Preparação e manutenção dos neurônios da raiz dorsal Gânglios em culturas Compartmented

Este procedimento começa com um arranhão com um ancinho no centro de uma placa revestida de colágeno e a pipetagem de 30 microlitros de metilcelulose no centro dos arranhões. Lubrifique cada divisor usando um carregador de graxa e prenda-o a uma placa revestida de colágeno. 100.000 células de embriões de rato E 15 no compartimento do meio.

Após nove dias, as células terão estendido os axônios para o compartimento lateral e estarão prontas para experimentação. Olá, sou Maria Murphy, do laboratório da Dra. Rosalyn Siegel no Departamento de Oncologia Pediátrica do Dana-Farber Cancer Institute. Hoje mostraremos um procedimento para a preparação e manutenção de neurônios dos gânglios da raiz de Dosa em culturas compartimentadas.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a sinalização da neurotrofina. Então vamos começar. Antes de instalar as câmaras compartimentadas, as placas de cultura de tecidos P 35 devem ser revestidas com colágeno.

Para fazer isso, adicione um mililitro de uma solução de 0,71 miligrama por mililitro de colágeno em HCL normal 0,001 às placas e incube-as a 37 graus Celsius por dois dias. Após dois dias, faça um arranhão no meio das placas revestidas de colágeno com um ancinho. Use um movimento para fora.

Em seguida, coloque 30 microlitros do N dois metilcelulose no meio do arranhão. Reserve os pratos. Em seguida, conecte um adaptador de isca de calibre 23 ao carregador de graxa.

Segure o divisor de Teflon com um par de hemostáticos de ângulo de 90 graus e coloque-o plano com o divisor voltado para cima sob um microscópio. Olhando através da luneta, corra o divisor com graxa. Certifique-se de que cada vez que o adaptador for colocado em um novo ponto de partida, ele seja inserido na graxa da etapa anterior para que haja uma linha contínua de graxa.

Depois que a graxa for aplicada em toda a divisória, vire um dos pratos P 35 preparados de cabeça para baixo e coloque-o de forma que o N dois metilcelulose fique sobre o compartimento do meio. Pressione o fundo do prato com uma pinça. Certifique-se de pressionar a parte interna da divisória nos quatro cantos.

É importante pressionar com firmeza suficiente para que a graxa faça uma vedação completa com um prato. Mas se muita pressão for adicionada, os axônios não cruzarão os compartimentos laterais. Em seguida, pegue Hemostats.

Vire o prato e solte a divisória. Em seguida, coloque o prato com a divisória firmemente presa sob o microscópio, concentrando-se na parte inferior do compartimento do meio. Use o carregador de graxa para fazer uma pequena barreira conectando os dois lados do divisor com cerca de um quarto de centímetro de altura.

Esta etapa evitará que as células vazem quando forem colocadas no compartimento do meio. Depois de configurar várias culturas, coloque a mídia DRG em cada um dos compartimentos laterais. Em seguida, coloque na incubadora onde as células serão mantidas.

Deixe as culturas descansarem por várias horas e depois verifique se há vazamentos. Se a mídia vazou para o compartimento do meio, então a cultura é inutilizável. Ao aprender essa técnica pela primeira vez, é importante configurar mais culturas do que o necessário para um experimento, pois várias provavelmente terão vazamentos.

Depois de confirmar que as câmaras compartimentadas são utilizáveis, prossiga com a manutenção da cultura de neurônios dos gânglios da raiz dorsal. Antes da experimentação, os neurônios DRG são mantidos nas culturas compartimentadas. Durante um período de nove dias a 37 graus Celsius no primeiro dia, substitua a mídia DRG nos compartimentos laterais por 100 nanogramas por mililitro.

A mídia DRGN mais a mídia A-C-D-R-G-N contém fator de crescimento nervoso e fator neurotrófico derivado do cérebro. A receita para esta mídia está disponível em nosso protocolo escrito. Realizar a dissecação em embriões de rato E 15 e adicionar 100 000 células ao compartimento central.

No segundo dia. Adicione 10 nanogramas por mililitro de mídia DRGN mais um C na parte externa do divisor de Teflon até que a mídia flua sobre a barreira de graxa e troque fluido com o compartimento central no terceiro dia, substitua a mídia nos compartimentos laterais por 100 nanogramas por mililitro. DRGN omitindo o a c.

Substitua também o surround por 10 nanogramas por mililitro. DRGN omitindo o RSC no sexto dia. Substitua a mídia nos compartimentos laterais por um nanograma por mililitro, DRGN mais RSC e o surround por mídia DRG mais RSC.

No nono dia, a cultura compartimentada está pronta para experimentação. Após a conclusão da experimentação, os divisores de Teflon podem ser reutilizados, mas devem ser devidamente limpos. Para fazer isso, remova a divisória da placa e limpe toda a graxa restante.

Em seguida, coloque em ácido sulfúrico por dois dias. Após dois dias, retire os divisores do ácido e enxágue-os com água três vezes, ferva por 20 minutos e deixe secar. Coloque os divisores secos em uma placa de Petri P 100 de vidro e autoclave por 20 minutos após a esterilização, eles estarão prontos para experimentos futuros.

Este sistema de cultura compartimentado permite a separação do corpo celular do axônio para estudar os mecanismos pelos quais as neurotrofinas sinalizam através de axônios longos. Como há isolamento fluídico entre os compartimentos, ele permite a estimulação seletiva ou o tratamento de um compartimento sem que os outros compartimentos sejam afetados. Acabamos de mostrar como preparar e manter os neurônios dos gânglios da raiz dosa no compartimento das culturas.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de pressionar suavemente ao selar o divisor de graxa na placa revestida de colágeno. Aspire o líquido da parte superior de cada compartimento lateral ao trocar o meio para não perturbar os axônios. Nunca troque a mídia diretamente do compartimento do meio ao alimentar os neurônios.

Troque apenas a mídia do surround e deixe-a fluir sobre a barreira de graxa para o compartimento do meio. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com os experimentos.