Cirurgia estereotáxica sobrevivência em Roedores
6 de outubro de 2008
O acompanhamento dos níveis de neurotransmissores extracelular em regiões distintas do cérebro de animais que circulam livremente oferece insights sobre a relação entre a liberação do neurotransmissor e comportamento. Em microdiálise in vivo juntamente com detecção eletroquímica fornece anatômicas excelentes e resolução de química; e informações sobre como a neurotransmissão basal é alterada por manipulações farmacológicas ou fisiológicas.
Olá, sou Brenda Geiger do Laboratório de Emmanuel POTOs do Departamento de Farmacologia e Terapêutica Experimental da Escola de Medicina da Tufts University. E eu sou Lauren Frank, também do laboratório. Hoje demonstraremos cirurgia estereotáxica viável em roedores.
Este procedimento envolve a configuração dos instrumentos e o preparo do animal para cirurgia, seguido pela realização da cirurgia estereotáxica. Vamos começar. Antes de iniciar o procedimento, configure o instrumento estereotáxico e todos os materiais necessários.
Certifique-se de que a área e os instrumentos estão limpos e esterilizados. Em seguida, prepare o animal para a cirurgia. Demonstrarei hoje a cirurgia utilizando uma rata Sprague dawley com 10 semanas de idade.
Também utilizamos ratos dolly de três meses e camundongos C57 black six J de dois meses, que exigem um adaptador de plataforma especializado. Anestesie o rato com uma injeção intraperitoneal de um coquetel contendo 60 miligramas por quilograma de ketamina e 10 miligramas por quilograma de xilazina. Mantenha o animal aquecido utilizando um tapete aquecido regulado por termostato.
Após garantir que o animal está sedado e estável em uma temperatura corporal adequada, prossiga com a cirurgia. Para iniciar a cirurgia, rape o pelo do animal com uma máquina elétrica, da região das orelhas até um pouco acima dos olhos. Aplique iodo na área raspada, mas certifique-se de proteger os olhos do produto.
Agora, posicione o animal no aparelho estereotáxico. Para isso, primeiro insira uma haste auricular no canal auditivo e, em seguida, segure-a no lugar e deslize a outra haste auricular de modo que a cabeça não possa se mover lateralmente, mas o focinho possa ser movido para cima e para baixo. Fixe a boca com o suporte anterior do instrumento estereotáxico usando a régua do usuário para garantir que a cabeça esteja nivelada.
Deve haver um ângulo de 90 graus entre a régua e a parte central do couro cabeludo do animal. Uma vez que o animal esteja posicionado, faça uma incisão ântero-posterior no couro cabeludo com um bisturi estéril. Estenda a incisão desde o lambda até um ponto logo entre os olhos do animal.
Use hemostatos para pinçar a pele e manter a incisão aberta. Seque a superfície exposta do crânio com vários cotonetes. Em seguida, coloque a cânula guia em seu suporte.
Em seguida, localize o bgma no crânio e posicione a cânula-guia diretamente sobre essa localização. Anote as coordenadas anterior, posterior e lateral do bgma. Determine as coordenadas corretas necessárias para a colocação da sua sonda.
Com a ajuda do atlas estereotáxico, posicione a cânula guia nas coordenadas corretas adicionando ou subtraindo de bgma. Abaixe a cânula guia até que ela toque o crânio e, em seguida, registre essa coordenada ventral. Faça uma marca com lápis nesse local no crânio.
Aqui é onde você fará a perfuração. Para iniciar a perfuração, remova a cânula-guia e esterilize a broca.
Em seguida, faça um furo de 0,5 milímetro no traço de lápis até atravessar toda a espessura do crânio. Verifique com a cânula guia se ela atravessa o furo sem tocar nas laterais. Continue fazendo o furo e verificando até que a cânula consiga atravessar o orifício em linha reta.
Tenha cuidado para não penetrar nas membranas meníngeas ou nos vasos sanguíneos. Uma vez feito o orifício, use uma agulha estéril para perfurar suavemente as meninges, permitindo a inserção desobstruída da cânula guia. Em seguida, usando uma broca manual, faça seis orifícios para os parafusos cranianos.
Duas anteriores, duas laterais e duas posteriores ao orifício da cânula. Esterilize seis parafusos ósseos de aço inoxidável e posicione-os sobre o crânio até que estejam firmemente fixados. Após inserir os parafusos, limpe a cânula guia com etanol e deixe secar; em seguida, monte e abaixe lentamente a cânula guia até a coordenada ventral adequada.
A cânula é movida para cima e para baixo para evitar danificar o cérebro. Certifique-se de que os lados não estejam tocando e de que ela esteja sendo inserida perfeitamente na vertical. Em seguida, remova os hemostatos.
Misture uma pequena quantidade de cimento dental líquido e cubra a cânula-guia, os parafusos e o restante do crânio com uma espátula em uma camada fina. Em seguida, posicione o parafuso de ancoragem medialmente e atrás dos parafusos do crânio posterior, segurando-o no lugar com pinça. Prepare outro lote de cimento, desta vez mais espesso, e cubra completamente a cânula e os parafusos de ancoragem com quantidade suficiente de cimento para fixá-los quando o cimento endurecer.
Mas antes que solidifique, separe a pele da cúpula de cimento e modele a cúpula com a espátula para garantir que ela fique lisa por completo e não irrite a pele. Posteriormente, adiciona-se mais cimento para reforçar a cânula guia e conectá-la ao restante do suporte craniano. Após o cimento odontológico estar completamente seco, remova o animal do aparelho.
Em seguida, aplique o antibiótico tópico bacitracina ao redor de toda a extensão da tampa de cimento. Depois, administre uma injeção intramuscular de penicilina seguida por uma injeção subcutânea de soro fisiológico Oneill. Coloque o animal em sua gaiola e monitore-o até que recupere a consciência.
Em seguida, retorne o animal ao seu alojamento para recuperação. Após a recuperação, monitore o animal diariamente até o fim do experimento em busca de sinais de infecção e para avaliação de dor e desconforto.
Administre 0,1 a 0,5 miligramas por quilograma de buprenorfina por via subcutânea duas vezes ao dia conforme necessário, caso o animal aparente estar em dor. Além disso, realize tratamento local com bacitracina e tratamento sistêmico com penicilina. Se ocorrerem infecções pós-operatórias ou se algum dos sintomas persistir por mais de 12 horas após a cirurgia, o animal é eutanasiado.
Nós, acabamos de mostrar como realizar uma cirurgia estereotáxica viável em roedores. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter um ambiente estéril durante a cirurgia e monitorar atentamente o animal após a cirurgia para evitar infecções, além de posicionar corretamente o animal sobre as barras de ar, de modo que a localização da cânula-guia seja precisa.
É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo discute o monitoramento dos níveis extracelulares de neurotransmissores em animais livremente móveis, relacionando a liberação de neurotransmissores ao comportamento. Destaca o uso da microdiálise in vivo e da detecção eletroquímica para melhorar a resolução anatômica e química.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Farmacologia
- Ciência Comportamental
Antecedentes
- Compreender a dinâmica dos neurotransmissores é essencial para relacionar a atividade cerebral ao comportamento.
- A microdiálise permite a coleta de amostras de regiões cerebrais específicas.
- A detecção eletroquímica fornece análise em tempo real dos níveis de neurotransmissores.
- Manipulações farmacológicas e fisiológicas podem alterar a neurotransmissão basal.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a metodologia para monitorar os níveis de neurotransmissores in vivo.
- Explorar a relação entre a liberação de neurotransmissores e os resultados comportamentais.
- Fornecer insights sobre os efeitos de diversas manipulações na neurotransmissão.
Métodos Utilizados
- Técnica de microdiálise in vivo.
- Métodos de detecção eletroquímica.
- Configuração experimental para monitoramento de animais em movimento livre.
- Intervenções farmacológicas para avaliar alterações na neurotransmissão.
Resultados Principais
- Monitoramento bem-sucedido dos níveis de neurotransmissores em regiões cerebrais distintas.
- Alterações demonstradas na neurotransmissão devido a manipulações farmacológicas.
- Estabelecimento de uma ligação entre a liberação de neurotransmissores e os comportamentos observados.
- Fornecimento de uma estrutura para estudos futuros sobre a dinâmica da neurotransmissão.
Conclusões
- A microdiálise in vivo é uma ferramenta valiosa para o estudo da dinâmica dos neurotransmissores.
- A detecção eletroquímica aprimora a compreensão da neurotransmissão em indivíduos vivos.
- Pesquisas futuras podem se basear nesses achados para explorar resultados comportamentais complexos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Cirurgia estereotáxica sobrevivível em roedores permite a implantação precisa de cânulas-guia e sondas de microdiálise para medição in vivo dos níveis extracelulares de neurotransmissores. Essa capacidade é fundamental para investigar a farmacodinâmica do SNC, apoiar a validação de alvos e reduzir riscos em hipóteses mecanicistas no descobrimento de fármacos para doenças neuropsiquiátricas e neurodegenerativas. A abordagem oferece alta resolução anatômica e química, facilitando a continuidade translacional desde as fases iniciais do descobrimento até a pesquisa pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a medição direta da dinâmica de neurotransmissores em resposta a desafios farmacológicos ou fisiológicos.
- Apóia a validação funcional de alvos do SNC ao associar a ação de compostos a alterações neuroquímicas em regiões cerebrais específicas.
- Facilita a desvinculação mecanicista ao permitir a administração localizada de fármacos e a avaliação da resposta.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara modelos validados de roedores para ensaios neuroquímicos quantitativos utilizando microdiálise e CLAE-EC.
- Permite a coleta reprodutível e padronizada de neurotransmissores extracelulares para avaliação de compostos em etapas subsequentes.
- Apóia a escalabilidade do ensaio e a reutilização da plataforma em diversos alvos e vias do SNC.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha leituras neuroquímicas in vivo com pontos finais relevantes para a doença no desenvolvimento translacional de biomarcadores.
- Oferece continuidade desde estudos mecanicistas em fase de descoberta até modelos pré-clínicos de eficácia e segurança.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados neuroquímicos quantitativos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a investigação orientada por hipóteses de alvos e vias do SNC em modelos animais vivos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias por meio da medição neuroquímica direta.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para avaliação de compostos e padronização de ensaios.
- Análises: Fornece dados neuroquímicos de alta resolução para comparação estatística de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas ao alinhamento de biomarcadores pré-clínicos e à relevância para doenças.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para estudos de farmacologia do SNC em múltiplos programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na descoberta de fármacos para o SNC.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho cirúrgicos e analíticos para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao fornecer desfechos neuroquímicos robustos.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos para o SNC com base no engajamento funcional do alvo.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cirurgia estereotáxica em roedores e técnicas de amostragem neuroquímica.
- Exige acesso a instrumentação especializada, como aparelhos estereotáxicos, sondas de microdiálise e sistemas de CLAE-EC.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes dos protocolos cirúrgicos e analíticos.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes linhagens de roedores ou regiões cerebrais de interesse.
- A resolução temporal é limitada pelos intervalos de amostragem de microdiálise, tipicamente 20–30 minutos por amostra.
