Name: Células ES: Cultura A partir de células congeladas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 47 s
Description: Aprenda a estabelecer culturas de células-tronco embrionárias humanas HuES a partir de estoques congelados. Este protocolo reprodutível é essencial para pesquisas em neurociência e biologia do desenvolvimento.

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Descongele de um estoque congelados: <ol><li> Antes de descongelamento células matizes, garantir que a placa MEF você já está devidamente preparado banhados e em boas condições. NÃO tente usar uma placa de menos de desejável, ou um que tem mais de três dias. Recomenda-se a pré-label todos os tubos cônicos e poços sendo usados. </li><li> Pré-aquecer media MATIZ a 37 ° C. Alíquota media MATIZ em um tubo cônico estéril para cada linha. Remover MATIZ frasco / s de -80 e imediatamente mergulhe a metade inferior do tubo em banho-maria a 37 ° C. Deve ter cerca de 45-60 segundos antes de as células são descongeladas 80% (porção pequena congelados esquerda). </li><li> Rapidamente trazer o tubo para a capela de fluxo laminar, lavar com álcool a 70%, e gentilmente transferência de células para a pré-aquecido mídia. Girar o tubo, remova a mídia, e ressuspender em um volume adequado de produtos frescos, a mídia pré-aquecido matizes. </li><li> Aspirar a mídia off MEF como poços de muitos como você vai estar em descongelamento. Rapidamente, a mídia alíquota pré-aquecido MATIZ volta em cada poço da placa, tomando cuidado para não perturbar o MEFs anexado. Colocou o prato de lado no capô. Tal como acontece com MEFs, melhores resultados são obtidos se as gotas estão uniformemente distribuídas sobre a placa. Voltar cuidadosamente a placa para a 37 ° C incubadora durante a noite para permitir que as células MATIZ semear o MEFs. Alterar media ~ 48 horas após o descongelamento, substituindo com a mídia fresco matizes. </li></ol>

<ol><li>Cowan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cells+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cells from Human Blastocysts.</a> , 1650-1656 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Neste vídeo, mostramos como nosso laboratório rotineiramente estabelece uma MATIZ embrionárias humanas cultura de células-tronco a partir de um estoque de congelados. Este processo é passível de uso geral com qualquer de células de mamíferos se congelado em uma solução de DMSO. Descongelamento eficiente é essencial para o estabelecimento de uma nova cultura de matizes células de um estoque congelado, e é importante para a consistência experimental.

MATIZ media 651,5 ml KO-DMEM 500 ml 6,5 ml PenStrep Glutamin 6,5 ml 6,5 ml NEAA beta-mercaptoetanol 0.5ul KO substituição Serum 65 ml 65 ml Plasmanate bFGF2 (10 ng / mL final) 0,65 ml

células es: cultura a partir de células congeladas

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Aqui demonstramos como nosso laboratório começa uma MATIZ-tronco embrionárias humanas cultura linhagem de células de um estoque congelado. Primeiro, um ou dois dias placa de idade dez centímetros aproximadamente um (a dois) milhões de rato irradiadas células embrionárias alimentador de fibroblastos é lavado com a mídia MATIZ para remover soro residual e restos celulares, e então a mídia MATIZ adicionado e para a esquerda para equilibrar na célula cultura incubadora. Um frasco frozen de células de armazenamento de longo prazo de nitrogênio líquido ou um freezer-80C é originária e rapidamente imerso em banho-maria 37C para o descongelamento rápido. Células em meios de congelamento são então removidas do frasco e colocado em um grande volume de meios tons. O grande volume de tons de mídia facilita a remoção do soro em excesso e DMSO, o que pode causar MATIZ células estaminais embrionárias humanas para diferenciar. As células são delicadamente girado para fora de suspensão, e então re-suspenso em um pequeno volume de mídia fresco matizes que é então usado como semente para a placa MEF. Considera-se importante para semear a placa MEF suavemente adicionando as células matizes em queda de forma sábia para dispersá-los uniformemente em todo o prato. A placa de cultura recém-criada matizes é devolvido para a incubadora por 48 horas antes da mídia é substituído, então é alimentado a cada 24 horas depois.

Aqui demonstramos como nosso laboratório começa uma MATIZ-tronco embrionárias humanas cultura linhagem de células de um estoque congelado.

Células ES: Cultura A partir de células congeladas

Aqui, demonstramos como o nosso laboratório inicia a cultura de uma linhagem de células-tronco embrionárias humanas HuES a partir de um estoque congelado. Primeiro, uma placa de dez cm com um a dois dias de cultura de...

human-es-cells-starting-culture-from-frozen-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui demonstramos como nosso laboratório congela MATIZ embrionárias humanas linhas de células estaminais.

Congelamento células ES

Desde que James Thomson et al desenvolveram uma técnica em 1998 para isolar e cultivar-tronco embrionárias humanas em cultura, as células de congelamento para uso posterior e descongelamento e expandir as células de um estoque de congelados tornaram-se procedimentos importantes realizados em cultura de rotina CTeh. Como as células-tronco embrionárias humanas são muito sensíveis ao estresse de congelamento e descongelamento, cuidados especiais devem tomadas. Aqui nós demonstrar a técnica...

Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

Nós apresentamos um protocolo para a reprogramação eficiente de células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) usando vetores retrovirais codificando OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) e identificação de hiPSC corretamente reprogramado pela coloração ao vivo com tradi- 1-81 anticorpo.

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

Descrevemos um protocolo para isolar e cultivar células epiteliais de âmnio humano (hAECs) usando reagentes livres de produtos de origem animal de acordo com as diretrizes atuais de boas práticas de fabricação (cGMP).

Isolamento, criopreservação e cultivo de células epiteliais humanas Amnion para aplicações clínicas

Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente de propagar células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando apenas meios condicionados derivados da placenta humana em um prato revestido de gelatina sem suplementação exógena adicional ou substratos sintéticos específicos para hPSC.

A Cultura Modelo Novel para pluripotentes estaminais humanas Propagação celular em gelatina no Media Placenta condicionado

A pele humana age como uma primeira linha de defesa contra o ambiente externo. Apresentamos um método para isolar os queratinócitos humanos primários da pele adulta. Estes queratinócitos isolados são úteis em inúmeras configurações experimentais e são um modelo altamente adequado para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea em vitro.

Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

Um protocolo é apresentado para preparar polivinil álcool-co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes, que foram enxertados com e sem oligopeptídeos, para investigar o efeito da rigidez dos biomateriais na diferenciação e proliferação de células-tronco. A rigidez do hidrogel era controlada pelo tempo de reticulação.

Cultura de células-tronco pluripotentes humanas em polivinil álcool-Co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes condições Xeno-livre

Este protocolo permite a manutenção de células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes in vitro, imitando o microambiente de medula óssea usando ácidos graxos abundantes, colesterol, menores concentrações de citocinas e hipóxia.

Um método cultural para manter células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes

Os produtos xenogênicos (químicos ou derivados de animais) introduzidos nas etapas de preparação/manipulação da terapia celular estão associados a um risco aumentado de reatividade imunológica e transmissão patogênica em pacientes hospedeiros. Aqui, um método completo livre de xenogênicos para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano é descrito.

Isolamento e cultura de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano com um método inovador livre de xenogênicos para terapia humana

O protocolo atual detalha etapas para a resolução de problemas na derivação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de amostras de pacientes que têm sido difíceis de reprogramar seguindo as instruções do fabricante. Esse protocolo é específico para amostras congeladas de camada buffy, mas também pode ser aplicado à reprogramação de PBMCs purificados.

Reprogramação de Linhagens de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas a partir de Amostras de Buffy Coat Congeladas

Aprenda a estabelecer culturas de células-tronco embrionárias humanas HuES a partir de estoques congelados. Este protocolo reprodutível é essencial para pesquisas em neurociência e biologia do desenvolvimento.

Células ES: Cultura A partir de células congeladas

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