Name: Reaggregate Culturas Thymus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Aprenda a preparar culturas de reagregação de timo tratadas com 2-dGuo para estudar diferenciação de células T e interações celulares em imunologia. Este método permite investigar seleção positiva e negativa.

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Para mais informações sobre como preparar reggregate culturas timo visite <a href="http://www.springerprotocols.com/">Protocolos Springer</a> .

Os autores não têm nada a declarar.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

reaggregate culturas thymus

Reaggregate Thymus Cultures

No timo, CD4 + timócitos imaturos 8 expressar rearranjadas aleatoriamente receptor de células T α-e b-corrente genes submetidos a eventos de seleção positiva e negativa com base em sua capacidade de reconhecer complexo de histocompatibilidade self-peptide/major (MHC) moléculas expressas por tímica células do estroma. Análise in vivo do papel das células do estroma tímico durante a seleção intratímicas é dificultada pela complexidade celular do microambiente do timo no timo steady-state de adultos, e pela falta de estratégias apropriadas visando manipular a expressão gênica do timo, em especial compartimentos estromal. Nós mostramos que o microambiente tímico pode ser facilmente manipulados in vitro através do uso de culturas de órgãos reaggregate timo, que permitem a preparação de três lobos-dimensional definido timo de células do estroma e linfóide. Embora outros sistemas in vitro suporte a alguns aspectos do desenvolvimento de células T, reaggregate cultura órgão timo continua sendo o único sistema in vitro capaz de suportar MHC classe I e II eficiente mediada por eventos de seleção timócito, e assim pode ser usado como uma ferramenta eficaz para estudar a regulação celular e molecular da seleção positiva e negativa no timo.

Neste vídeo a preparação de 2-dGuo tratados reaggregate culturas timo é demonstrada.

Reaggregate Culturas Thymus

As células estromais nos tecidos linfoides organizam-se em estruturas tridimensionais que fornecem um arcabouço que, acredita-se, controla a migração e...

Olá, sou Andrea White e faço parte do laboratório de Graham Anderson e Eric Jenkinson no Centro MRC para Regulação Imunológica da Universidade de Birmingham. Hoje apresento um protocolo para obtenção de culturas de órgãos timicos reagregados, que podem ser utilizadas para estudar interações celulares complexas que ocorrem durante a diferenciação de linfócitos T. Antes do início deste procedimento, lóbulos timicos embrionários foram isolados e tratados para remoção de todos os linfócitos.Isso pode ser observado em um vídeo separado. Os lóbulos alienoides são então dissociados para produzir uma preparação de células estromais. E, finalmente, as células são agregadas para formar uma cultura de órgão fmic em reagregado.Vamos começar. Após cinco a sete dias em cultura, o LO deverá estar pronto para ser dissociado para preparações de células em cardume; submerja os filtros de 0,8 micrômetro em uma placa de Petri contendo RPMI 1640 mais 10% de FCS. Com pinça, empurre suavemente qualquer fragmento fibroso que não se soltar flutuando. Use uma pipeta de 1 mL para transferir os lóbulos para um tubo eppendorf de 1,5 mL.Recomendamos não mais de 50 lóbulos por tubo de eend órfão. Deixe os lóbulos sedimentarem no fundo do tubo sob gravidade unitária e remova o meio. Lave os lóbulos com um mililitro de PBS e, em seguida, deixe os lóbulos sedimentarem novamente no fundo.Repita isso por um total de três lavagens com PBS, remova a última lavagem com PBS e adicione 600 microlitros de uma solução de 0,25% de tripsina. Coloque o tubo eppendorf em um incubador a 37 graus por 25 minutos. Triture suavemente os lobos usando uma ponteira azul de 1 mL em um pipetador por 10 segundos e, em seguida, após 20 minutos, coloque novamente no incubador, pipetando os lobos para cima e para baixo para dissociá-los completamente.Deve levar cerca de 30 segundos para obter uma suspensão de células únicas; adicione 400 microlitros de RPMI 1640 gelado com 10% de FCS para neutralizar a tripsina, precipite as células por centrifugação a mil RPM durante 10 minutos a quatro graus C, remova o sobrenadante e re-suspenda o precipitado em um mililitro de RPMI 1640 com 10% de FCS, se desejado. Conte as células.Normalmente esperaríamos cerca de 50.000 células por lobo de dioxazina, partindo de um tecido fibroso E15. Agora estamos prontos para formar os agregados de culturas de Corgan fmic em um tubo de orf de um mil e meio. Células estromais finas, misturadas e recém-preparadas.Juntamente com fibrocitos CD4 positivos e CD8 positivos previamente selecionados. Recomendamos uma proporção de aproximadamente um para um entre células estromais e fibrocitos. O número de células que você utilizará dependerá da quantidade de células disponíveis e dos experimentos a serem realizados.Recomendamos pelo menos cem mil células no total e não mais de 1,5 milhão de células. Você deseja que os agregados de V sejam grandes o suficiente para serem reprodutíveis, mas não tão grandes que o centro morra. Pela centrifugação a mil RPM durante 10 minutos, forme o pellet de células. A quatro graus C, monte cuidadosamente o filtro de cultura de órgãos.Remova todo o sobrenadante da etapa com uma pipeta P200 por placa. Vortex o pellet celular por 10 segundos para formar uma suspensão. O volume deve ser de cerca de um a dois microlitros.Pressione a suspensão suavemente com um bastão de vidro finamente puxado, mantendo a suspensão de células na ponta do bastão. Sob nosso microscópio estereoscópico, coloque cuidadosamente por aspiração a suspensão celular no centro de um filtro de 0,8 micrômetro. Idealmente, as células devem ser depositadas na forma de uma gota elevada, em um círculo com diâmetro de um a dois milímetros.Se a suspensão começar a se espalhar, permita que o fluido na suspensão drene através do pos antes de depositar as células remanescentes. Coloque a placa em uma caixa plástica tipo sanduíche e feche-a hermeticamente. No caso de culturas de órgãos do timo, coloque uma caixa em uma incubadora; nossas culturas agregadas formam estruturas intactas dentro de 18 horas de cultivo.Após quatro a cinco dias de cultivo, eles gerarão subpopulações maduras de cítos CD quatro positivo oito negativo e CD quatro negativo oito positivo. Começar com 50 lobos tratados com dioxazina deve fornecer quantidade suficiente de células estromais para preparar de três a cinco culturas reagregadas. Essas culturas geralmente aparecem como montículos coerentes de células que podem ser removidos dos filtros usando pinças sem desestruturá-los.Acabamos de descrever o método para estudar a seleção positiva por células epiteliais F. Este método também pode ser utilizado para estudar a seleção negativa mediada por células dendríticas. Finalmente, utilizando fibrocitos transgênicos para TCR ou células estromais deficientes em MHC Classe I ou deficientes em MHC Classe II.Este sistema permite investigações separadas sobre a seleção de linfócitos T positivos para CD4 ou positivos para CD8. Obrigado por acompanhar.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra a dissecção e remoção do timo fetal, bem como o preparo de culturas ex vivo de 2-dGuo tratados com timo.

Preparação de 2-dGuo-Tratada Culturas Organ Thymus

Este vídeo demonstra um protocolo para gerar células T funcionais específicas do antígeno a partir de células T imaturas derivadas de iPSC usando um sistema de cultura tímica tridimensional. A co-cultura de células T imaturas derivadas de iPSC com lobos tímicos fetais de camundongos empobrecidos de linfócitos endógenos resultou em maturação bem-sucedida das células T para formar emigrantes tímicos derivados de iPSC CD8αβ + MHC classe I + iPSC.

Sistema de cultura tímica tridimensional para gerar emigrantes tímicos derivados de iPSC

Este protocolo detalha um método para isolar células apresentadoras de antigénio a partir de timo humano por meio de diferentes passos de digestão enzimática do tecido seguida por centrifugação de densidade da suspensão de células individuais e finalmente separação magnética e / ou FACS das populações de células de interesse.

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

Descrevemos aqui um método eficaz para o isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo do rato (TEC). O protocolo pode ser utilizada para estudos da função do timo para o desenvolvimento normal das células T, disfunção do timo, e a reconstituição de células T.

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

O estudo de células epiteliais tímicas medulares in vitro não teve sucesso, pois os sistemas de cultura 2D atuais não imitam o cenário in vivo. O sistema de cultura 3D aqui descrito - um modelo de cultura organotípica de pele modificada - provou ser superior na recapitulação da proliferação, diferenciação e manutenção da expressão gênica promíscua.

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Este artigo descreve a metodologia in vivo e in vitro para caracterizar os progenitores de decantação tímica pela análise da cinética de geração, fenótipo e número de suas progênies de células T.

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Este vídeo demonstra um protocolo para enriquecer células epiteliais tímicas (TECs) com gradiente de densidade para isolamento de FACS. Também mostra o uso de peptídeos EAK16-II/EAKIIH6 para promover a formação de agregados TEC. Os microambientes do hidrogel EAK16-II/EAKIIH6 fornecem a configuração 3-D necessária para manter a sobrevivência e a função dos TECs.

Promover 3-D agregação de células FACS purificada epiteliais tímicos com EAK 16-II / EAKIIH6 de auto-montagem Hidrogel

Descreve-se a preparação de fatias do timo que, em combinação com a citometria de fluxo, podem ser utilizados para modelar selecção positiva e negativa do desenvolvimento de células T. Fatias do timo pode também ser adaptado para a análise in si tu de migração de timócitos, localização e a sinalização através de imunofluorescência e microscopia de dois fotões.

Preparação e Aplicações de culturas organotípicas Tímico Fatia

Este artigo descreve um método novo para gerar emigrantes Thymic de pilha-derivado induzido antígeno-específico do tumor (iTE) por um sistema Thymic tridimensional da cultura (3D). iTE é um subconjunto homogêneo de células T intimamente relacionadas com células T ingênuas com a capacidade de proliferação, formação de memória e supressão tumoral.

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

Este protocolo descreve o isolamento de timócitos duplo-negativos do timo de camundongo seguido de transdução retroviral e co-cultura no sistema de co-cultura de linhagem celular estromal de medula óssea delta-like 4 (OP9-DL4) para análise funcional adicional.

Co-cultura e transdução de timócitos murinos em células estromais delta-like 4 expressando para estudo de oncogenes em leucemia de células T

Aqui, descrevemos um protocolo para a formação de organoides de timo derivados de iPSC humanos cultivados em hidrogéis de fibrina 3D com o objetivo de apoiar a maturação e manutenção prolongada das células epiteliais tímicas (TEC), bem como a timopoiese in vitro.

Formação de organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina tridimensionais

Aprenda a preparar culturas de reagregação de timo tratadas com 2-dGuo para estudar diferenciação de células T e interações celulares em imunologia. Este método permite investigar seleção positiva e negativa.

Reaggregate Culturas Thymus

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