Name: O Modelo de encefalopatia hipóxico isquêmica Perinatal da Isquemia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprenda a criar um modelo de encefalopatia hipóxico-isquêmica perinatal em ratos Sprague-Dawley usando microcirurgia e ligadura da artéria carótida comum esquerda. Este método permite estudar lesões cerebrais neonatais e avaliar áreas de infarto por coloração com TTC.

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Financiado pela American Heart Association e March of Dimes.

Este protocolo foi aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Universidade de Stanford e age de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para o uso de animais experimentais. Modelo de HIE neonatal Rat <ol><li> Dia pós natal (PND) 7 filhotes de ratos Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) estão totalmente anestesiados com isoflurano (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL; 3-4% para a indução e 1-2% para manutenção). </li><li> Uma pequena incisão é feita no pescoço (Extra Fino Tesoura Iris # 14088-10, Fine Ciência Tools Inc, Foster City, CA) para expor a artéria carótida comum esquerda (CCA). </li><li> O CCA é ligada com um fio de seda 5-0 (5-0 seda, Ethicon, Somer, NJ). </li><li> A incisão é fechada com cola de cianoacrilato (Elmers Products Inc, Columbus, OH). A incisão é coberta com fita adesiva e anestesia é interrompida. Os filhotes são devolvidos aos seus barragem e permitiu a recuperação de 1-2 horas. </li><li> Filhotes são então colocados em uma câmara hipóxica que contém oxigênio de 8% balanceada com nitrogênio 92% para 100 minutos a 37 ° C. 8% de gás nitrogênio oxygen/92% (Airgas, Sacramento, CA) do fluxo através de um tubo na gaiola do mouse equipado com uma cobertura de plástico. A capa é feita para se ajustar à gaiola e tem dois furos de 2 cm de diâmetro, um dos quais para receber o tubo ligado ao tanque de oxigênio de 8% do gás e outra permite que o gás flowout. A câmara é colocada em um banho de água e é aquecido antes do uso e um termômetro dentro dele deve registrar 37 ° C antes do início da hipóxia. </li><li> No final de 100 minutos de hipóxia, os filhotes são devolvidos de novo à sua barragem para a recuperação. </li><li> 24 horas após o fim da hipóxia, os filhotes são sacrificados por anestesia profunda com isoflurano. Tecido cerebral é perfundido com solução salina fria, seguido de uma solução de frio TTC 1% em tampão fosfato pH, solução salina 7,4 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO). TTC devem ser mantidos ao abrigo da luz. </li><li> Cérebros são removidos e resfriados por 1-2 minutos no gelo, e quatro cortes coronais 3 milímetros de distância (níveis 1-4) são cortados, começando rostralmente ao nível do opticchiasm e infundíbulo, correspondente ao bregma 1,8 ~ 2,0 mm de nível o cérebro do rato adulto. </li><li> Fatias de cérebro são imersos numa solução TTC e incubados a 37 ° C por 8 minutos, seguido de fixação em paraformaldeído a 4% / PBS durante a noite. TTC porque é sensível à luz, manter fatias longe da luz durante este tempo. </li><li> Os cortes corados TTC são escaneados e digitalizados. Usando Image J (NIH, Bethesda, MD), os seguintes são medidos para cada nível: área de infarto (área imaculada), a área do hemisfério ipsilateral, ea área do hemisfério contralateral. O percentual de infarto área por fatia é calculado como: (área de infarto / área do hemisfério ipsilateral) ou A 1, A 2, A 3 e A 4. Por cento do volume de infarto é calculada como a soma (A 1 + A 2 + A 3 + A 4) * 3mm. Áreas de lesão cortical ou estriado também pode ser quantificado separadamente de forma semelhante. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/old/955_2008_9_2_2/955_Fig-01.png" alt="Figura 1" width="660" height="190" /> Figura 1. HIE representativo níveis coronal 04/01 corados com TTC. TTC manchada secções coronal demonstram área de infarto (em branco).

<ol><li>Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+immaturity+on+hypoxic-ischemic+brain+damage+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat.</a> Annals of neurology. 9 (2), 131-141 (1981).</li>
<li>Vannucci, R. C., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+Hypoxic-Ischemic+Brain+Damage%3A+Evolution+of+an+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Perinatal Hypoxic-Ischemic Brain Damage: Evolution of an Animal Model.</a> Dev Neurosci. 27 (2-4), 81-86 (2005).</li>
<li>Bona, E., Hagberg, H., Loberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+moderate+hypothermia+after+neonatal+hypoxia-ischemia%3A+short-+and+long-term+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Protective effects of moderate hypothermia after neonatal hypoxia-ischemia: short- and long-term outcome.</a> Pediatric research. 43 (6), 738-738 (1998).</li>
<li>Trescher, W. H., Ishiwa, S., Johnston, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hypothermia+and+hyperthermia+on+attentional+and+spatial+learning+deficits+following+neonatal+hypoxia-ischemic+insult+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+brain+research%22%5BJournal%5D)">Effects of hypothermia and hyperthermia on attentional and spatial learning deficits following neonatal hypoxia-ischemic insult in rats.</a> Behavioural brain research. 151 (1-2), 209-209 (2004).</li>
<li>Mishima, K., Ikeda, T., Yoshikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+post-hypoxic-ischemic+hypothermia+markedly+delays+neonatal+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+development%22%5BJournal%5D)">Brief post-hypoxic-ischemic hypothermia markedly delays neonatal brain injury.</a> Brain development. 19 (5), 326-326 (1997).</li>
<li>Young, R. S., Olenginski, T. P., Yagel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+graded+hypothermia+on+hypoxic-ischemic+brain+damage%3A+a+neuropathologic+study+in+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">The effect of graded hypothermia on hypoxic-ischemic brain damage: a neuropathologic study in the neonatal rat.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 14 (6), 929-929 (1983).</li>
<li>Bederson, J. B., Pitts, L. H., Germano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+2%2C3%2C5-triphenyltetrazolium+chloride+as+a+stain+for+detection+and+quantification+of+experimental+cerebral+infarction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 17 (6), 1304-1304 (1986).</li>
<li>Cai, J., Kang, Z., Liu, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+therapy+reduces+apoptosis+in+neonatal+hypoxia-ischemia+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model.</a> Neuroscience letters. 441 (2), 167-167 (2008).</li>
<li>Grow, J., Barks, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+hypoxic-ischemic+cerebral+injury+in+the+term+infant%3A+current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+perinatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term infant: current concepts.</a> Clinics in perinatology. 29 (4), 585-585 (2002).</li>
<li>Aden, U., Halldner, L., Lagercrantz , H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggravated+brain+damage+after+hypoxic+ischemia+in+immature+adenosine+A2A+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Aggravated brain damage after hypoxic ischemia in immature adenosine A2A knockout mice.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 34 (3), 739-739 (2003).</li>
</ol>

O roedor modelo HIE pós-natal é um modelo estabelecido que recapitula hipóxia cerebral que ocorrem no período peri-natal em recém-nascidos. Extensos estudos de caracterização histológica e imunocitoquímica têm demonstrado que o roedor 7 dias de idade tem a maturidade do cérebro análogo ao modelo um terceiro trimestre 7 feto humano. O modelo HIE roedor foi muito informativo para a compreensão dos mecanismos da lesão cerebral de peri-natal hipóxia 2, onde as intervenções, tais como hipotermia foram validados 3.</sup...

<table><tbody><tr><td>Leitões de rato Sprague-Dawley</td><td>Animal</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Cirurgia</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8% Oxigênio / 92% Gás Nitrogênio</td><td>Cirurgia</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-trifenil tetrazolium cloreto</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

o modelo de encefalopatia hipóxico isquêmica perinatal da isquemia

The Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model of Perinatal Ischemia

Encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI) é a conseqüência de asfixia sistêmica que ocorre no nascimento. Vinte e cinco por cento dos recém-nascidos com EHI desenvolver seqüelas graves e permanentes neuropsicológicos, incluindo retardo mental, paralisia cerebral e epilepsia. Os resultados da HIE são devastadores e permanentes, tornando-se fundamental para identificar e desenvolver estratégias terapêuticas para reduzir a lesão cerebral em recém-nascidos com EHI. Para o efeito, o modelo de rato neonatal para hipóxico-isquêmica lesão cerebral foi desenvolvido para este modelo condição humana. O modelo HIE foi validado por Vannucci et al 1 e desde então tem sido amplamente utilizado para identificar mecanismos de lesão cerebral resultante da isquemia perinatal hypoxia-2 ​​e para testar potenciais intervenções terapêuticas 3,4. O modelo HIE é um processo em duas etapas e envolve a ligadura da artéria carótida comum esquerda, seguida da exposição a um ambiente hipóxico. Fluxo sangüíneo cerebral (CBF) no hemisfério ipsilateral à artéria carótida ligada não diminui por causa do fluxo sanguíneo colateral através do polígono de Willis, no entanto com a tensão mais baixa de oxigênio, a CBF no hemisfério ipsilateral diminui significativamente e resulta em lesão isquêmica unilateral . O uso de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) a mancha e identificar o tecido cerebral isquêmico foi originalmente desenvolvida para modelos adultos de isquemia cerebral de roedores 5, e é usado para avaliar a extensão da infarctin cerebral em momentos iniciais até 72 horas após o evento isquêmico 6. Neste vídeo, demonstramos o modelo de lesão hipóxico-isquêmica no cérebro de ratos pós-natal ea avaliação do tamanho do infarto usando coloração TTC.

O modelo de ratos pós-natal para hipóxico-isquêmica lesão cerebral é um modelo bem estabelecido de humanos encefalopatia hipóxico isquêmica neonatal (HIE). Neste artigo, descrevemos o modelo de HIE em filhotes de ratos pós-natal.

O Modelo de encefalopatia hipóxico isquêmica Perinatal da Isquemia

A Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica (EHI) é a consequência da asfixia sistêmica ocorrida no nascimento. Vinte e cinco por cento dos recém-nascidos com EHI desenvolvem quadros graves de ...

Para induzir este modelo de encefalopatia hipóxica-isquêmica pós-natal, filhotes de ratos Sprague Dawley no sétimo dia de vida são submetidos a microcirurgia e ligadura da artéria carótida comum esquerda. Após um período de recuperação de uma a duas horas, os filhotes são colocados em uma câmara hipóxica a 37 graus Celsius por 100 minutos.As crias são então devolvidas à mãe até serem eutanasiadas. Após duas etapas de perfusão sistêmica, os cérebros são removidos e seccionados em fatias com três milímetros de espessura. As fatias são então coradas com solução de 1% de 2,3,5-trifenil-tetrazólio cloreto, ou solução de TTC, para revelar a área de infarto.Olá, eu sou Hi tango do Andre Lab Lab do Departamento de Neurologia e Ciências Neurológicas da Escola de Medicina da Universidade de Stanford. Hoje vamos mostrar um procedimento para o modelo de lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o mecanismo da encefalopatia hipóxico-isquêmica no cérebro neonatal, com o objetivo final de desenvolver novos tratamentos.Então vamos começar. Para iniciar o procedimento, anestesie completamente uma ratazinha recém-nascida do sétimo dia pós-natal. Com isoflurano, utilizamos 4% para indução e de 1 a 2% para manutenção.Após alguns minutos, realize um teste de pressão no dedo do pé para garantir que o filhote está anestesiado. Em seguida, esterilize o pescoço do filhote utilizando aplicadores de algodão para aplicar iodo-povidona a 10%, seguido de álcool isopropílico a 70%. A seguir, use tesouras iris estéreis e extrafinas da Fine Science Tools para fazer uma pequena incisão cerca de cinco milímetros à esquerda da linha média, expondo a artéria carótida comum esquerda ou CCA por meio de dissecação romba.Certifique-se de remover o tecido conjuntivo e o nervo vago, que podem estar enredados na ACA. Em seguida, utilize um fio de seda cinco zero da Ethicon para ligar a ACA.A cor do vaso acima do local da ligadura deve ficar branca logo após a ligadura. Após a ligadura, feche a incisão com adesivo de cianoacrilato e cubra com fita. Em seguida, interrompa a anestesia e certifique-se de que o filhote recupere a consciência.Coloque a ninhada em uma caixa de recuperação sobre uma almofada aquecida. Repita o procedimento em ninhadas adicionais conforme necessário. Observe as ninhadas por pelo menos cinco minutos antes de devolvê-las à mãe.Deixe as ninhadas se recuperarem por uma a duas horas antes do experimento. Monte uma câmara hipóxica contendo 8% de oxigênio, equilibrada com 92% de nitrogênio. Para isso, obtenha uma gaiola para camundongos equipada com uma tampa de plástico que tenha dois orifícios de dois centímetros de diâmetro.Um orifício recebe o tubo conectado ao tanque de gás misto, que contém 8% de oxigênio e 92% de nitrogênio. O outro orifício permite a saída do gás; coloque a câmara em um banho-maria e, em seguida, insira um termômetro na câmara. O termômetro deve registrar 37 graus Celsius antes do início da hipóxia.Uma vez que as crias tenham se recuperado, coloque-as na câmara hipóxica por 100 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, devolva as crias à mãe 24 horas após o término da hipóxia e eutanase as crias por anestesia profunda com isoflurano. A seguir, realize perfusão intracardíaca pela veia ventricular esquerda utilizando solução salina normal fria, seguida por uma solução de 1% de TTC frio em P-B-S-T-T-C, que é sensível à luz e deve ser mantida protegida da luz.Após a etapa de perfusão, coloque a cabeça sobre gelo por um a dois minutos e, em seguida, exponha o cérebro utilizando uma lâmina de barbear resfriada com gelo para seccionar o tecido cerebral em quatro níveis. Use uma espátula para retirar as fatias cerebrais e mergulhe-as na solução de TTC.Coloque as fatias em uma incubadora a 37 graus Celsius por oito minutos para permitir a coloração com TTC. Em seguida, transfira as seções para paraformaldeído a 4% em PBS e cubra a seção. Como o TTC é sensível à luz, coloque as seções a quatro graus Celsius e deixe fixar durante a noite após a fixação prolongada.Analise e digitalize as secções coradas com TTC e prossiga com a análise dos resultados. Abaixo estão resultados representativos de encefalopatia hipóxico-isquêmica, nos níveis coronais um a quatro, corados com TTC. As áreas brancas não coradas indicam as áreas de infarto utilizando o ImageJ. Para cada nível, são medidos a área de infarto A e a área do hemisfério ipsilateral B. Com base nessas medições, a porcentagem da área infartada por corte é calculada como a área de infarto dividida pela área do hemisfério ipsilateral, ou seja, A um sobre B um, A dois sobre B dois, A três sobre B três e A quatro sobre B quatro.Então, o volume percentual de infarto é calculado como a soma de a 1, 2, 3 e quatro, multiplicado por três milímetros, dividido pela soma de B 1, 2, 3 e quatro multiplicado por três milímetros. As áreas de lesão cortical ou da substância alva subcortical (SAL) também podem ser quantificadas separadamente de maneira semelhante. Acabamos de mostrar como gerar um modelo de encefalopatia hipóxico-isquêmica de isquemia perinatal.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de limitar a anestesia a não mais de 10 minutos para cada ligadura da CCA, colocar sempre um termômetro na câmara hipóxica e manter a temperatura em 37 graus centígrados. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Modelos animais de grande porte têm bons valores de translação no exame de fisiologia e farmacologia da asfixia neonatal. Usando leitões recém-nascidos, desenvolvemos um protocolo experimental para simular a asfixia neonatal, que tem as vantagens de estudar a hemodinâmica sistêmica e regional, o transporte de oxigênio com vias bioquímicas e patológicas e correlações.

Um Modelo de Suínos de asfixia neonatal

O vídeo demonstra o procedimento para criar um modelo de camundongo para estudar a lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal. Ele descreve as etapas para induzir cirurgicamente a isquemia e submeter o animal à hipóxia para exacerbar o dano cerebral. Por fim, mostra como avaliar as lesões cerebrais resultantes, garantindo que o modelo de camundongo esteja preparado para uma investigação científica mais aprofundada.

Estabelecendo um modelo de camundongo de lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal

Fonte: Jantzie, L. L., et. al. Modelagem de encefalopatia da prematuridade usando hipóxia-isquemia pré-natal com lipopolissacarídeo intra-amniótico em ratos. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra um protocolo para induzir condições hipóxico-isquêmicas e inflamatórias em ratos fetais, restringindo o fluxo sanguíneo uterino e injetando LPS, modelando neuroinflamação e desenvolvimento cerebral interrompido relevante para estudos de parto prematuro.

Induzindo condições hipóxico-isquêmicas e inflamatórias para modelar encefalopatia em ratos pré-natais

A encefalopatia hipóxico-isquêmica após asfixia perinatal pode ser estudada usando modelos animais. Demonstramos os procedimentos necessários para estabelecer um modelo de leitão de encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal.

Um Modelo de Leitão Neonatal encefalopatia hipóxico-isquêmica

Os modelos de AVC tromboembólico são ferramentas vitais para otimizar a terapia de recanalização. Aqui relatamos um modelo de AVC trombótico murino baseado em insulto hipóxico-isquêmico cerebral transitório (tHI), que desencadeia trombose e infarto e responde favoravelmente à fibrinólise mediada pelo ativador de plasminogênio tecidual (tPA) em uma janela terapêutica semelhante à de pacientes com AVC.

Um Modelo de acidente vascular cerebral trombótico Baseado em Transient isquemia-hipoxia cerebral

A encefalopatia da prematuridade engloba as anormalidades do sistema nervoso central associadas à lesão do parto prematuro. Este relatório descreve um modelo de rato clinicamente relevante de hipóxia-isquemia sistêmica transitória in utero e administração intra-amniótica de lipopolissacarídeo (LPS) que imita a corioamnionite e o impacto relacionado de estímulos infecciosos e subperfusão placentária no desenvolvimento do SNC.

Modelagem Encefalopatia da Prematuridade Usando pré-natal hipóxia-isquemia com Lipopolysaccharide intra-amniótica em Ratos

O AVC neonatal é uma causa significativa de lesão cerebral precoce, exigindo um modelo translacional com padrões consistentes de lesão focal e alta reprodutibilidade para permitir o estudo. Este estudo descreve o procedimento cirúrgico detalhado para a criação de uma lesão de isquemia-reperfusão focal unilateral não hemorrágica em roedores equivalentes a termo.

Transiente Artéria Cerebral Média Oclusão Modelo de AVC neonatal em ratos P10

Realizamos a oclusão da artéria carótida unilateral no pós-Natal dia 7-10 CD-1 mouse filhotes para criar um modelo de (HI) hipóxico-isquêmica neonatal e investigaram os efeitos da lesão cerebral de HI. Nós estudamos funções Neurocomportamentais nestes ratos em comparação com camundongos normais não operado.

Neurocomportamentais avaliações em um modelo do rato de lesão cerebral hipóxica-isquêmica Neonatal

O método descreve inflamação sensibilizada hicóxico-isquêmica e lesão cerebral hiperoxica no furão P17 para modelar a interação complexa entre inflamação prolongada e lesão cerebral oxidativa experimentada em um número de bebês prematuros tardios.

Um modelo de furão de inflamação sensibilizada tardia preterm-isquêmica lesão cerebral

Este manuscrito descreve um método para gravações contínuas de EEG de vídeo usando eletrodos de profundidade múltiplos em camundongos neonatais submetidos à hipoxia-isquemia.

Eletroencefalograma de vídeo contínuo durante hipoxia-isquemia em camundongos neonatais

Aprenda a criar um modelo de encefalopatia hipóxico-isquêmica perinatal em ratos Sprague-Dawley usando microcirurgia e ligadura da artéria carótida comum esquerda. Este método permite estudar lesões cerebrais neonatais e avaliar áreas de infarto por coloração com TTC.

O Modelo de encefalopatia hipóxico isquêmica Perinatal da Isquemia

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