Name: Preparação de 2-dGuo-Tratada Culturas Organ Thymus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprenda a preparar culturas de órgãos de timo fetal tratadas com 2-dGuo para estudar o desenvolvimento de células T em imunologia. Este método permite analisar interações estromais in vitro.

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Os autores não têm nada a declarar.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
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In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

preparação de 2-dguo-tratada culturas organ thymus

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

No timo, CD4 + timócitos imaturos 8 expressar rearranjadas aleatoriamente receptor de células T α-e b-corrente genes submetidos a eventos de seleção positiva e negativa com base em sua capacidade de reconhecer complexo de histocompatibilidade self-peptide/major (MHC) moléculas expressas por tímica células do estroma. Análise in vivo do papel das células do estroma tímico durante a seleção intratímicas é dificultada pela complexidade celular do microambiente do timo no timo steady-state de adultos, e pela falta de estratégias apropriadas visando manipular a expressão gênica do timo, em especial compartimentos estromal. Nós mostramos que o microambiente tímico pode ser facilmente manipulados in vitro através do uso de culturas de órgãos reaggregate timo, que permitem a preparação de três lobos-dimensional definido timo de células do estroma e linfóide. Embora outros sistemas in vitro suporte a alguns aspectos do desenvolvimento de células T, reaggregate cultura órgão timo continua sendo o único sistema in vitro capaz de suportar MHC classe I e II eficiente mediada por eventos de seleção timócito, e assim pode ser usado como uma ferramenta eficaz para estudar a regulação celular e molecular da seleção positiva e negativa no timo.

Este vídeo demonstra a dissecção e remoção do timo fetal, bem como o preparo de culturas ex vivo de 2-dGuo tratados com timo.

Preparação de 2-dGuo-Tratada Culturas Organ Thymus

No timo, sabe-se que as interações entre os precursores de células T em desenvolvimento e as células estromais, que incluem células epiteliais corticais e medulares, desempenham ...

Olá, sou Will Jenkinson, do grupo de Graham Anderson e Eric Jenkinson no Centro MRC para Regulação Imunológica da Universidade de Birmingham. Hoje vou mostrar uma técnica para o estabelecimento de culturas de órgãos timo fetais. Além disso, também vou mostrar como tratar essas culturas de órgãos com duas dioxazinas.E esta é uma substância que é seletivamente tóxica para células linfoides na cultura de órgãos. Existem várias aplicações dessa técnica no laboratório. Uma dessas aplicações é a produção de culturas de órgãos reagregados.Outras aplicações incluem o estudo das diferentes fases do desenvolvimento de cítos e, utilizando culturas de órgãos timo fetais, conseguimos adicionar reagentes que inibem ou estimulam diferentes vias, o que nos permite estudar o papel de moléculas específicas neste processo. Vamos então começar. O primeiro passo para o preparo de culturas de órgãos do timo é colher embriões de camundongo do dia 14 ou 15 de uma ou duas fêmeas prenhes.Primeiro, borrife o camundongo eutanasiado com etanol a 70%. Em seguida, use uma pinça para puxar o pelo e faça uma incisão em forma de V na região abdominal com uma tesoura, começando pela bexiga e seguindo pelos dois cornos laterais do útero. Remova o corno uterino e coloque-o em uma placa de Petri estéril de 10 centímetros.Corte ao longo do comprimento da parede uterina e remova os embriões ainda dentro de suas bolsas amnióticas. Lave-os em uma placa de Petri contendo 10 mil de PBS usando dois pares de pinças finas. Abra cuidadosamente a bolsa amniótica e libere o embrião da bolsa e da placenta.Em seguida, transfira os embriões para uma nova placa de Petri contendo 10 mililitros com uma mistura 50/50 de PBS e RPMI 1640, acrescentando meio com 10% de FCS. Sob um microscópio estereoscópico e mantendo o embrião submerso no meio, decapite o embrião utilizando pinças. Abra a superfície anterior da parede torácica inserindo as pontas de um par de pinças fechadas na cavidade torácica e, em seguida, abra as pinças para expor a cavidade torácica interna.Remova toda a árvore torácica, coração, pulmões, traqueia e timo pegando suavemente abaixo do coração e coloque em uma placa de 35 milímetros contendo cinco mililitros de RPMI 1640 mais 10% de FCS em um embrião de dia 14 a 15. Os lobos timicos rudimentares estão localizados logo acima do coração, em ambos os lados do tronco aqui.Remova os lóbulos individuais do timo usando pinças finas e também remova o tecido conjuntivo em excesso e qualquer sangue aderente antes de expandir para cultura de órgãos. Agora estamos prontos para a cultura de órgãos. Para preparar um linfoide detox, pegue um estoque de nove milimolar de Thor de dioxazina e prepare 600 microlitros em uma placa de Petri bacteriológica de 90 milímetros.Adicione quatro mililitros de meio DMEM pré-aquecido e gire o recipiente para que toda a superfície fique coberta pelo meio. Obviamente, se desejar obter culturas linfoides para estudar o desenvolvimento de linfócitos T, remova as duas dioxazinas com pinça. Coloque duas gaze estéreis, cortadas previamente em quadrados de um centímetro, dentro do recipiente.Deixe o meio penetrar na esponja por aproximadamente 30 segundos. Em seguida, vire a esponja para umedecer ambos os lados. Isso garante que o meio na placa tenha acesso ao tecido, novamente, utilizando pinças.Coloque um filtro pré-esterilizado de 0,8 mícron sobre a superfície de cada esponja. Os filtros são colocados com o lado brilhante voltado para cima sobre os suportes de esponja para transferir os lóbulos do timo para o filtro de cultura de órgãos; recomendamos o uso de uma pipeta de vidro de controle matemático para fabricar pipetas de vidro. Aqueça o tubo de vidro sobre uma chama de bico de Bunsen e, quando o vidro estiver maleável, retire-o da chama e puxe ambas as extremidades para esticar o vidro até no máximo 10 centímetros, permitindo que o vidro esfrie.Em seguida, puxe em cada extremidade para quebrar o vidro. Isso produz dois tubos de vidro cônicos. A região fina de cada um tem cerca de cinco centímetros de comprimento, com uma ponta de aproximadamente 0,5 milímetros de diâmetro.Para montar o aparelho de pipeta, coloque uma ponta de pipeta plástica na outra extremidade como bocal e insira a extremidade romba de uma pipeta de vidro na tubulação. Levante cuidadosamente lóbulos individuais do timo com a pipeta bucal e coloque-os sobre a superfície do filtro de 0,8 mícron. Em cultura de órgãos, recomendamos colocar de cinco a seis lóbulos timicos em cada filtro, perfazendo um total de 10 a 12 lóbulos timicos por placa.Isso permite bastante espaço para o crescimento das culturas de órgãos e permite que a dioxazina elimine todas as células linfoides endógenas. Uma vez montadas as culturas, monte uma tampa de caixa tipo sanduíche com a tampa de uma placa de Petri de 10 centímetros como plataforma e água bidestilada logo abaixo do nível da plataforma. Coloque até três placas na caixa e feche a tampa da caixa com fita adesiva.A tampa deve ter dois orifícios de ventilação de cinco milímetros perfurados em cantos opostos. Coloque as caixas em um incubador a 37 graus Celsius com 10% de CO₂ por cinco a sete dias, após o que desagregamos e, em seguida, reagregamos essas culturas para estudar interações estromais em sítios timicos num ambiente tridimensional controlado. Após um período de cultivo, normalmente de cinco a sete dias, os fócios são colhidos submergindo os filtros no meio e removendo delicadamente os lóbulos com pinça; pode-se observar que os fócios linfoides são tipicamente menores e císticos em comparação com os lóbulos linfoides não tratados com dioxazina.Acabei de mostrar a você a técnica para preparar culturas orgânicas tímicas fetais. Neste protocolo, mostramos como tratar as culturas orgânicas tímicas fetais com duas dioxazinas, o que esgota todas as células linfoides, normalmente após cinco a sete dias de cultivo do timo. Utilizamos essas culturas orgânicas para produzir culturas orgânicas reagregadas.No entanto, esta não é a única técnica. Também utilizamos culturas orgânicas fetais do timo não tratadas com dioxazina para transferência sob a cápsula renal de camundongos timicos. Além disso, empregamos culturas orgânicas fetais linfoides do timo para estudar o desenvolvimento de linfócitos T em condições controladas in vitro, livres de quaisquer efeitos secundários que possam ocorrer in vivo.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

preparation-of-2-dguo-treated-thymus-organ-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo a preparação de 2-dGuo tratados reaggregate culturas timo é demonstrada.

Reaggregate Culturas Thymus

Nós desenvolvemos novas ferramentas de laboratório e protocolos para aquisição de imagens intravital do timo. Nossa técnica deve ajudar na identificação de "nichos" dentro do timo, onde o desenvolvimento de células T ocorre.

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Este vídeo demonstra um protocolo para gerar células T funcionais específicas do antígeno a partir de células T imaturas derivadas de iPSC usando um sistema de cultura tímica tridimensional. A co-cultura de células T imaturas derivadas de iPSC com lobos tímicos fetais de camundongos empobrecidos de linfócitos endógenos resultou em maturação bem-sucedida das células T para formar emigrantes tímicos derivados de iPSC CD8αβ + MHC classe I + iPSC.

Sistema de cultura tímica tridimensional para gerar emigrantes tímicos derivados de iPSC

Este protocolo detalha um método para isolar células apresentadoras de antigénio a partir de timo humano por meio de diferentes passos de digestão enzimática do tecido seguida por centrifugação de densidade da suspensão de células individuais e finalmente separação magnética e / ou FACS das populações de células de interesse.

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

Descrevemos aqui um método eficaz para o isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo do rato (TEC). O protocolo pode ser utilizada para estudos da função do timo para o desenvolvimento normal das células T, disfunção do timo, e a reconstituição de células T.

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

O estudo de células epiteliais tímicas medulares in vitro não teve sucesso, pois os sistemas de cultura 2D atuais não imitam o cenário in vivo. O sistema de cultura 3D aqui descrito - um modelo de cultura organotípica de pele modificada - provou ser superior na recapitulação da proliferação, diferenciação e manutenção da expressão gênica promíscua.

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Descreve-se a preparação de fatias do timo que, em combinação com a citometria de fluxo, podem ser utilizados para modelar selecção positiva e negativa do desenvolvimento de células T. Fatias do timo pode também ser adaptado para a análise in si tu de migração de timócitos, localização e a sinalização através de imunofluorescência e microscopia de dois fotões.

Preparação e Aplicações de culturas organotípicas Tímico Fatia

Este artigo descreve um método novo para gerar emigrantes Thymic de pilha-derivado induzido antígeno-específico do tumor (iTE) por um sistema Thymic tridimensional da cultura (3D). iTE é um subconjunto homogêneo de células T intimamente relacionadas com células T ingênuas com a capacidade de proliferação, formação de memória e supressão tumoral.

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

Nós fornecemos um método simples e eficiente para transplantar 2 '-deoxyguanosine tratou e 18.5 timo na cápsula renal de um rato nu. Este método deve auxiliar no estudo da função de células epiteliais tímicas e da maturação das células T.

Transplantação subcapsular renal do Thymus Embryonic murine 2 '-Deoxyguanosine-Tratado em ratos nus

Aqui, descrevemos um protocolo para a formação de organoides de timo derivados de iPSC humanos cultivados em hidrogéis de fibrina 3D com o objetivo de apoiar a maturação e manutenção prolongada das células epiteliais tímicas (TEC), bem como a timopoiese in vitro.

Formação de organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina tridimensionais

Aprenda a preparar culturas de órgãos de timo fetal tratadas com 2-dGuo para estudar o desenvolvimento de células T em imunologia. Este método permite analisar interações estromais in vitro.

Preparação de 2-dGuo-Tratada Culturas Organ Thymus

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