lee nos iniciará hoje mostrando a preparação dos ensaios de carboidratos ALD no primeiro dia do procedimento. Certifique-se de que pelo menos 30 vermes adultos jovens de cada genótipo e de cada réplica estejam disponíveis para ensaios de carboidratos ALD no segundo dia.

É melhor se um experimentador selecionar 50 ou mais minhocas de quatro estágios L em placas NGM frescas sem fungicidas assentadas com e coli OP 50 como fonte de alimento. Cultive as minhocas por 12 a 24 horas a uma temperatura consistente e permissiva. 20 graus Celsius a 22 graus Celsius é o melhor, embora 25 graus Celsius seja aceitável.

No segundo dia, faça uma solução estoque de 100 milimolares de Al Decarb e etanol a 70% espalhe a quantidade apropriada de Al Decarb em placas NGM. Usamos consistentemente 0,5 milimolar al Decarb colocando 37,5 microlitros de 100 milimolares alde carb em placas de Petri não ventiladas de 60 milímetros com 7,5 mililitros em gm. Deixe as placas de carboidrato de alde secarem por cerca de 30 a 60 minutos em temperatura ambiente.

Não é necessário quebrar as tampas depois que as placas estiverem secas. Adicione volumes consistentes de e coli no centro de cada placa de alde carb e seque por mais 30 a 60 minutos. À temperatura ambiente, normalmente adicionamos 25 microlitros de e coli OP 50.

Este volume de OP 50 cria um gramado de alimentos de tamanho suficiente para manter as minhocas em um pequeno ponto do centro do prato sem superlotação. Assim que o gramado estiver seco, prossiga com os ensaios de carboidratos alba. Devido à natureza subjetiva dos ensaios de carboidratos ALD, é altamente recomendável que os experimentos sejam realizados às cegas.

Para fazer isso. Um colega do experimentador principal rerotula as placas originais contendo os vermes a serem analisados, ou o colega pode transferir vermes das placas originais para cifrar as placas de carboidratos alde imediatamente antes de iniciar um cronômetro. Agora que as placas foram sied boro, o ABO prosseguirá com a análise para iniciar a análise e contará o número de vermes paralisados.

Existem duas abordagens principais para definir a paralisia aguda induzida por al decarb. A primeira abordagem define paralisia pela cessação do bombeamento faríngeo. Nesta nota de vídeo, uma estrutura escura que está situada dentro do lúmen da faringe do verme à direita da tela.

Essa estrutura é chamada de moedor e se contrai ritmicamente por meio de um mecanismo colinérgico. A locomoção do verme neste vídeo foi bastante retardada devido à exposição ao Al Decarb. No entanto, o moedor faríngeo desse verme ainda está claramente se movendo.

Portanto, este verme não é paralisado por uma cessação da definição de bombeamento. Deve-se ver neste vídeo que o moedor faríngeo localizado à direita da tela não está se contraindo com a cessação do bombeamento como a definição de trabalho para paralisia induzida por al Decarb. Este verme deve ser classificado como paralisado.

No entanto, como o verme no vídeo anterior, esse verme está exibindo leves movimentos de forrageamento de um lado para o outro. Apesar de ter sua locomoção prejudicada pelo Al Decarb, esses movimentos impediriam que um experimentador considerasse esse verme paralisado pela segunda abordagem para definir a paralisia induzida pelo al Decarb, imobilidade de corpo inteiro e falta de resposta ao toque. A segunda abordagem para definir a paralisia induzida por al decarb envolve cutucar consistentemente cada verme com um fio de platina e verificar se há uma resposta.

Se os movimentos do corpo não puderem ser detectados a olho nu, nossa abordagem preferida é cutucar nossos vermes duas vezes na cabeça e duas vezes na cauda a cada 30 minutos por um total de três horas. Como você deve ver, o verme neste vídeo não está obviamente movendo seu corpo. No entanto, como esse verme responde ao estímulo movendo claramente sua cauda, não chamamos esse verme de paralisado.

Pela segunda definição de paralisia induzida por al decarb. Como o verme no vídeo anterior, esse verme não está obviamente movendo seu corpo e, portanto, requer um teste de cutucada. No entanto, ao contrário do worm no vídeo anterior, esse worm não responde claramente ao estímulo.

Portanto, este verme é paralisado pela segunda definição de paralisia induzida por al decarb. Embora a diferença entre paralisado e não paralisado por alde carb possa ser sutil, os experimentadores devem ser capazes de identificar alterações substanciais e transmissão sináptica simplesmente observando um grande número de vermes representativos expostos ao Al Decarb imediatamente após serem colhidos nas placas de Al Decarb. Os vermes do tipo selvagem ainda são móveis.

Neste vídeo. Pode-se ver os mesmos vermes selvagens do vídeo anterior após uma hora de exposição ao Al Decarb. Observe que os vermes estão diminuindo até certo ponto, mas ainda estão se movendo claramente.

Ao contrário dos vermes do tipo selvagem, os mutantes Tomasin One neste vídeo estão totalmente imobilizados ou mal se movem após uma hora de exposição. Este resultado é consistente com os mutantes da tomasina um com excesso de secreção de acetilcolina devido à incapacidade de regular negativamente a liberação de neurotransmissores nas junções neuromusculares, o excesso de acetilcolina e as fendas sinápticas nas junções neuromusculares combinadas com a inibição da degradação da acetilcolina, Bial Decarb torna os mutantes da tomasina uma hipersensíveis, embora não mostrado aqui, resultados semelhantes foram postulados para surgir de ensaios de alde carb com alelos de perda de função de em 43, que codifica o C elegance ortho log da proteína quinase dois dependente de Moulin de cálcio. Este vídeo mostra 25 mutantes, que são deficientes na transmissão GABAérgica inibitória.

Após uma hora de exposição aos mutantes alde carb, semelhantes aos mutantes tomasin one e M 43, esses mutantes demonstram deficiências locomotoras e induzidas por alde carb e parecem ser mais afetados do que os vermes do tipo selvagem com exposição ao al Decarb por um período de tempo idêntico. Este resultado é consistente com os mutantes M 25 tendo superestimulado os músculos da parede corporal a partir de uma combinação de exposição a al Decarb e transmissão GABAérgica reduzida, levando a uma maior razão de transmissão excitatória para inibitória nas junções neuromusculares dos CL ELs e subsequente paralisia. No entanto, como os mutantes tomasin one on 43 e on 25 exibem sensibilidades semelhantes ao Al Decarb neste momento.

Apesar de ter diferentes causas para a superestimulação dos músculos da parede corporal, um experimentador não poderia conhecer o mecanismo subjacente da hipersensibilidade sem primeiro conhecer as identidades das mutações causadoras. Para este vídeo, voltamos aos mesmos vermes do tipo selvagem de um vídeo anterior após três horas de exposição ao al Decarb neste ponto terminal de nosso ensaio de carboidrato ALD, deve-se ver claramente que esses vermes, apesar de serem do tipo selvagem, estão totalmente imobilizados ou mal se movendo. Esses vermes agora são fenotipicamente semelhantes aos mutantes TOM one e M 25 mostrados uma hora após a exposição ao alde carb, presumivelmente porque a transmissão colinérgica excitatória atingiu níveis comparáveis em contraste com os vermes do tipo selvagem, os mutantes Synap Bren one permanecem consideravelmente móveis em três horas de exposição ao alde carb.

Este resultado é consistente com os mutantes Synaptive Bren one, que não possuem níveis normais de secreção de neurotransmissores, tendo menos estimulação colinérgica nos músculos da parede corporal do que os vermes do tipo selvagem da madeira após níveis idênticos de exposição ao carboidrato alde neste momento. Aponte para quatro mutantes, que são especificamente deficientes na transmissão colinérgica, devem ter sensibilidades semelhantes ao Al Decarb como mutantes Synaptive Bren one. Por outro lado, os mutantes hipersensíveis Tomasin one e O 25 permanecem paralisados, não muito diferente dos vermes do tipo selvagem.

Vale a pena notar que alguns vermes, especialmente aqueles que são resistentes ao Al Decarb, podem tentar rastejar para fora do prato. Nesse caso, o experimentador pode espalhar uma quantidade consistente de ácido palmítico, uma barreira física à locomoção dos vermes. Ao redor das placas Al Decarb, espalhamos 25 microlitros de ácido palmítico de 10 miligramas por mililitro de etanol.

Isso completa o paradigma de exposição ao Al Decarb. Agora, demonstrarei o paradigma de exposição ao Penta Lean Terazol. Kaylin Berry nos ajudará com os ensaios PTZ.

A preparação de minhocas para ensaios PTZ é essencialmente a mesma que a preparação de minhocas para ensaios de alde carb. As únicas diferenças significativas entre os dois ensaios são as seguintes. Usamos DDH dois O como solvente PTZ em vez de 70% de etanol.

Além disso, como frequentemente chapeamos volumes maiores de PTZ do que o carburador ALDE, permitimos que as placas sequem por pelo menos uma hora antes de adicionar OP 50. O ácido palmítico também pode ser usado com PTZ. Além disso, é importante observar que o PTZ é muito menos estável do que o carboidrato alde e deve ser armazenado a menos 20 graus Celsius.

Para iniciar a análise, conte o número de vermes epilépticos com convulsões leves a cada 30 minutos, totalizando uma hora. É melhor marcar o número de vermes com diferentes tipos de convulsões em categorias separadas, como convulsões de corpo inteiro, convulsões anteriores, que chamamos de combinação de cabeça Bobs de convulsões anteriores com paralisia muscular da parede corporal, que chamamos de paralisia tônico-clônica ou de corpo inteiro, que chamamos de tônico tônico. A atividade semelhante a uma convulsão, como vista com o verme à direita, geralmente segue convulsões tônico-clônicas, como visto com o verme no tônico esquerdo.

A atividade semelhante a uma convulsão pode simplesmente resultar da fadiga muscular após convulsões tônico-clônicas repetitivas. No entanto, nossos dados não publicados indicam que alguns vermes podem se tornar tônicos no PTZ de maneira semelhante à paralisia induzida por al decarb sem terem sido previamente tônico-clônicos. Aqui mostramos um verme mutante de transmissão sináptica representativo rastejando na ausência de antagonista do receptor PTZA GABA e indutor de convulsão comum em vários modelos animais de convulsões e epilepsia.

Observe que a ponta ou nariz do verme está balançando de um lado para o outro enquanto forrageia. Neste vídeo, mostramos outro verme da mesma cepa mutante de transmissão sináptica usada no vídeo anterior. Observe que esse verme, que está na presença de 2,5 miligramas PTZ por mililitro de água, continua a mover a cabeça de um lado para o outro enquanto forrageia.

No entanto, esse verme ocasionalmente interrompe o forrageamento de um lado para o outro e, em vez disso, empurra repetidamente sua anterior para a frente. Finalmente, deve-se ver um verme que carrega a mesma mutação que os vermes nos dois vídeos anteriores na presença de 10 miligramas PTZ por mililitro de água. Observe que este verme diminuiu o forrageamento de um lado para o outro e está empurrando sua parte anterior para a frente com maior frequência e intensidade do que com a menor concentração de PTZ.

Esses resultados demonstram a dependência da dose de PTZ, que observamos com todos os mutantes de transmissão sináptica sensíveis ao PTZ. É importante ressaltar que a exposição ao PTZ não é suficiente para induzir convulsões epilépticas em vermes do tipo selvagem. Da mesma forma, tentamos, mas não observamos, convulsões epilépticas induzidas por PTZ em vermes com déficits específicos na transmissão colinérgica, como em quatro, ou vermes com transmissão colinérgica excessiva, como tomasina um.

Portanto, deve ser viável caracterizar ainda mais os mutantes de transmissão sináptica com resistência a carboidratos alde de déficits na função sináptica geral ou déficits específicos na transmissão colinérgica com base em suas sensibilidades relativas ao PTZ. Talvez surpreendentemente, uma forte redução da função ONC 25 mutante, que não possui expressão detectável de GABA na elegância C. Os neurônios motores inibitórios não exibem convulsões epilépticas espontâneas como visto neste vídeo.

Um mutante ONC 25 em PTZ de 10 miligramas por mililitro de água. No entanto, exibe convulsões tônico-clônicas robustas, embora não tenha sido mostrada apenas convulsões anteriores com algum movimento precederam as convulsões tônico-clônicas associadas ao ONC 25 e mimetizaram as convulsões dos mutantes sinap Bren one. Portanto, um experimentador não deve presumir que todos os mutantes inibitórios do GABA exibirão convulsões tônico-clônicas ou atividade semelhante a convulsões tônicas intimamente associadas na presença de PTZ, especialmente considerando a probabilidade de obter alelos mutantes hipomórficos.

Agora que demonstramos hipersensibilidade ao alde carb e ao PTZ por mutantes inibitórios do GABA, mas apenas hipersensibilidade ao alde carb e sensibilidade normal ao PTZ por mutantes sem regulação negativa da transmissão colinérgica. Pode-se perguntar como são os mutantes de perda de função UNC 43 no PTZ, uma vez que também são hipersensíveis ao carboidrato Alda, como nossos outros mutantes de transmissão sináptica em 43 mutantes não exibem convulsões epilépticas óbvias na ausência de PTZ, embora esses mutantes tenham contrações raras não repetitivas, mas ainda espontâneas, de corpo inteiro, ainda após a exposição a 10 miligramas de PTZ por mililitro de água em 43, Os mutantes de perda de função apresentam convulsões de corpo inteiro robustas, repetitivas e dependentes da dose. Neste momento, esses resultados são ambíguos, mas parecem indicar que em 43 não deve ter um papel específico na transmissão GABAérgica inibitória ou um papel apenas na regulação negativa da liberação de neurotransmissores.

No sistema nervoso C elegance, acabamos de mostrar como caracterizar mutantes de transmissão sináptica CL elgan com estimulantes neurais complementares, alde carb, um inibidor da colinesterase e antagonista do receptor PTZA GABA. Ao seguir um paradigma farmacológico complementar, lembre-se de que o grau de sensibilidade a um estimulante neural não pode prever o grau de sensibilidade ao outro estimulante neural A utilização de ensaios de alde carb deve ajudar a distinguir mutantes inibitórios de GABA, que lideram Bob em PTZ, mas são hipersensíveis a Alde carb de mutantes gerais com deficiência de função sináptica, que também dirigem Bob em PTZ, mas são resistentes a carboidratos alde. Além disso, deve-se perceber que os mutantes inibitórios do GABA dirigem Bob no PTZ, enquanto os vermes que não possuem regulação negativa da transmissão colinérgica parecem do tipo selvagem no PTZ.

Portanto, o ensaio PTZ também pode ser empregado para distinguir entre essas classes de mutantes de transmissão sináptica, que são hipersensíveis ao carburador Alde. Em resumo, uma abordagem complementar com ensaios de PTZ e Alde carb deve permitir que um experimentador caracterize mutantes de transmissão sináptica C elegante de uma maneira que é impossível com qualquer droga sozinha. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.