Reaggregate Culturas Thymus

Olá, sou Andrea White e sou do laboratório de Graham Anderson e Eric Jenkinson no Centro MRC de Regulação Imunológica da Universidade de Birmingham. Hoje apresento um protocolo para derivar culturas de órgãos tímicos reagregados, que pode ser usado para estudar interações celulares complexas que ocorrem durante a diferenciação de células T. Antes do início deste procedimento, os lobos tímicos embrionários foram isolados e tratados para remover todos os linfócitos.

Isso pode ser visto em um vídeo separado. Os lobos alienóides são então desagregados para produzir uma preparação de células estromais. E, finalmente, as células são agregadas para formar uma cultura de órgãos fmic reagregada.

Vamos começar. Após cinco a sete dias em cultura, o LO deve estar pronto para desagregar para preparações de células de cardume, mergulhe os filtros de 0,8 micrômetro em uma placa de Petri contendo RPMI 1640 mais 10% FCS Usando fórceps, empurre suavemente quaisquer inclinações de fibra que não flutuem. Use um milhão por animal de estimação para transferir os lóbulos para um tubo de 1,5 mil.

Recomendamos não mais do que 50 lóbulos por tubo de extremidade ou tubo. Deixe os lóbulos assentarem no fundo do tubo sob a gravidade da unidade e remova o meio. Lave os lóbulos com um mil PBS e deixe-os afundar novamente.

Repita isso para um total de três lavagens de PBS, remova a última lavagem de PBS e adicione 600 microlitros de 0,25% de viagens em solução. Coloque o tubo einor em uma incubadora de 37 graus por 25 minutos. Tritrate suavemente os lóbulos usando uma ponta azul de um mil em um perpet por 10 segundos e, em seguida, coloque de volta na incubadora após 20 minutos, pipete os lóbulos para cima e para baixo para desagregá-los completamente.

Deve demorar cerca de 30 segundos Para obter uma suspensão de célula única, adicione 400 microlitros gelados, RPMI 1640 mais 10% FCS para neutralizar a tripsina imp pellet as células por centrifugação a mil RPM, 10 minutos a quatro graus C, remova o líquido e ressuspenda o pellet em um mil. RPMI 1640 mais 10%FCS se desejar. Contar células.

Normalmente, esperaríamos cerca de 50.000 células por lobo de dioxazina, começando com um E 15 fibroso. Agora estamos prontos para formar as culturas agregadas de Corgan em um tubo de um metro e meio de comprimento. Células estromais finas misturadas e recém-preparadas.

Juntamente com o CD pré-selecionado, quatro CDs positivos e oito fibrócitos positivos. Recomendamos uma proporção de um para um de células estromais para fibrócitos. O número de células que você usará dependerá do número de células disponíveis e dos experimentos a serem realizados.

Recomendamos pelo menos cem mil células no total e não mais do que 1,5 milhão de células. Você quer que os agregados V sejam grandes o suficiente para serem reproduzíveis, mas não tão grandes que o centro morra células de pellets por centrifugação a mil RPM por 10 minutos. A quatro graus C, monte cuidadosamente o filtro de cultura de órgãos.

Remova todo o SUP natin no estágio com um P 200 por animal. O pellet de célula de vórtice por 10 segundos para formar uma pasta. O volume deve ficar em torno de um a dois microlitros na boca.

Acaricie a pasta em um animal de estimação finamente desenhado, mantendo a suspensão de células na ponta do animal. Sob nosso microscópio de dissecação, coloque cuidadosamente a pasta da célula no centro de um filtro de 0,8 micrômetro. Idealmente, as células devem ser colocadas como uma gota vertical em um círculo de um a dois milímetros de diâmetro.

Se a pasta começar a se espalhar, permita que o fluido na pasta escorra pela posição antes de depositar as células restantes. Coloque o prato em uma caixa de sanduíche de plástico e feche. Quanto às culturas de órgãos do timo, e colocamos uma caixa em uma incubadora, agregamos as culturas em estruturas intactas dentro de 18 horas após a cultura.

Após quatro a cinco dias de cultivo, eles gerarão os subconjuntos de DC quatro positivos oito negativos e CD quatro negativos oito positivos positivos de citos maduros. Começando com 50 lobos tratados com dioxazina, deve-se fornecer células estromais suficientes para preparar de três a cinco culturas reagregadas. Essas culturas geralmente aparecem como montes coerentes de células que podem ser empurradas para fora dos filtros usando fórceps sem interrompê-los.

Acabamos de descrever o método para estudar a seleção positiva por células epiteliais F. Este método também pode ser usado para estudar a seleção negativa mediada por células dendríticas. Finalmente, usando FIBRÓCITOS transgênicos TCR ou células estromais deficientes em MHC Classe um ou MHC Classe dois.

Este sistema permite investigações separadas na seleção de células T CD quatro positivas ou CD oito positivas. Obrigado por sintonizar.