Name: Preparação e manutenção dos neurônios da raiz dorsal Gânglios em culturas Compartmented (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprenda a preparar e manter culturas compartimentalizadas de neurônios do gânglio da raiz dorsal usando embriões de rato E15. Este método permite estudar sinalização de neurotrofinas e crescimento axonal de forma controlada.

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Gostaríamos de agradecer a Katharina Cosker e Stephanie Courchesne para discussões úteis.

Preparação de reagentes <ol><li> Revestimento de colágeno: colágeno casaco p35 placas de cultura de tecidos e coloque em um forno a 37 ° C por 2 dias antes da lubrificação os divisores. A concentração final de colágeno deve ser a 0,71 mg / ml diluída em HCl 0,001 N. Em seguida, adicionar 1 ml da mistura por placa. </li><li> Carregadores de graxa: A fim de preencher o carregador de graxa, uma seringa de 60mL primeiro deve ser preenchido com Corning graxa de vácuo. Use a seringa para encher o carregador de graxa, envolvê-la em papel alumínio e depois autoclave por 45 minutos. </li><li> Teflon divisores: os divisores podem ser reutilizados depois de cada experiência, mas deve primeiro ser devidamente limpos. Remover o divisor da placa, limpe toda a graxa restante e coloque em ácido sulfúrico por 2 dias. Após a remoção do ácido, lavar com água ferver, 3X por 20 minutos, deixar secar, coloque em um prato de vidro petri p100 e autoclave por 20 minutos. </li><li> N2-metilcelulose: Pesar 1,5 g de metilcelulose e colocá-lo em uma garrafa de 500ml. Adicionar uma barra de agitação e autoclave por 20 minutos a seca (a partir deste ponto todo o trabalho deve ser estéril). Em seguida, adicione 500 ml de soro de mídia livre (N 2), e mexa em uma sala fria até que se dissolva. Alíquota em 50 conicals mL e congelar a -20 ° C. Para trabalhar ações alíquota, uma das 50 conicals mL em tubos de 1 ml e congelar a -20 ° C. </li><li> DRG mídia: DMEM, 5% soro de cavalo calor inativada, e 1% de estreptomicina penicilina. </li><li> 100ng/mL DRGN mídia: A concentração de ações de ambas fator de crescimento neural (NGF) e cérebro fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é 1mg/mL. Diluir cada uma das neurotrofinas 1:10.000 na mídia DRG. Culturas podem ser cultivadas em NGF sozinho, isso altera o complemento de neurônios que sobrevivem nas culturas. Nota: Quando necessário, a concentração de (citosina arabinosídeo) ARAC é 1um e usado em uma concentração final de 0.3uM. Isso vai inibir o crescimento de células de Schwann e células gliais outros. </li><li> 10ng/ml DRGN mídia: Diluir o 100ng/mL DRGN media (1:10) com a mídia DRG. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_27_6/951_Figure-01.png" alt="Figura 1" width="392" height="294"> Figura 1. Ferramentas necessárias para set-up </li></ol> Criação de câmaras compartimentada (iniciar este processo de 1-2 dias antes da dissecção) <ol><li> Faça um arranhão no meio de um prato de colágeno p35 revestido com um movimento para fora. </li><li> 30ul lugar de metilcelulose N2-on no meio do zero. Conjunto de pratos de lado até divisor é lubrificada. </li><li> Anexar um adaptador de 23-gauge esboço luer para o carregador de graxa. Divisor de aderência do Teflon com um par de 90 ° hemostats ângulo e coloque-o deitado, com o divisor para cima sob um microscópio. Traçar o divisor com graxa certificando-se que cada vez que o adaptador é colocado em um novo ponto de partida o adaptador é inserido na graxa da etapa anterior para que haja uma linha contínua de graxa (ver diagrama). Uma vez que a graxa é aplicada ao divisor inteiro, por sua vez um dos pratos preparados p35 de cabeça para baixo e colocá-lo de modo que o N2 metilcelulose é sobre o compartimento do meio. Pressione para baixo no fundo do prato com um par de pinças. Certifique-se de imprensa no interior do divisor em quatro cantos (superior esquerdo, inferior direito, superior direito, inferior esquerdo, indicado no diagrama por "X"). <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_2/951_Figure-02.png" alt="Figura 2" width="171" height="183"> Figura 2: Passos para lubrificar o divisor Nota: É importante pressionar firmemente o suficiente para que a graxa faz uma vedação completa com o prato, mas se muita pressão é adicionado, os axônios não vai cruzar os compartimentos laterais. Pegue o hemostats, vire-o e unclamp o divisor. Por último, coloque o prato com o divisor firmemente presa sob o microscópio com foco na parte inferior do compartimento do meio. Com o carregador de graxa, fazer uma pequena barreira (0,25 centímetros), de modo que uma vez que as células são colocadas no compartimento central não podem vazar. </li><li> Depois de ter criado várias culturas, a mídia local DRG em cada um dos compartimentos laterais e coloque em uma incubadora na qual as células serão mantidas. Permitir que as culturas para sentar-se por várias horas e depois verificar se há vazamento. Se a mídia vazou dentro do compartimento do meio, então a cultura é inutilizável. Nota: Ao primeiro aprender esta técnica, é importante a criação de culturas mais do que o necessário para uma experiência, como várias será furado. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_3/951_Figure-03.png" alt="Figura 3" width="254" height="191"> Figura 3: "Boa vs leaky" cultura </li></ol> Manutenção de neurônios DRG em culturas compartmented <ol><li> Dia 1: Substituir DRG media nos compartimentos laterais com 100ng/mL DRGN media + ARAC. Realizar dissecção e adicionar células para o compartimento central (100 mil células). </li><li> Dia 2: Adicionar 10ng/ml media + ARAC para o exterior do divisor de Teflon até que a mídia flui sobre a barreira de graxa e fluido intercâmbio com o compartimento central. </li><li> Dia 3: Substitua media nos compartimentos laterais para 100ng/mL DRGN omitindo a ARAC eo surround com 10ng/ml DRGN omitindo a ARAC. </li><li> Dia 6: Substitua media nos compartimentos laterais para 1ng/mL + ARAC eo surround com DRG media + ARAC. </li><li> Dia 9: Use para a experimentação. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_5/951_Figure-04.png" alt="Figura 4" width="267" height="148"> Figura 4: imagens IHC de corpos celulares e axônios distais Nota: Ao mudar a mídia, é importante para aspirar o líquido da parte superior do compartimento de cada lado. Além disso, nunca alterar a mídia a partir do compartimento central em si, apenas a partir do surround, e deixe fluir por cima da barreira de graxa no centro. </li></ol>

<ol><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+of+the+Local+Environment+of+Somas+and+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites.</a> Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+use+the+Erk5+pathway+to+mediate+a+retrograde+survival+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response.</a> Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).</li>
<li>Heerssen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+motors+transport+activated+Trks+to+promote+survival+of+target-dependent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons.</a> Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2006).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Ure, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).</li>
</ol>

Neste vídeo, demonstramos como se preparar e manter câmaras compartimentado para uso em neurônios DRG cultura. Feito corretamente, este sistema permite a separação do corpo celular do axônio para estudar mecanismos pelos quais neurotrofinas sinal através axônios longos. Uma vez que não é o isolamento fluídico entre os compartimentos, que permite a estimulação seletiva ou tratamento de um compartimento sem a outros compartimentos sendo afetados. Culturas câmara compartimentada pode suportar outros tipos de células, incluindo neurônios simpát...

<table><tbody><tr><td>colágeno</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>metilcelulose N2 400CPS</td><td>Reagente</td><td>Sel-Win Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>divisor de teflon</td><td>Outro</td><td>Tyler Research</td><td>CAMP10</td><td>muitos outros tipos de divisores estão disponíveis</td></tr><tr><td>rastelo de pinos</td><td>Ferramenta</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-PR</td><td></td></tr><tr><td>carregador de graxa</td><td>Ferramenta</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-GLSS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Reagente</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-01</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Reagente</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>graxa de alto vácuo</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>AraC</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1768</td><td></td></tr><tr><td>adaptador luer de 23 gauge</td><td>Ferramenta</td><td>Fisher Scientific</td><td>427565</td><td></td></tr><tr><td>hemostatos em ângulo de 90&amp;#x00B0;</td><td>Ferramenta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-7035</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação e manutenção dos neurônios da raiz dorsal gânglios em culturas compartmented

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurônios estender os processos axonal que estão longe do corpo celular para inervar tecidos-alvo, onde alvo derivado fatores de crescimento são necessários para a sobrevivência neuronal e na função. Neurotrofinas são especificamente necessárias para manter a sobrevivência e diferenciação de neurônios sensoriais que inervam mas a questão de como esses neurotrofinas-alvo derivado comunicar para o corpo celular dos neurônios que inervam tem sido uma área de pesquisa ativa por mais de 30 anos. O modelo mais comumente aceita de como sinais de neurotrofina chegar ao corpo celular propõe que a sinalização endossomos transportar este sinal retrogradamente ao longo do axônio. A fim de estudar o transporte retrógrado, um sistema de cultura foi originalmente concebido por Robert Campenot, em que os corpos celulares estão isolados de seus axônios. A técnica de preparação destas câmaras compartimentado para recapitula cultura sensorial neurônios a estimulação seletiva dos terminais dos neurônios que ocorre na liberação in vivo de seguir-alvo derivado neurotrofinas. Retrógrada eventos que requerem sinalização de longo alcance microtúbulos transporte retrógrado dependentes têm implicações importantes para o tratamento de doenças neurodegenerativas.

Aqui, descrevemos a técnica de preparação e manutenção de câmaras compartimentada para os neurônios sensoriais cultura do gânglio da raiz dorsal.

Preparação e manutenção dos neurônios da raiz dorsal Gânglios em culturas Compartmented

Os neurônios estendem prolongamentos axonais que se afastam consideravelmente do corpo celular para inervar tecidos-alvo, onde fatores de crescimento derivados do alvo são necessários para ...

Este procedimento começa com a realização de um arranhão no centro de uma placa revestida com colágeno, utilizando um rastelo de agulhas, e a pipetagem de 30 microlitros de metilcelulose no centro dos arranhões. Lubrifique cada divisor usando um aplicador de graxa e fixe-o em uma placa revestida com colágeno. Adicione 100.000 células de embriões de ratos E15 no compartimento central.Após nove dias, as células terão estendido axônios para o compartimento lateral e estarão prontas para experimentação. Olá, sou Maria Murphy do laboratório da Dra. Rosalyn Siegel, do Departamento de Oncologia Pediátrica do Instituto de Câncer Dana-Farber. Hoje mostraremos um procedimento para o preparo e manutenção de neurônios de gânglios da raiz dorsal em culturas compartimentadas.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a sinalização de neurotrofinas. Então, vamos começar. Antes de montar as câmaras compartimentadas, as placas de cultura de tecidos P 35 devem ser revestidas com colágeno.Para fazer isso, adicione um mililitro de uma solução de colágeno a 0,71 miligrama por mililitro em HCl 0,001 normal às placas e incube-as a 37 graus Celsius por dois dias. Após dois dias, faça um arranhão no centro das placas revestidas com colágeno usando um pente de agulhas. Utilize um movimento para fora.Em seguida, coloque 30 microlitros da N two Metilcelulose no centro do arranhão. Reserve as placas. A seguir, acople um adaptador de agulha de 23 gauge ao aplicador de graxa.Segure o divisor de teflon com um par de hemostatos em ângulo de 90 graus e coloque-o plano com o divisor voltado para cima sob um microscópio. Olhando através do microscópio, preencha o divisor com graxa. Certifique-se de que, cada vez que o adaptador for colocado em um novo ponto inicial, ele seja inserido na graxa do passo anterior, de modo que haja uma linha contínua de graxa.Após aplicar a graxa em todo o divisor, vire um dos pratos P 35 preparados de cabeça para baixo e posicione-o de modo que a N duas de Metilcelulose fique sobre o compartimento central. Pressione a parte inferior do prato com um par de pinças. Certifique-se de pressionar o interior do divisor em seus quatro cantos.É importante pressionar com força suficiente para que a graxa forme um selo completo com o recipiente. No entanto, se for aplicada pressão excessiva, os axônios não atravessarão para os compartimentos laterais. Em seguida, pegue os hemostatos.Coloque o recipiente de cabeça para baixo e solte o divisor. Em seguida, posicione o recipiente com o divisor firmemente fixado sob o microscópio, focalizando a parte inferior do compartimento central. Use o aplicador de graxa para fazer uma pequena barreira conectando ambos os lados do divisor, com cerca de um quarto de centímetro de altura.Esta etapa impedirá que as células vazejem assim que forem colocadas no compartimento central. Após preparar vários cultivos, adicione o meio de DRG a cada um dos compartimentos laterais. Em seguida, coloque no incubador, onde as células serão mantidas.Deixe as culturas em repouso por várias horas e depois verifique se há vazamento. Se o meio tiver vazado para o compartimento central, a cultura será imprópria para uso. Ao aprender esta técnica pela primeira vez, é importante preparar mais culturas do que as necessárias para um experimento, já que algumas provavelmente apresentarão vazamentos.Após confirmar que as câmaras compartimentadas estão utilizáveis, prossiga com a manutenção do cultivo de neurônios de gânglios da raiz dorsal. Antes da experimentação, os neurônios de GRD são mantidos em cultivos compartimentados. Durante um período de nove dias a 37 graus Celsius, no primeiro dia, substitua o meio de GRD nos compartimentos laterais por 100 nanogramas por mililitro.O meio DRGN mais o meio A-C-D-R-G-N contém fator de crescimento nervoso e fator neurotrófico derivado do cérebro. A receita para este meio está disponível em nosso protocolo escrito. Realize a dissecação em embriões de rato E 15 e adicione 100.000 células ao compartimento central.No segundo dia, adicione 10 nanogramas por mililitro de meio DRGN mais a C ao exterior do divisor de teflon até que o meio transborde a barreira de graxa e troque fluido com o compartimento central. No terceiro dia, substitua o meio nos compartimentos laterais por 100 nanogramas por mililitro de DRGN omitindo o a c.Também substitua o meio do entorno por 10 nanogramas por mililitro de DRGN, omitindo o RSC no sexto dia. Substitua o meio nos compartimentos laterais por um nanograma por mililitro de DRGN com RSC e o meio do entorno por meio DRG com RSC.No nono dia, o cultivo compartimentalizado está pronto para experimentação. Após a conclusão da experimentação, os divisores de teflon podem ser reutilizados, mas devem ser devidamente limpos. Para isso, remova o divisor da placa e limpe toda a graxa remanescente.Em seguida, coloque em ácido sulfúrico por dois dias. Após dois dias, retire as divisórias do ácido e lave-as com água três vezes, depois ferva por 20 minutos e deixe secar. Coloque as divisórias secas em uma placa de Petri de vidro P 100 e autocalefe por 20 minutos; após a esterilização, estarão prontas para experimentos futuros.Este sistema de cultura compartimentalizado permite a separação do corpo celular do axônio, a fim de estudar os mecanismos pelos quais as neurotrofinas sinalizam ao longo de axônios longos. Como há isolamento fluidico entre os compartimentos, é possível realizar estimulação ou tratamento seletivo de um compartimento sem afetar os demais. Acabamos de mostrar como preparar e manter neurônios de gânglios da raiz dorsal em culturas compartimentalizadas.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de pressionar suavemente ao selar o divisor de graxa à placa revestida com colágeno. Aspire o líquido do topo de cada compartimento lateral ao trocar o meio, de modo a não perturbar os axônios. Nunca troque o meio diretamente do compartimento central ao alimentar os neurônios.Altere apenas o meio do entorno e deixe-o fluir sobre a barreira de graxa para o compartimento central. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com os experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

Este vídeo demonstra um procedimento para isolar neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) de embriões de ratos e co-cultivá-los com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann maduras. Os DRGs isolados são processados para isolar neurônios e células gliais. As células isoladas são cultivadas para purificar os neurônios, que são então co-cultivados com células semelhantes a células de Schwann (SCLCs) em um meio de co-cultura. A interação com os neurônios DRG leva à maturação...

Isolamento de neurônios DRG e cocultura com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann

Este vídeo demonstra a construção de um sistema de cultura de células de três compartimentos usando colágeno e graxa não reativa. Este sistema é usado para observar as interações entre células de glioma e axônios em tempo real.

Preparação de placas de cultura compartimentadas revestidas de colágeno para cultura de células neuronais

Este vídeo demonstra um método para coletar neurônios dos gânglios da raiz dorsal (DRG). O DRG da coluna vertebral de um rato é isolado, tratado com enzimas e, em seguida, dissociado mecanicamente para obter uma suspensão unicelular. Os neurônios são separados das células gliais usando centrifugação com gradiente de densidade e cultivados em um meio de crescimento.

Uma técnica para colher e dissociar gânglios da raiz dorsal para culturas neuronais

Este vídeo demonstra o modelo de cocultura de um explante de gânglio da raiz dorsal e células de Schwann. Em condições de cocultura, o ácido ascórbico promove a diferenciação das células de Schwann em formas mielinizantes. As células mielinizantes de Schwann envolvem os axônios várias vezes para criar uma bainha de mielina, que é essencial para a função nervosa.

Co-cultura de um explante de gânglio da raiz dorsal com células de Schwann para mielinização de neurônios

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células dos gânglios da raiz dorsal (DRG) da coluna vertebral de ratos. Os DRGs excisados da coluna vertebral são tratados com enzimas e dissociados mecanicamente para obter uma suspensão unicelular. As células são cultivadas em um meio contendo inibidores e fatores de crescimento que limitam a proliferação de células gliais e promovem o crescimento neuronal, respectivamente.

Estabelecendo uma cultura de células de gânglios da raiz dorsal primária a partir de uma coluna vertebral de rato

Este protocolo descreve o isolamento de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) isolados de ratos e a cultura de neurônios DRG em um sistema estático de cultura de células pré-esticadas para melhorar o alinhamento dos axônios, com subsequente co-cultura de células de Schwann (SCs) para promover a mielinização.

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Culturas primárias do (DRG) os gânglios das raízes dorsais são frequentemente usadas para estudar as funções fisiológicas ou eventos relacionados à patologia em neurônios sensoriais. Aqui, vamos mostrar o uso de culturas DRG lombares para detectar a liberação de neurotransmissores, depois neuropeptídio FF receptor tipo 2 estimulação com um agonista seletivo.

Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores

Aqui apresentamos um sistema de cultura monocamada mista ex-vivo para o estudo da migração de células glioma humanas (hGC) em tempo real. Este modelo fornece a capacidade de observar interações entre hGCs e axônios mielinated e não-myelinated dentro de uma câmara compartimentada.

Monitoramento em tempo real da migração humana de células glioma em co-culturas de raiz dorsal Ganglion Axon-Oligodendrocyte

Este protocolo fornece uma técnica para colher e cultivar gânglio da raiz dorsal (DRG) explantado de ratos Sprague Dawley adultos em um dispositivo multicompartimental (MC).

Coleta, incorporação e cultura de gânglios da raiz dorsal em dispositivos multicompartimentais para estudar características neuronais periféricas

Este protocolo descreve métodos para estabelecer culturas de montagem inteira e dissociadas de gânglios da raiz dorsal de camundongos (DRG) e seu uso para avaliar as interações tumor-nervo.

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