Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Este procedimento começa com a fixação, tratamento com metanol e proteinase K dos embriões, seguido de incubação durante a noite com sonda uma escavação ou escavação e sonda. Dois embriões de isotiocianato de fluoresceína ou ZI são incubados com anticorpo dig após reação de cor com fosfatase alcalina dig. A atividade é inativada e os embriões são incubados.

Com o anticorpo FSE, a reação de cor é realizada com Zi e os embriões são fixados. Olá, sou Delphine, do laboratório de Rick Finnel no Centro de Medicina Ambiental e Genômica da Universidade Texas e m em Houston. Hoje mostraremos o procedimento para realizar a hibridização situ de dois corantes no embrião de pintinho.

Usamos esse procedimento em laboratório para analisar os efeitos de drogas antiepilépticas nos genes gástricos e neurais. Então vamos começar Para realizar a hibridização in situ em embriões de pintinho, primeiro abra um ovo batendo na casca com uma pinça e removendo pedaços da casca. Remova a albumina grossa com uma pinça e incline o saco vitelino com uma pinça grossa para que o embrião fique voltado para cima usando uma tesoura fina.

Corte um quadrado de saco vitelino ao redor do embrião. Retire o embrião da gema com uma colher e coloque em um prato com gelo. PBS frio sob um microscópio de dissecação Remova cuidadosamente as membranas e o ylk e transfira o embrião para um prato fresco contendo gelo.

O PBS frio segura o embrião com uma pinça e aspira o PBS na capela. Substitua-o por 4% de aldeído paraforme em PBS e deixe o embrião se fixar a quatro graus Celsius durante a noite. Depois que os embriões estiverem fixados, aspire a solução fixadora e descarte adequadamente como resíduo químico.

Encha o prato com PBS gelado usando uma agulha microcapilar de ponta romba ou uma faca de microdissecção para perfurar a cabeça e as cavidades cardíacas. Para evitar o aprisionamento da sonda. Coloque os embriões em DEP CPBS contendo 0,1% entre 20 e, em seguida, desidrate os embriões em uma lavagem em série de metanol por 10 minutos cada em 25%50%75% e 100% de metanol em PBT.

Repita a lavagem com 100% de metanol. Os embriões agora podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius em metanol. Em frascos de cintilação de vidro de 20 mililitros.

Para realizar a hibridização in situ, será necessário primeiro reidratar os embriões. Para fazer isso, lave os embriões 10 minutos cada em 75%50%e 25%metanol em PBT. Por fim, lave duas vezes por 10 minutos cada.

Em PBT, remova a solução de PBT dos frascos para injetáveis e substitua por uma solução de proteinase K de cinco microgramas por mililitro. Três mililitros por frasco. Enrole suavemente o frasco para se certificar de que todo o conteúdo está exposto à solução de proteinase K.

Deixar em solução de proteinase K durante um a cinco minutos, dependendo da fase embrionária. Enquanto isso, prepare a solução fixadora gelada usando uma pipeta de passagem livre de RNA, remova a solução de proteinase K e adicione dois mililitros da solução fixadora. Coloque imediatamente o frasco para injetáveis no gelo durante exatamente 20 minutos.

Em seguida, lave os embriões em temperatura ambiente em um mutador. Realize duas lavagens de 10 minutos em PBT seguidas de uma lavagem de 10 minutos em tampão de hibridização de 50% em PBT. Em seguida, lave uma vez em tampão de hibridização a 100%, incube os embriões em dois mililitros de tampão de hibridização por quatro a cinco horas.

A 65 graus Celsius. Os embriões estão agora prontos para serem hibridizados com sondas de escavação e a síntese de sonda acoplada fitzy é descrita no material de suporte. A sonda que deve dar um sinal forte deve ser sintetizada com nucleotídeos contendo FSE, enquanto as sondas mais fracas devem ser sintetizadas com nucleotídeos contendo escavação.

Sondas de pré-aviso em tampão de hibridização usando um frasco de dois mililitros. Remova o tampão de hibridização dos embriões e substitua imediatamente o tampão de hibridização pela solução da sonda. É importante não deixar os embriões secarem incubados por 16 horas a 65 graus Celsius.

Após a etapa de hibridização da sonda, substitua a solução da sonda pelo tampão de hibridização. Realize duas lavagens de 30 minutos a 65 graus Celsius e, em seguida, lave por 15 minutos em uma mistura individual de hibridização, tampão e tampão de ácido maleico novamente a 65 graus Celsius. Após esta etapa, você não precisa mais usar condições livres de RNAs.

Agora você está pronto para executar a reação de cor de escavação seguida pela reação de cor de Fitz. Para realizar a hibridização de anticorpos e a reação de cor primeiro, lave os embriões duas vezes por 20 minutos cada em tampão de ácido maleico. Em seguida, lave por uma hora em 2% VBR em tampão de ácido maleico.

Finalmente, observe por cinco horas em tampão de bloqueio Dilua o anticorpo de escavação um a 2000 em tampão de bloqueio e incube os embriões nesta solução em um mutador durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, realize três lavagens de 10 minutos em tampão de ácido maleico, seguidas de três lavagens de uma hora em tampão de ácido maleico. Lave duas vezes por 20 minutos cada.

Em NTMT, adicione 200 microlitros de substrato N-B-T-B-C-I-P a 10 mililitros. NTMT remova imediatamente o NTMT do frasco com o embrião e substitua por um a dois mililitros. N-B-T-B-C-I-P lugar de buffer no escuro.

Monitore a reação de cor após 20 minutos e em intervalos de 20 minutos a partir de então. Quando a cor azul se desenvolver adequadamente, lave os embriões em PBS por 10 minutos. Em seguida, substitua o PBS por 4% de aldeído paraforme em PBS.

Fixe durante a noite a quatro graus Celsius. Transfira o embrião para um novo frasco de instalação syn em PBT duas vezes por 10 minutos cada, seguido por duas lavagens de 10 minutos em tampão de ácido maleico. Incube os embriões em tampão de ácido maleico por 30 minutos a 65 graus Celsius.

Agora é hora de realizar a segunda incubação de anticorpos e reação de cor. Para detectar nossa segunda sonda marcada com fita, lave os embriões duas vezes por 10 minutos cada em tampão de ácido maleico. Uma hora em 2%BBR em tampão ácido maleico.

E então cinco horas no tampão de bloqueio diluem o anticorpo anti FTSE acoplado à fosfatase alcalina de um a 500 no tampão de bloqueio e incubam os embriões nesta solução durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, realizou três lavagens de 10 minutos em tampão de ácido maleico, seguidas de três lavagens de uma hora em tampão de ácido maleico. Em seguida, lave duas vezes por 20 minutos cada.

Em Tris HCL, prepare cinco mililitros de solução de trabalho vermelha vetorial em tris HCL de acordo com o protocolo do fabricante. Remova imediatamente o triss HCL do frasco para injetáveis e substitua pelo tampão vermelho vetorial. Coloque os frascos no escuro.

Monitore a reação de cor após 30 minutos e em intervalos de 30 minutos depois disso, após o desenvolvimento da cor vermelha, transfira os embriões para PBS. Você está finalmente pronto para consertar e processar os embriões. Transfira-os para uma placa de fixação contendo 4% de paraforme, aldeído e fixe por 20 minutos em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius.

Lave duas vezes em PBS 10 minutos por lavagem para processar a fotografia. Transfira os embriões para 20% de glicerol em PBS. Isso tornará os embriões translúcidos para serem processados para seccionamento de cera.

Transfira os embriões de volta para PBS, lave duas vezes por 10 minutos cada, desidrate em uma série de metanol por 10 minutos cada, substitua o metanol por propanol e incube por três minutos. Remova o propanol e substitua por 1 2 3 4 tetra hydro nap filine por 20 minutos, seguido de histo clear, duas lavagens por uma hora cada. Substitua por uma mistura individual de histo clear e cera e incube a 60 graus Celsius por uma hora.

Substitua esta solução por cera e processe para histologia. Este embrião é marcado com um oxigênio digo em meias, duas sondas em azul e uma sonda delta fitzy uma que aparece em vermelho. A primeira reação de cor revela o padrão de expressão das meias. Dois.

Um marcador para a placa neural desenvolvido no laboratório do Dr.Robin distintivo de nível sox duas células positivas aparecem em azul após a reação com N-B-T-B-C-I-P. O mesmo embrião é então processado para a segunda reação de cor, que revela o padrão de expressão do delta um. Um marcador para a placa segmentar desenvolvido no laboratório do Dr. Domingo Enrique Delta um células positivas aparecem em vermelho, após reação com vetor vermelho.

Este embrião é marcado com uma sonda digo em PAC seis em azul e uma sonda SHH fitzy em vermelho. A primeira reação de cor revela o padrão de expressão de PAC seis, um marcador para as dobras neurais e somitos em desenvolvimento desenvolvido no laboratório do Dr. Martin Goulding Pac. Seis células positivas aparecem em azul após a reação com N-B-T-B-C-I-P.

A segunda reação de cor revela o padrão de expressão do marcador SHHA para o Noor e a linha média ventral do tubo neural desenvolvido no laboratório do Dr. Cliff Tabban. As células positivas para SHH aparecem em vermelho, após a reação com o vetor vermelho. Acabamos de mostrar como realizar a hibridização de cores e c no frango ry.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar soluções tratadas com profundidade C, bem como autoclave, pfas e vi estéril. Para minimizar o contato com RNAs está nas etapas três a cinco. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.