Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose

Olá, sou Randall Hoffman, um estudante de pós-graduação no Laboratório Susan Linus no departamento de biologia do MIT. Hoje vou apresentar a vocês o detergente semidesnaturante agro rose, eletroforese em gel ou idade SDD. Nosso laboratório usa essa técnica para rastrear príons e outras proteínas alogênicas.

Nossa versão do SDD age é simples e confiável e pode ser dimensionada para acomodar qualquer número de amostras. Os amilóides são excepcionalmente resistentes à desnaturação por SDS, o que permite que sejam separados de outras proteínas usando SDDH. No entanto, os dados do SDDH não podem ser usados por si só para confirmar que algo é amilóide.

Para fazer isso, você precisa usar outras técnicas. Com isso em mente, deixe-me mostrar-lhe. S-D-D-H-S-D-D-H pode ser realizado usando equipamento padrão para eletroforese horizontal de DNA.

Primeiro, você precisa montar a bandeja de fundição de gel. O tamanho do aparelho dependerá de quantas amostras você possui. Para um grande número de amostras, usamos uma placa de 20 por 24 centímetros e até quatro pentes de 50 poços.

Para preparar o gel, você precisará de gel de força média ou alta baixa, EEO agros, um tampão XTAE e uma solução estoque de 10% de SDS Faça uma solução AROS de 1,5% e um XTAE. Você vai querer tornar o gel o mais espesso possível para poder carregar o máximo de amostra e maximizar a detecção. Aqueça a mistura no micro-ondas até que o aros esteja completamente dissolvido.

Adicione rapidamente o estoque de 100 XSDS a 0,1% e gire para misturar. Se algum agro solidificar durante esta etapa, vermelho, dissolva-o em uma chapa quente. Tenha cuidado para não deixar ferver.

Depois de adicionar SDS, pois a solução borbulhará facilmente, despeje esta solução na bandeja de fundição enquanto ainda estiver quente. Em seguida, use um pente para se livrar de quaisquer bolhas que possam interferir mais tarde durante a transferência do gel. Depois que o gel estiver completamente resfriado e solidificado, remova cuidadosamente os pentes e coloque o gel no tanque.

Mergulhe completamente o gel em um XTAE com 0,1% SDS. Agora você está pronto para carregar suas amostras. As amostras de proteína usadas no SDDH são preparadas exatamente como em uma página do SDS, com duas exceções importantes.

Primeiro, você deve evitar aquecer as amostras que podem desnaturar os agregados em monômeros de proteína. Em segundo lugar, tome cuidado para evitar a degradação de proteínas. Como as condições de desnaturação usadas aqui não são suficientes para inativar todas as proteases, recomendamos o uso de pelo menos duas vezes a concentração recomendada de um coquetel completo de inibidores de protease.

Nesta demonstração, usaremos lisados de células de levedura que estão expressando uma proteína específica de interesse. Geralmente usamos dois mil durante a noite. Culturas cultivadas em 96, blocos de poços disponíveis na VWR, mas ao analisar proteínas de baixa abundância, volumes de cultura maiores devem ser usados.

Colher as células centrifugando a cultura a 2000 RCF durante cinco minutos à temperatura ambiente após centrifugação, retirar o sobrenadante e lavar as células com Resus suspendendo em água e centrifugando novamente após a segunda centrifugação, remover o sobrenadante e resinar as células em solução de revestimento sobressalente. O zy na solução digere as paredes celulares, o que permitirá que você ligue as células de forma eficiente e um pequeno volume de tampão de lise. Incube por 30 minutos a 30 graus Celsius.

Esfole as células de plástico sobressalentes desta vez a 800 RCF por cinco minutos. Remova o sato completamente e ressuspenda cada pellet e 100 microlitros de tampão de lise. Em seguida, cubra o bloco com fita adesiva e vortex em alta velocidade por dois minutos.

Isso ajuda todos os plásticos esféricos a remover os detritos celulares a 4.000 RCF. Por dois minutos. Transfira cuidadosamente o S natin para uma placa de PCR de 96 poços.

Normalmente, analisamos centenas de amostras por vez em nosso laboratório, portanto, para nos ajudar com isso, há um sistema de manuseio de líquidos. Se desejar, determine a concentração de proteína dos lisados. Em seguida, adicione quatro x tampão de amostra às amostras para gerar lisados contendo um x tampão de amostra incubar por cinco minutos à temperatura ambiente.

Agora carregue as amostras no gel. Se desejar, salve metade das amostras para análise de página SDS. Além disso, carregue marcadores de peso molecular, incluindo marcadores pré-fabricados e um marcador de peso molecular muito alto, como extrato de flector de frango.

Se desejar, é importante manter o gel frio para evitar a difusão de proteínas de baixo peso molecular, portanto, você pode querer executá-lo na câmara fria. Execute o gel em baixa tensão inferior a três volts por centímetro do comprimento do gel. Execute o gel por várias horas até que o diare atinja cerca de um centímetro da extremidade do gel.

Como a amilóide não é desnaturada em 2% de SDS à temperatura ambiente, ela permanecerá intacta enquanto outros complexos, incluindo a maioria dos agregados não amilóides, se dissociam na presença de 2% de SDS. Assim, a maioria das proteínas será monomérica e passará rapidamente pelo gel. Enquanto os amilóides de alto peso molecular resistentes ao SDS migrarão mais lentamente.

Depois disso, o gel estará pronto para transferência. Embora vários métodos de transferência possam ser usados, obtemos os melhores resultados usando a transferência capilar. Como a transferência capilar pode acomodar qualquer tamanho de gel, é prático analisar centenas de amostras na transferência capilar.

Uma pilha de papéis mata-borrão secos atua para atrair o tampão através das proteínas depositadoras do gel em uma membrana de nitrocelulose colocada entre os papéis e o gel. Você precisará cortar um pedaço de nitrocelulose, como C de alta ligação, com as mesmas dimensões do gel. Você também precisará cortar 20 pedaços de GBO oh quatro e oito pedaços de papel mata-borrão GBO oh dois no mesmo tamanho do gel.

GB oh quatro é muito grosso e absorvente. Enquanto o GBO oh two é muito mais fino e tem uma textura mais fina, o que garante um contato mais uniforme com a membrana. Corte um pedaço adicional de GBO oh quatro para ser usado como pavio e torne-o cerca de 20 centímetros mais largo do que o gel imerso.

O nitroso UL WIC e quatro pedaços de GBO oh dois e um XTBS em um recipiente de plástico montam uma pilha de papéis da seguinte forma, 20 pedaços de GBO seco oh quatro. Em seguida, quatro pedaços de GBO seco, oh dois. Em seguida, um pedaço de GBO pré-molhado, oh dois.

Coloque a nitrocelulose em cima desta pilha. Enxágue o gel na bandeja de fundição brevemente em água para remover o excesso de tampão de corrida. Em seguida, comece a deslizar cuidadosamente o gel da bandeja para a pilha enquanto desliza o gel para fora da bandeja e desliza a membrana com TBS conforme necessário.

O tampão extra ajuda a evitar que as bolhas fiquem presas no gel. A pipeta de transferência funciona bem para essa finalidade depois que o gel foi completamente movido para a pilha. Verifique cuidadosamente se há bolhas, se houver.

Levante a borda do gel e reaplique o tampão até que as bolhas possam ser resolvidas. Coloque os três pedaços restantes de GBO ou dois pedaços pré-umedecidos em cima do gel. Garanta o contato completo entre todas as camadas rolando uma pipeta firmemente na parte superior da pilha.

Flanqueie a pilha de transferência com duas bandejas elevadas contendo TBS para colocar o pavio pré-úmido na pilha, de modo que cada extremidade do pavio fique submersa. No TBS, cubra a pilha de transferência montada com uma bandeja de plástico adicional com peso extra, como uma garrafa de água de 500 mil. O pavio puxará um tampão das bandejas e os mata-borrões secos puxarão o tampão através do gel ao longo de várias horas.

Isso depositará as proteínas na membrana, permitindo que a transferência prossiga por um período mínimo de três horas ou durante a noite. Após a conclusão da transferência capilar, a membrana pode ser processada por western blotting padrão. Aqui você vê uma mancha típica de proteínas que foram superexpressas em uma cepa de levedura que predispõe certas proteínas a formar amilóide.

Você pode ver claramente que alguns de nossos candidatos formam espécies resistentes a SDS de alto peso amilóide ou de alto peso molecular muito bem, como as mostradas aqui e aqui. Outros, no entanto, não formam agregados e são completamente monoméricos como estes e estes. Além disso, você pode ver que o tamanho dos polímeros amilóides difere dependendo da proteína, o que você pode ver nessas duas pistas.

Acabamos de mostrar um método simples para analisar agregados insolúveis de alto peso molecular, como amilóides de príons candidatos. Esperamos que você tenha gostado de assistir nossa apresentação e ache esta técnica útil e estudos de proteínas imunogênicas Amy. Obrigado por assistir e boa sorte com sua pesquisa.