Reaggregate Culturas Thymus

Olá, sou Andrea White e faço parte do laboratório de Graham Anderson e Eric Jenkinson no Centro MRC para Regulação Imunológica da Universidade de Birmingham. Hoje apresento um protocolo para obtenção de culturas de órgãos timicos reagregados, que podem ser utilizadas para estudar interações celulares complexas que ocorrem durante a diferenciação de linfócitos T. Antes do início deste procedimento, lóbulos timicos embrionários foram isolados e tratados para remoção de todos os linfócitos.

Isso pode ser observado em um vídeo separado. Os lóbulos alienoides são então dissociados para produzir uma preparação de células estromais. E, finalmente, as células são agregadas para formar uma cultura de órgão fmic em reagregado.

Vamos começar. Após cinco a sete dias em cultura, o LO deverá estar pronto para ser dissociado para preparações de células em cardume; submerja os filtros de 0,8 micrômetro em uma placa de Petri contendo RPMI 1640 mais 10% de FCS. Com pinça, empurre suavemente qualquer fragmento fibroso que não se soltar flutuando. Use uma pipeta de 1 mL para transferir os lóbulos para um tubo eppendorf de 1,5 mL.

Recomendamos não mais de 50 lóbulos por tubo de eend órfão. Deixe os lóbulos sedimentarem no fundo do tubo sob gravidade unitária e remova o meio. Lave os lóbulos com um mililitro de PBS e, em seguida, deixe os lóbulos sedimentarem novamente no fundo.

Repita isso por um total de três lavagens com PBS, remova a última lavagem com PBS e adicione 600 microlitros de uma solução de 0,25% de tripsina. Coloque o tubo eppendorf em um incubador a 37 graus por 25 minutos. Triture suavemente os lobos usando uma ponteira azul de 1 mL em um pipetador por 10 segundos e, em seguida, após 20 minutos, coloque novamente no incubador, pipetando os lobos para cima e para baixo para dissociá-los completamente.

Deve levar cerca de 30 segundos para obter uma suspensão de células únicas; adicione 400 microlitros de RPMI 1640 gelado com 10% de FCS para neutralizar a tripsina, precipite as células por centrifugação a mil RPM durante 10 minutos a quatro graus C, remova o sobrenadante e re-suspenda o precipitado em um mililitro de RPMI 1640 com 10% de FCS, se desejado. Conte as células.

Normalmente esperaríamos cerca de 50.000 células por lobo de dioxazina, partindo de um tecido fibroso E15. Agora estamos prontos para formar os agregados de culturas de Corgan fmic em um tubo de orf de um mil e meio. Células estromais finas, misturadas e recém-preparadas.

Juntamente com fibrocitos CD4 positivos e CD8 positivos previamente selecionados. Recomendamos uma proporção de aproximadamente um para um entre células estromais e fibrocitos. O número de células que você utilizará dependerá da quantidade de células disponíveis e dos experimentos a serem realizados.

Recomendamos pelo menos cem mil células no total e não mais de 1,5 milhão de células. Você deseja que os agregados de V sejam grandes o suficiente para serem reprodutíveis, mas não tão grandes que o centro morra. Pela centrifugação a mil RPM durante 10 minutos, forme o pellet de células. A quatro graus C, monte cuidadosamente o filtro de cultura de órgãos.

Remova todo o sobrenadante da etapa com uma pipeta P200 por placa. Vortex o pellet celular por 10 segundos para formar uma suspensão. O volume deve ser de cerca de um a dois microlitros.

Pressione a suspensão suavemente com um bastão de vidro finamente puxado, mantendo a suspensão de células na ponta do bastão. Sob nosso microscópio estereoscópico, coloque cuidadosamente por aspiração a suspensão celular no centro de um filtro de 0,8 micrômetro. Idealmente, as células devem ser depositadas na forma de uma gota elevada, em um círculo com diâmetro de um a dois milímetros.

Se a suspensão começar a se espalhar, permita que o fluido na suspensão drene através do pos antes de depositar as células remanescentes. Coloque a placa em uma caixa plástica tipo sanduíche e feche-a hermeticamente. No caso de culturas de órgãos do timo, coloque uma caixa em uma incubadora; nossas culturas agregadas formam estruturas intactas dentro de 18 horas de cultivo.

Após quatro a cinco dias de cultivo, eles gerarão subpopulações maduras de cítos CD quatro positivo oito negativo e CD quatro negativo oito positivo. Começar com 50 lobos tratados com dioxazina deve fornecer quantidade suficiente de células estromais para preparar de três a cinco culturas reagregadas. Essas culturas geralmente aparecem como montículos coerentes de células que podem ser removidos dos filtros usando pinças sem desestruturá-los.

Acabamos de descrever o método para estudar a seleção positiva por células epiteliais F. Este método também pode ser utilizado para estudar a seleção negativa mediada por células dendríticas. Finalmente, utilizando fibrocitos transgênicos para TCR ou células estromais deficientes em MHC Classe I ou deficientes em MHC Classe II.

Este sistema permite investigações separadas sobre a seleção de linfócitos T positivos para CD4 ou positivos para CD8. Obrigado por acompanhar.