Name: Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprenda a técnica SDD-AGE para triagem de agregados amiloides em larga escala usando eletroforese em gel de agarose. Este método confiável permite detectar polímeros resistentes à SDS em amostras de levedura.

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Agradecemos a Simon Alberti para obter ajuda com o desenvolvimento deste protocolo. Este trabalho foi suportado por uma concessão do National Institutes of Health (GM25874), um Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (para SL), e da National Science Foundation bolsa de formação predoctoral (para RH).

<html> Parte 1: Preparação do gel <ol><li> Montar a bandeja de fundição gel. Equipamento padrão para eletroforese de DNA horizontal pode ser usada. Para um grande número de amostras, nós preparamos a 20 cm x 24 cm da laje com até quatro de 50 pentes bem. Certifique-se que a laje não tem arranhões, pois estas podem distorcer a imagem blot. </li><li> Criar uma solução de agarose 1,5% (média ou alta força de gel, EEO baixo) em 1X TAE. O volume deve ser suficiente para submergir completamente os dentes do pente - você vai querer carregar amostra, tanto quanto possível para maximizar a detecção. Microondas a mistura até que a agarose é completamente dissolvido. </li><li> Rapidamente adicionar SDS a 0,1% a partir de um estoque de 10%. Agite para misturar. Se alguns agarose solidifica durante esta etapa, dissolver novamente usando uma placa quente e ter cuidado para evitar a ferver. </li><li> Despeje a solução no tabuleiro casting. Use um pente para ajuntar qualquer bolhas, pois mais tarde poderão interferir com a transferência. </li><li> Depois de gel tem, retire os pentes e colocar o gel para o tanque de gel. Submergir completamente o gel em 1X TAE contendo 0,1% SDS. </li></ol> Parte 2: Preparando-se amostras <ol><li> Para high-throughput análise de lisados ​​de levedura, começamos com 2 ml-culturas cultivadas durante a noite com agitação rápida em 96 poços blocos. Neste caso, cada cultura é superexpressão de uma proteína de interesse. Ao analisar proteínas baixa abundância, maiores volumes de cultura deve ser utilizado </li><li> Células colheita por centrifugação a 2000 RCF por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as células em água e centrifugar novamente. </li><li> Ressuspender em 1 ml de solução spheroplasting. Incubar por aproximadamente 30 min a 30 ° C (você pode confirmar a eficiência spheroplasting por microscopia). </li><li> Centrifugar a 800 rcf durante 5 min à temperatura ambiente. Remover completamente o sobrenadante. </li><li> Ressuspender esferoplastos peletizadas em 100 ml tampão de lise. </li><li> Cubra o bloco com fita e vortex em alta velocidade por 2 min. </li><li> Pellet restos celulares em 4000 RCF por 2 min. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante para um novo recipiente, por exemplo, uma placa de 96 poços PCR. </li><li> Se desejar, determinar a concentração de proteína do lisados. </li><li> Adicionar tampão de amostra 4X às amostras para gerar lisados ​​contendo 1X tampão de amostra. Incubar por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Carga gel. Se desejar, salvar metade do volume de amostra e ferva por SDS-PAGE análise. A fim de monitorar a taxa de transferência mais tarde, incluem um pré-manchada marcador SDS-PAGE. Além disso, um marcador de peso molecular composta por proteínas muito grandes (por exemplo, frango peitoral extrato) pode ser usado para estimar os tamanhos dos complexos resolvido. </li><li> Executado em baixa tensão (≤ 3 comprimento do gel V / cm) até a frente de corante atinge ~ 1 cm do final do gel. Isso vai demorar várias horas. É importante que o gel de manter a calma, caso contrário, a difusão de proteínas de baixo peso molecular (por exemplo, monômeros) pode limitar a sua detecção. </li></ol> Parte 3: Transferência <ol><li> Corte um pedaço de nitrocelulose para as mesmas dimensões do gel. </li><li> Corte de 20 peças de GB004 e GB002 8 pedaços de papel absorvente, para as mesmas dimensões do gel. Corte uma peça adicional de GB004 para ser usado como um pavio; torná-lo cerca de 20 centímetros mais largo que o gel. </li><li> Mergulhe a nitrocelulose, pavio, e 4 pedaços de GB002 em 1X TBS. </li><li> Em um recipiente de plástico, montar uma pilha de papéis da seguinte forma: 20 peças de GB004 seca, em seguida, 4 pedaços de GB002 seca, em seguida, um pedaço de pré-molhada GB002. Lay a nitrocelulose no topo desta pilha. </li><li> Lavar o gel na bandeja de fundição brevemente em água para remover excesso de tampão de corrida. Então, com cuidado começar a deslizar o gel da bandeja na pilha. Enquanto desliza o gel da bandeja, extinguir a membrana com TBS, se necessário. O buffer extra ajuda a evitar bolhas de ficar preso sob o gel. A pipeta de transferência funciona bem para esta finalidade. </li><li> Depois que o gel foi movido à pilha, analisar cuidadosamente as bolhas. Caso existam, levante a borda do gel e reaplicar tampão até que as bolhas podem ser trabalhados. </li><li> Coloque os restantes três pré-molhada GB002 peças em cima do gel. Garantir o contato completo entre todas as camadas rolando uma pipeta firmemente na parte superior da pilha. </li><li> Flanco a pilha de transferência com duas bandejas contendo elevados TBS. Drape o pavio pré-molhada em toda a pilha de tal forma que uma das extremidades do pavio está submerso em TBS. </li><li> Cobrir a pilha de transferência montado com uma bandeja de plástico adicionais rolamento de peso extra (por exemplo, uma garrafa de 500 ml de água). </li><li> Permitir a transferência para prosseguir para um mínimo de três horas, ou durante a noite. </li><li> Após a transferência, a membrana pode ser processado por padrão Western blotting. </li></ol> Solução Spheroplasting 1,2 M D-sorbitol 0,5 mM MgCl 2 20 mM Tris, pH 7.5 BME 50 mM (adicionar fresco) 0,5 mg / ml Zymolyase 100T (adicionar fresco) coration: underline; &quot;Tampão de Lise&gt; 100 mM Tris 7,5 50 mM NaCl 10 mM BME (adicionar fresco) inibidores da protease (adicionar fresco) Tampão de amostra 4X 2X TAE Glicerol 20% 8% SDS azul de bromofenol a preferência

<ol><li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li>
<li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast%3A+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li>
<li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle%3A+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+%5BPSI%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li>
<li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+%5BRNQ%2B%5D+seeds+necessary+for+prion+propagation.%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li>
<li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li>
<li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+%28eRF3%29+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li>
<li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li>
<li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li>
<li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein%28a%29+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li>
</ol>

SDD-AGE foi primeiramente relatada por Kryndushkin et al. 1, para estudar SDS-resistentes complexos do [PSI +] prion em levedura, e desde então tem encontrado uso generalizado estudar tanto prion e príon não-agregados 2-9. No entanto, a transferência das proteínas para uma membrana de eletroforese seguinte em um gel de agarose é problemático, e pode resultar em uma imagem distorcida blot 5. Além disso, a técnica submersa eletrobloting mais comumente utilizado apresenta limitações práticas para o tamanho do gel e, assim, o número de amostras que podem ser processados. Temos abordado estes problemas através do emprego de transferência capilar para baixo 10, um procedimento simples, que utiliza uma pilha de papéis secos blotting para transferir proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose. Transferência capilar evita a distorção e permite géis grande para ser processado facilmente. Há algumas coisas a considerar antes de usar SDD AGE. Para amostras de crude (por exemplo, lisados), imunodetecção de proteínas específicas é necessária. SDD-AGE não totalmente desnaturar a complexos de proteínas de interesse, de modo a proteína (s) a ser detectado deve ostentar uma etiqueta de epítopo fora da região amiloidogênicas. Lisados ​​geralmente podem ser preparados como se fossem para um normal SDS-PAGE, com duas diferenças importantes. Em primeiro lugar, o cuidado maior deve ser tomado para evitar a degradação por proteólise. As condições de desnaturação parcialmente usados ​​aqui não são suficientes para inativar proteases, e também pode fazer proteínas-alvo mais suscetível à proteólise. Use um coquetel inibidor de protease total em pelo menos duas vezes a concentração recomendada. Segundo, o aquecimento das amostras deve ser evitado. Se um controle de monômero de todos os negativos é desejada, por exemplo, para confirmar que de alto peso molecular de espécies não são devido a modificações covalentes, a incubação de 10 minutos a 95 ° C pode ser usada, que vai restaurar a maioria dos amilóides à proteína monomérica.

<table><tbody><tr><td>zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493-1</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocelulose Hybond-C extra</td><td>Amersham</td><td>RPN303E</td><td></td></tr><tr><td>Papel para blotting GB004</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>10427926</td><td></td></tr><tr><td>Papel para blotting GB002 (3MM Chr)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (UltraPure)</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr></tbody></table>

triagem para agregação de amilóide por semi-desnaturação eletroforese gel detergente-agarose

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Agregação amilóide está associada com patologias diversas proteínas misfolding e subjaz as propriedades de príons infecciosos, que são auto-conformationally templating proteínas que são pensados ​​para ter papéis benéficos em organismos inferiores. Amilóides foram extremamente difíceis de estudar devido à sua insolubilidade e heterogeneidade estrutural. No entanto, a resolução de polímeros amilóide com base no tamanho e insolubilidade detergente tem sido possível graças ao Semi-desnaturação Detergente-Eletroforese em Gel de Agarose (SDD AGE). Esta técnica é encontrar amplo uso para a detecção e caracterização de variantes amilóide conformacional. Aqui, nós demonstramos uma adaptação dessa técnica que facilita seu uso em aplicações em larga escala, tais como telas para prions romance e outras proteínas amiloidogênicas. O método SDD-AGE novos usos de transferência capilar para maior confiabilidade e facilidade de uso, e permite que qualquer gel dimensionados para ser acomodados. Assim, um grande número de amostras, preparadas a partir de células ou proteínas purificadas, podem ser processadas simultaneamente para a presença de SDS-conformistas de proteínas insolúveis marcados.

SDD-AGE é uma técnica útil para a detecção e caracterização de amilóide como polímeros nas células. Aqui nós demonstramos uma adaptação que torna esta técnica passível de aplicações em larga escala.

Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose

A agregação amiloide está associada a inúmeras patologias de dobramento incorreto de proteínas e fundamenta as propriedades infecciosas dos príons, que são ...

Olá, sou Randall Hoffman, aluno de pós-graduação no Laboratório de Susan Linus, do departamento de biologia do MIT. Hoje vou apresentar a vocês a eletroforese em gel com detergente semidesnaturante, ou SDD age. Nosso laboratório utiliza essa técnica para triagem de príons e outras proteínas alogênicas.Nossa versão da idade SDD é simples e confiável e pode ser ampliada para acomodar qualquer número de amostras. As amiloides são excepcionalmente resistentes à desnaturação por SDS, o que permite que sejam separadas de outras proteínas utilizando SDDH. No entanto, os dados obtidos por SDDH não podem, por si só, ser usados para confirmar que algo é amiloide.Para fazer isso, você precisa usar outras técnicas. Tendo isso em mente, deixe-me mostrar. A sequência S-D-D-H-S-D-D-H pode ser realizada usando equipamento padrão para eletroforese horizontal de DNA.Primeiro, você precisa montar a bandeja de moldagem do gel. O tamanho do aparelho dependerá da quantidade de amostras que você possui. Para um grande número de amostras, utilizamos uma placa de 20 por 24 centímetros e até quatro pentes de 50 poços.Para preparar o gel, você precisará de agarose de baixa EEO com força média ou alta, tampão 1xTAE e uma solução estoque a 10% de SDS. Prepare uma solução a 1,5% de agarose e 1xTAE. É recomendável fazer o gel o mais espesso possível para poder carregar a maior quantidade de amostra e maximizar a detecção. Aqueça a mistura no micro-ondas até que a agarose esteja completamente dissolvida.Adicione rapidamente o estoque de SDS 100 X a 0,1% e gire para misturar. Se parte do ágar se solidificar durante este passo, aqueça para dissolvê-lo em uma placa aquecedora. Tenha cuidado para não deixar ferver.Após adicionar SDS, como a solução pode facilmente transbordar com bolhas, despeje-a na bandeja de moldagem enquanto ainda estiver quente. Em seguida, use um pente para remover quaisquer bolhas que possam interferir posteriormente durante a transferência do gel. Depois que o gel estiver completamente resfriado e solidificado, remova cuidadosamente os pentes e coloque o gel no tanque.Imersa completamente o gel em um XTAE com SDS 0,1%. Agora você está pronto para carregar suas amostras. As amostras proteicas utilizadas na SDDH são preparadas da mesma forma que em uma eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, com duas exceções importantes.Primeiro, você deve evitar o aquecimento das amostras, o que poderia desnaturar os agregados em monômeros proteicos. Segundo, tenha cuidado para evitar a degradação proteica. Como as condições desnaturantes utilizadas aqui não são suficientes para inativar todas as proteases, recomendamos o uso de pelo menos o dobro da concentração recomendada de um coquetel completo de inibidores de protease.Nesta demonstração, usaremos lisados de células de levedura que superexpressam uma proteína específica de interesse. Geralmente, utilizamos dois mililitros de culturas cultivadas durante a noite em blocos de 96 poços disponíveis pela VWR, mas ao analisar proteínas de baixa abundância, devem ser usados volumes maiores de cultura.Recolha as células por centrifugação do cultivo a 2000 RCF durante cinco minutos à temperatura ambiente; após a centrifugação, remova o sobrenadante e lave as células ressuspendendo-as em água e centrifugando novamente. Após a segunda centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em solução de plaqueamento fresca. A zimase na solução digere as paredes celulares, o que permitirá lisar eficientemente as células em um pequeno volume de tampão de lise. Incube por 30 minutos a 30 graus Celsius.Centrifugue as células plásticas excedentes desta vez a 800 RCF durante cinco minutos. Remova completamente o sobrenadante e re-suspenda cada pellet em 100 microlitros de tampão de lise. Em seguida, cubra o bloco com fita adesiva e vortexe em alta velocidade por dois minutos.Isso ajuda todos os plásticos das esferas a lisar as células e remover os detritos celulares a 4.000 RCF durante dois minutos. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para uma placa PCR de 96 poços.Tipicamente, analisamos centenas de amostras ao mesmo tempo em nosso laboratório, por isso, para nos auxiliar nessa tarefa, utilizamos um sistema de manipulação de líquidos. Se desejar, determine a concentração proteica dos lisados. Em seguida, adicione tampão de amostra quatro x às amostras para gerar lisados contendo tampão de amostra um x e incube por cinco minutos à temperatura ambiente.Agora, carregue as amostras no gel. Se desejar, reserve metade das amostras para análise em SDS-PAGE. Além disso, carregue marcadores de peso molecular, incluindo marcadores pré-coloridos e um marcador de peso molecular muito alto, como o extrato de flector de frango.Se desejar, é importante manter o gel frio para evitar a difusão de proteínas de baixo peso molecular, portanto você pode querer executá-lo em câmara fria. Execute o gel em baixa voltagem, inferior a três volts por centímetro de comprimento do gel. Execute o gel por várias horas até que o corante alcance cerca de um centímetro do final do gel.Como o amiloide não é desnaturado por SDS a 2% em temperatura ambiente, ele permanecerá intacto enquanto outros complexos, incluindo a maioria dos agregados não amiloides, se dissociam na presença de SDS a 2%. Assim, a maioria das proteínas estará na forma monomérica e migrará rapidamente através do gel. Já os amiloides de alto peso molecular resistentes ao SDS migrarão mais lentamente.Após isso, o gel estará pronto para a transferência. Embora vários métodos de transferência possam ser utilizados, obtemos os melhores resultados usando a transferência por capilaridade. Como a transferência por capilaridade pode acomodar géis de qualquer tamanho, é prático analisar centenas de amostras por meio da transferência por capilaridade.Uma pilha de papéis absorventes secos atua removendo o tampão através do gel, depositando proteínas em uma membrana de nitrocelulose colocada entre os papéis e o gel. Você precisará cortar um pedaço de nitrocelulose, como a High Bond C, extra, com as mesmas dimensões do gel. Você também precisará cortar 20 pedaços de papel absorvente GBO oh quatro e oito pedaços de papel absorvente GBO oh dois com o mesmo tamanho do gel.O GB oh quatro é muito grosso e absorvente. Já o GBO oh dois é muito mais fino e possui uma textura mais suave, o que garante um contato mais uniforme com a membrana. Corte um pedaço adicional de GBO oh quatro para ser usado como pavio e faça com que ele tenha cerca de 20 centímetros a mais de largura do que o gel imerso.O UL nitroso WIC e quatro pedaços de GBO oh dois e um XTBS em um recipiente plástico montam uma pilha de papéis da seguinte forma: 20 pedaços de GBO oh quatro secos. Depois, quatro pedaços de GBO oh dois secos. Em seguida, um pedaço de GBO oh dois pré-umedecido.Coloque a nitrocelulose sobre esta pilha. Enxágue brevemente o gel na bandeja de moldagem com água para remover o excesso de tampão de eletroforese. Em seguida, comece cuidadosamente a deslizar o gel para fora da bandeja sobre a pilha, deslocando o gel da bandeja para baixo a membrana com TBS conforme necessário.O tampão extra ajuda a evitar que bolhas fiquem presas no gel. A pipeta de transferência funciona bem para esse fim após o gel ter sido completamente movido para a pilha. Verifique cuidadosamente a presença de bolhas, caso haja alguma. Levante a borda do gel e reaplique o tampão até que as bolhas possam ser removidas. Coloque as três peças restantes de GBO oh dois previamente umedecidas sobre o gel. Garanta um contato completo entre todas as camadas rolando firmemente uma pipeta sobre a parte superior da pilha.Coloque duas bandejas elevadas contendo TBS ao lado da pilha de transferência e estenda o pavio pré-umedecido sobre a pilha, de modo que ambas as extremidades do pavio fiquem submersas no TBS. Cubra a pilha de transferência montada com uma bandeja plástica adicional que tenha peso extra, como uma garrafa de 500 mL de água. O pavio irá puxar o tampão das bandejas e os papéis de blotting secos irão drenar o tampão através do gel ao longo de várias horas.Isso depositará as proteínas na membrana; permita que a transferência prossiga por um mínimo de três horas ou durante a noite. Após a conclusão da transferência por capilaridade, a membrana pode ser processada por meio de um western blot padrão. Aqui você vê uma imagem típica de proteínas que foram superexpressas em uma linhagem de levedura que predispõe certas proteínas a formar amiloides.É possível observar claramente que alguns dos nossos candidatos formam espécies resistentes à SDS de alto peso molecular ou amiloides muito bem, como os mostrados aqui e aqui. Outros, no entanto, não formam agregados e são completamente monoméricos, como estes e estes. Além disso, é possível observar que o tamanho dos polímeros amiloides varia conforme a proteína, o que pode ser visto nestas duas faixas.Acabamos de mostrar um método simples para analisar agregados de alto peso molecular e insolúveis, como amiloides de prions candidatos. Esperamos que tenham apreciado a nossa apresentação e que estejam achando esta técnica útil para estudos de proteínas imunogênicas de Amy. Obrigado por assistir e boa sorte em suas pesquisas.

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Biologia

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