Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho
2 de fevereiro de 2009
Este vídeo demonstra toda montagem imuno-histoquímica, um método pelo qual o padrão de expressão espacial e temporal de um antígeno pode ser visualizada em embriões de galinha jovens. Este método foi originalmente introduzido por Jane Dodd e Tom Jessell.
Este vídeo demonstra os diferentes passos da imunohistoquímica em montagem inteira em embrião de galinha utilizando anticorpos secundários conjugados à HRP. Primeiro, o embrião é fixado em paraformaldeído. Em seguida, a atividade de peroxidase endógena é inibida.
O embrião é então incubado com anticorpo primário. Após várias lavagens, o embrião é incubado com anticorpo secundário conjugado à HRP; a reação colorimétrica é revelada utilizando o substrato DAB e a marcação com anticorpos aparece na cor laranja. A vantagem deste método em relação ao uso de anticorpos fluorescentes é que os embriões podem ser processados para inclusão em parafina, permitindo assim o estudo dos sítios antigênicos em corte transversal.
Olá, sou Delphine do Laboratório de FIN no Centro de Medicina Genômica e Ambiental da Texas A&M em Houston. Hoje vamos mostrar um procedimento para realizar imunomarcações com anticorpos, colorações em embriões de peixe-zebra utilizando anticorpos conjugados à HRP. Utilizamos este procedimento no laboratório para estudar a morfologia de embriões após tratamento com medicamentos antiepilépticos.
Então vamos começar. Para realizar imunohistoquímica em preparação inteira em embriões de galinha, primeiro abra um ovo batendo na casca com pinça e removendo pedaços da casca. Remova a albúmina espessa com pinça e incline o saco vitelino com pinça grossa para que o embrião fique voltado para cima.
Em seguida, use uma tesoura fina para cortar um quadrado da bolsa vitelínica ao redor do embrião. Remova o embrião do vitelo com uma colher e coloque-o em uma placa contendo PBS sob um microscópio de dissecação. Remova cuidadosamente as membranas do vitelo e transfira o embrião para uma placa nova contendo PBS.
Após transferir o embrião, prenda-o com pinças e alfinetes entomológicos e aspire o PBS. Substitua-o por PFA 4% em PBS e deixe o embrião fixar por uma hora à temperatura ambiente para minimizar a contaminação microbiana potencial. Use água desionizada D H2O em todos os passos seguintes após a fixação do embrião, aspire a solução fixadora e descarte-a adequadamente como resíduo químico.
Cubra a placa com BS. Em seguida, usando uma faca de microdissecção, corte um quadrado ao redor do embrião para remover as membranas extraembrionárias. Remova os alfinetes de inseto com pinça após os alfinetes terem sido retirados. Use uma pipeta Pasteur de ponta romba para transferir o embrião para um frasco de cintilação contendo PBT.
Lave o embrião com PBT três vezes, durante 10 minutos cada. Remova o PBT do frasco de cintilação e substitua por PBTX contendo 0,3% H₂O₂ para inativar a peroxidase endógena potencial. Incube por duas horas à temperatura ambiente em agitador.
Lave o embrião com PBT primeiramente três vezes por 10 minutos cada, depois três vezes por 30 minutos cada. Para corar o embrião com anticorpo. Comece lavando o embrião por uma hora em tampão bloqueador ou BSA 1% NGS 1%.
Utilizamos NGS porque o anticorpo secundário foi produzido em cabra. Incube no mutator por uma hora à temperatura ambiente; após a incubação, dilua o anticorpo primário na proporção de um para um em tampão bloqueador e incube o embrião nesta solução por dois dias a quatro graus Celsius. No mutator.
O fator de diluição do anticorpo primário depende da escolha do anticorpo primário. Aqui, utilizamos um anticorpo do banco híbrido de estudos de desenvolvimento DOMA, que é fornecido como super natin. Diluímos na proporção de um para um em tampão de bloqueio.
Em seguida, realize três lavagens de 10 minutos em PBT, seguidas por três lavagens de uma hora em PBT. Após as lavagens, dilua o anticorpo secundário na proporção de 1 para 2.500 em tampão bloqueador. Neste caso, use anticorpo secundário de cabra anti-IgG de US conjugado com peroxidase e incube o embrião nesta solução durante a noite a quatro graus Celsius em agitador.
Realize três lavagens de 10 minutos em PBT seguidas por três lavagens de uma hora em PBT para desenvolver a reação de cor do embrião corado. Primeiro, duas lavagens de 20 minutos em tampão tris 100 milimolar tris, HCL pH 7,4. Em seguida, remova a última lavagem de tampão TS do frasco contendo o embrião e substitua por cinco mililitros de solução DAB.
Mantenha-o no escuro no mutador por 20 minutos. Descarte a ponteira einor no balde contendo uma solução de hipoclorito a 10%. Para descontaminar o DAB, adicione 16 microlitros.
Adicione H2O2 estoque ao frasco contendo os embriões em DAB. Mantenha no escuro. Após 10 minutos, acompanhe a reação ao microscópio até que a reação de coloração esteja completa. Descarte o DAB no balde com água sanitária e substitua por cinco mililitros.
Água da torneira. Em seguida, realize duas lavagens de 10 minutos em PBS para processamento para fotografia e inclusão em parafina. Desidrate o embrião corado em uma série de etanol, 25%, 50%, 75% e 100%, durante 10 minutos cada.
Após a desidratação, substitua o etanol por 0,5 a um mililitro de óleo de cedro. Isso tornará o embrião translúcido, facilitando a fotografia em óleo de cedro. Após a fotografia, devolva o embrião ao frasco e substitua o óleo de cedro por etanol a 100%.
Por fim, substitua o etanol por verde rápido FCF a 5% em etanol a 100% e incube por três minutos. Este passo tornará os embriões visíveis para histologia. Substitua a solução de verde rápido FCF por etanol a 100% e prossiga com a histologia.
Aqui estão três exemplos de embriões corados. Esses embriões na fase 11 são marcados com 15,3 B nove ou não. Um anticorpo específico para cordão nodal desenvolvido no laboratório de Jane Dod e Tom Gessel.
Após dois minutos em DAB, o embrião ainda está transparente. Após 20 minutos em DAB, aparece uma leve marcação na corda nodal. Finalmente, após 40 minutos, a marcação da corda nodal está completa.
Neste exemplo, mostramos como o anticorpo PAC sete, desenvolvido no laboratório de Tom Jessel, reconhece estágios iniciais do fechamento do tubo neural, bem como as células da crista neural craniana emergindo do mesencéfalo. Aqui, o embrião é marcado com a sonda Croc 20 do laboratório de David Wilkinson, seguida não por um único anticorpo. Acabamos de mostrar como realizar imunohistoquímica em montagem inteira em embriões.
Este procedimento também pode ser utilizado em embriões que tenham sido previamente processados para hibridização in situ em montagem inteira. Nesse caso, fixe brevemente o embrião por uma hora após a hibridização in situ e, em seguida, prossiga com a coloração por anticorpos. Assim sendo, é isso.
Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra a imunohistoquímica em preparação total, uma técnica utilizada para visualizar os padrões espaciais e temporais de expressão de antígenos em embriões jovens de galinha. O método envolve várias etapas, incluindo fixação e incubação com anticorpos, para revelar os resultados da coloração.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Imunohistoquímica
Contexto
- A imuno-histoquímica em montagem inteira permite o estudo da distribuição de antígenos em embriões.
- Essa técnica foi originalmente introduzida por Jane Dodd e Tom Jessell.
- Ela fornece informações sobre processos de desenvolvimento e expressão gênica.
- Os anticorpos secundários conjugados à HRP realçam a visualização dos antígenos.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o procedimento de imunohistoquímica em montagem inteira.
- Visualizar a expressão de antígenos em embriões de galinha.
- Comparar as vantagens deste método em relação às técnicas com anticorpos fluorescentes.
Métodos Utilizados
- Fixação de embriões em paraformaldeído.
- Quenching da atividade de peroxidase endógena.
- Incubação com anticorpos primários e secundários.
- Reação corante revelada com substrato DAB para visualização.
Resultados Principais
- A coloração com anticorpos aparece laranja, indicando detecção bem-sucedida do antígeno.
- Os embriões podem ser processados para seccionamento em parafina após a coloração.
- Este método permite estudos em corte transversal dos sítios antigênicos.
- Demonstra a eficácia de anticorpos conjugados à HRP na coloração.
Conclusões
- A imuno-histoquímica em preparação inteira é uma técnica valiosa para o estudo de embriões de galinha.
- Ela fornece uma visualização clara dos padrões de expressão de antígenos.
- O método é vantajoso para análises histológicas subsequentes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imuno-histoquímica em preparações inteiras de embriões de galinha permite o mapeamento espacial da expressão de antígenos, auxiliando na validação de alvos em neurociência do desenvolvimento. O método oferece desvio mecanicista ao associar alvos moleculares a desfechos fenotípicos em um sistema relevante para doenças. A compatibilidade com o corte em parafina permite que equipes multifuncionais correlacionem dados imuno-histoquímicos com análises histológicas, melhorando a continuidade translacional na avaliação pré-clínica de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização da distribuição de antígenos no tubo neural e nos somitos em desenvolvimento.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio da observação direta do engajamento do alvo em embriões intactos.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no alvo ao fornecer dados espacialmente resolvidos de expressão para a identificação de compostos líderes.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão para ensaio: Gera padrões de coloração padronizados e reprodutíveis utilizando anticorpos secundários conjugados à HRP e substrato DAB.
- Saída quantitativa: Permite avaliação semi-quantitativa de sítios antigênicos por meio da intensidade da coloração, apoiando a otimização de ensaios.
- Reutilização da plataforma: Compatível com seccionamento em parafina, permitindo que a mesma amostra corada sirva a múltiplos fluxos analíticos subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para doenças: Aplicável ao estudo de efeitos embriotóxicos de compostos, como medicamentos antiepilépticos, em um modelo vertebrado.
- Continuidade translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao permitir o rastreamento consistente de antígenos em preparações inteiras e em cortes histológicos.
- Redução de riscos mecanicistas: Esclarece se os fenótipos observados estão correlacionados com a modulação do alvo em tecidos em desenvolvimento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico, apoiando as etapas iniciais de validação de alvo e desenvolvimento de ensaios antes da otimização de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses ao revelar a expressão antigênica espaço-temporal no cérebro em desenvolvimento e no tubo neural.
- Triagem: Fornece leituras padronizadas de imuno-histoquímica que apoiam a avaliação reprodutível de compostos em sistemas embrionários.
- Análises: Produz sinal cromogênico detectável por microscopia de campo claro, permitindo análise quantitativa de imagens para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores ao permitir que a localização antigênica seja validada tanto em preparações inteiras quanto em cortes histológicos.
- Reutilização Corporativa: Representa uma plataforma reutilizável com capacidade de histologia, aplicável em múltiplos projetos que estudam toxicidade do desenvolvimento ou expressão de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao associar a presença de antígenos a estruturas embrionárias específicas.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de etapas padronizadas de fixação, bloqueio e incubação com anticorpos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer confirmação histológica da modulação do alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em perfis de engajamento de alvos no desenvolvimento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de embriões, imunohistoquímica e detecção cromogênica.
- Depende do acesso a microscópios, mutadores e ventilação para o manuseio de DAB e H2O2.
- Necessita padronização dos protocolos de diluição de anticorpos e lavagem entre as equipes.
- A adaptação a outras espécies pode exigir otimização das etapas de permeabilização e bloqueio.
- As limitações práticas incluem tempos mais longos de incubação e a necessidade de descarte cuidadoso do DAB para prevenir artefatos.
