A técnica de coleta de líquido cefalorraquidiano Serial da Cisterna Magna em rato
10 de novembro de 2008
Modelos transgênicos (Tg) do mouse do AD uma excelente oportunidade para investigar como e por que níveis Aâ ou tau na mudança CSF como a doença progride em pacientes humanos. Aqui, nós demonstramos uma refinada técnica de punção da cisterna magna para amostragem CSF serial do mouse.
O procedimento começa com a anestesia do camundongo e a preparação do local da cirurgia. O rato é então colocado de bruços no instrumento estereotáxico. Uma incisão sagital da pele foi feita inferiormente ao occipital e o tecido subcutâneo e os músculos do pescoço através da linha média são separados sem corte.
Em seguida, a parte posterior do corpo é colocada de forma que o corpo forme um ângulo de 135 graus com a cabeça fixa, a dura-máter do esterno magna do CI é penetrada com o capilar de vidro e o LCR será coletado. Após a amostragem do LCR, os músculos são realinhados e a pele é suturada, cerca de um mililitro de solução salina NACL 0,9% é injetado por via subcutânea para evitar a desidratação e o camundongo é mantido aquecido até se recuperar. Olá, meu nome é Liu do laboratório da Dra. Karen Duff no The Top Institute da Columbia University.
Hoje vou mostrar como coletar fluido cefalorraquidiano do sistema mag do mouse. Com esta técnica, podemos coletar amostras seriadas de LCR por até três vezes do mesmo camundongo com intervalo de dois a três meses. Em nosso laboratório, usamos essa técnica para determinar os níveis de CSFA beta ou tau em diferentes idades de nossos modelos de camundongos transgênicos da doença de Alzheimer e correlacionamos esses valores com os do cérebro.
Ao final, estamos interessados no potencial dos níveis de CSFA beta ou tau como potenciais marcadores biológicos para a progressão da doença e também para os ensaios terapêuticos nos camundongos. Então vamos começar. Para este procedimento, é necessário fazer capilares com uma micropipeta polar.
Os capilares usados aqui são vidro de silicato BOA B 175 10 da Sutter Instruments puxe os capilares em uma micropipeta flamejante Sutter P 87 polar com o índice de calor definido em 300 e o índice de pressão definido em três 30. O capilar de vidro tem cinco centímetros de comprimento e uma ponta cônica. A ponta do capilar é aparada com uma tesoura de forma que seu diâmetro interno seja de cerca de 0,5 milímetros.
O procedimento cirúrgico começa com a anestesia do camundongo com cetamina 100 miligramas por quilograma e xilazina 10 miligramas por quilograma administrada por via intraperitoneal durante a anestesia, mantenha o camundongo aquecido em uma incubadora de 37 graus Celsius. Depois de determinar que o animal está totalmente anestesiado com um reflexo de retirada de pinça do dedo do pé, teste raspar o pescoço e, em seguida, coloque o mouse no instrumento estereotáxico, como este de David kink. Em contato direto com a almofada de aquecimento, insira uma sonda de temperatura retal para que o calor da almofada possa ser ajustado de acordo com a temperatura corporal do mouse.
Prenda a cabeça com os adaptadores de cabeça, limpe a pele do pescoço com iodopovidona a 10% e etanol a 70% três vezes e faça uma incisão sagital inferior à porção posterior da cabeça ou occipital. As próximas etapas devem ser realizadas sob um microscópio de dissecção usando pinça romba. Separe o tecido subcutâneo e os músculos M por serviços ventores e M reto abdominal dorsal maior para que a dura-máter do esterno magna fique exposta Use adequadamente um par de micro afastadores para manter os músculos separados.
Finalmente, deite o mouse com a cabeça em um ângulo de 135 graus em relação ao corpo. O mouse agora está pronto para a coleta de LCR. Essa técnica de coleta do LCR do esterno Magno foi publicada anteriormente.
C figura um A sob o microscópio de dissecação. A dura-máter aparece como um triângulo reverso brilhante e claro através do qual a medula oblonga e um vaso sanguíneo principal são visíveis. Artéria dural spinella C figura um B. A pulsação circulatória da medula e do espaço liquórico adjacente pode ser vista.
Seque a dura-máter com cotonete estéril, penetre o capilar no esterno magna do IC através da dura-máter lateral aos espinélios da artéria dorsal. Haverá uma mudança perceptível na resistência quando o capilar for inserido corretamente e o LCR fluirá para o capilar. Após a coleta do LCR, remova cuidadosamente o capilar e conecte-o com uma seringa de três mililitros usando um tubo de polietileno com diâmetro interno de um milímetro.
Injete o LCR em um tubo de 0,5 mililitro. Rotule o tubo e congele-o imediatamente em gelo seco. Depois de congelado, transfira o LCR para um freezer de 80 graus Celsius negativos.
A técnica de amostragem que acabamos de demonstrar é extremamente suave e permite que amostras subsequentes de LCR sejam retiradas do mesmo camundongo durante dois a três meses de intervalo. Assim, após a amostragem do pescoço, os músculos e a pele devem ser realinhados e fechados com suturas. Após a sutura da incisão, injete cerca de um mililitro de solução salina 0,9% NACL por via subcutânea para reidratar o camundongo.
Mantenha o mouse aquecido a cerca de 37 graus Celsius até que ele se recupere. Monitore seu peso no primeiro dia e no sétimo dia após a cirurgia. Acabei de mostrar como coletar líquido cefalorraquidiano do sistema mag do mouse.
Ao fazer este procedimento, há três coisas importantes a serem lembradas. Primeiro, posicione a cabeça e o corpo do mouse corretamente no quadro estereotáxico para que o ator do Cy Magna possa ser exposto o máximo possível. Em segundo lugar, evite cuidadosamente os vasos sanguíneos ao penetrar no durômetro com capilar.
Caso contrário, sua amostra será contaminada pelo sangue. Por último, mas não menos importante, lembre-se de manter seus camundongos aquecidos durante todo o procedimento para evitar hipotermia. A hipotermia não é apenas prejudicial aos seus camundongos, mas também pode afetar significativamente seus resultados, induzindo uma produção beta ou uma relação alta de hipofosforilação.
Ok, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma técnica aperfeiçoada para coleta seriada de líquido cefalorraquidiano (LCR) em modelos de camundongos transgênicos da doença de Alzheimer (DA). O método permite uma melhor compreensão das alterações nos níveis de Aβ ou tau no LCR à medida que a doença progride.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa sobre Doença de Alzheimer
- Modelos de Camundongos Transgênicos
Contexto
- Modelos de camundongos transgênicos são valiosos para o estudo da doença de Alzheimer.
- Os níveis de Aβ e tau no LCR são biomarcadores críticos para a progressão da DA.
- Compreender essas alterações pode orientar estratégias terapêuticas.
- Os métodos atuais de coleta de LCR podem necessitar refinamento para maior precisão.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar uma técnica aperfeiçoada para coleta de LCR em camundongos.
- Facilitar estudos longitudinais de biomarcadores de DA.
- Melhorar a confiabilidade da análise de LCR em modelos transgênicos.
Métodos Utilizados
- Anestesia do camundongo antes do procedimento.
- Preparação cirúrgica incluindo incisão da pele e separação muscular.
- Uso de uma micropipeta de vidro para penetrar a dura-máter e coletar o LCR.
- Cuidados pós-amostragem incluindo sutura e suporte de hidratação.
Resultados Principais
- A técnica aperfeiçoada permite a coleta eficaz de LCR.
- Maior precisão na medição dos níveis de Aβ e tau.
- Facilita amostragens repetidas para estudos longitudinais.
- Aprimora a compreensão da progressão da DA em modelos murinos.
Conclusões
- A técnica aperfeiçoada de punção é uma ferramenta valiosa para a pesquisa em DA.
- Ela permite um melhor monitoramento dos biomarcadores no LCR ao longo do tempo.
- Esse método pode levar a melhores entendimentos dos mecanismos da doença de Alzheimer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A coleta seriada de líquido cefalorraquidiano (LCR) da cisterna magna em modelos murinos permite o acompanhamento longitudinal de biomarcadores essencial para a pesquisa da doença de Alzheimer (DA). Esta técnica aperfeiçoada minimiza a variabilidade entre animais, favorecendo maior confiança preditiva em estudos translacionais de biomarcadores. A abordagem reforça a descoberta precoce e a tomada de decisões pré-clínicas ao permitir avaliações repetidas e quantitativas da dinâmica de Aβ e da proteína tau em sistemas relevantes para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos da doença por meio do acompanhamento das alterações do Aβ e da proteína tau no LCR ao longo do tempo em modelos transgênicos.
- Apoia a validação funcional de alvos ao correlacionar os níveis de biomarcadores no LCR com a patologia cerebral.
- Facilita a confiança preditiva na seleção de biomarcadores para estudos de progressão da DA.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece amostras de LCR validadas para ensaios quantitativos e ELISA posteriores.
- Melhora a reprodutibilidade dos ensaios ao permitir a coleta seriada do mesmo animal.
- Permite a avaliação confiável de intervenções terapêuticas sobre os perfis de biomarcadores no LCR.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha as alterações dos biomarcadores no LCR com a progressão da doença em modelos pré-clínicos de DA.
- Apoia a continuidade translacional ao permitir a comparação direta entre desfechos no LCR e no tecido cerebral.
- Reduz os riscos nas decisões de avanço baseadas em biomarcadores para candidatos terapêuticos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Essa técnica integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir coletas repetidas e minimamente invasivas de LCR para análise de biomarcadores em modelos murinos de neurodegeneração.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a dinâmica de biomarcadores e vias mecanicistas em modelos de DA.
- Triagem: Fornece amostras padronizadas e quantitativas de LCR para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Oferece conjuntos de dados longitudinais para comparação estatística de trajetórias de biomarcadores.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados pré-clínicos de biomarcadores com a interpretação de dados de LCR humano.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para coleta serial de LCR em diversos modelos de doenças neurodegenerativas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos baseados em biomarcadores e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Padroniza a coleta de LCR, melhora a reprodutibilidade e apoia estudos longitudinais escalonáveis.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper estudos de validação de biomarcadores e de intervenções terapêuticas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos para DA e terapias candidatas com base em dados robustos de biomarcadores.
Considerações de Implementação
- Requer experiência técnica em microcirurgia e manejo de animais.
- Necessita de acesso a instrumentos estereotáxicos, puxadores de microcapilares e plataformas de ELISA.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para garantir a integridade das amostras e a reprodutibilidade.
- Adaptável a diversos modelos de camundongos transgênicos, com atenção às particularidades anatômicas e procedimentais.
- A cuidadosa prevenção da contaminação sanguínea e a manutenção do bem-estar animal são fundamentais para resultados válidos.
