A técnica de coleta de líquido cefalorraquidiano Serial da Cisterna Magna em rato
10 de novembro de 2008
Modelos transgênicos (Tg) do mouse do AD uma excelente oportunidade para investigar como e por que níveis Aâ ou tau na mudança CSF como a doença progride em pacientes humanos. Aqui, nós demonstramos uma refinada técnica de punção da cisterna magna para amostragem CSF serial do mouse.
O procedimento começa com a anestesia do camundongo e o preparo do local cirúrgico. Em seguida, o camundongo é posicionado em decúbito ventral no aparelho estereotáxico. Uma incisão sagital da pele é feita abaixo do osso occipital e os tecidos subcutâneos e os músculos do pescoço são separados pela linha média por dissecação romba.
Em seguida, a parte posterior do corpo é posicionada de modo que o corpo forme um ângulo de 135 graus com a cabeça fixada, a dura-máter do forame magno é penetrada com a micropipeta de vidro e o LCR será coletado. Após a coleta do LCR, os músculos são reposicionados e a pele é suturada, sendo injetado cerca de um mililitro de solução salina 0,9% NaCl subcutaneamente para prevenir desidratação, e o camundongo é mantido aquecido até sua recuperação. Olá, meu nome é Liu, do laboratório da Dra. Karen Duff no The Top Institute da Universidade Columbia.
Hoje vou mostrar como coletar o líquido céfalo-raquidiano do espaço cisternal do camundongo. Com esta técnica, podemos coletar amostras seriadas de LCR até três vezes do mesmo camundongo, com intervalos de dois a três meses. Em nosso laboratório, utilizamos esta técnica para determinar os níveis de Aβ ou tau no LCR em diferentes idades de nossos modelos transgênicos de camundongo para a doença de Alzheimer, e correlacionamos esses valores com os do cérebro.
No final, estamos interessados no potencial dos níveis de beta ou tau da CSFA como marcadores biológicos potenciais para a progressão da doença e também para ensaios terapêuticos em camundongos. Então, vamos começar. Para este procedimento, é necessário preparar capilares com uma micropipeta polar.
Os capilares utilizados aqui são de vidro silicato BOA B 175 10 da Sutter Instruments; puxam-se os capilares em um micropipetador com chama Sutter P 87 com o índice de calor ajustado em 300 e o índice de pressão ajustado em três 30. O capilar de vidro tem cinco centímetros de comprimento e possui uma ponta afilada. A ponta do capilar é cortada com tesoura para que seu diâmetro interno seja de aproximadamente 0,5 milímetros.
O procedimento cirúrgico começa com a anestesia do camundongo utilizando quetamina a 100 miligramas por quilograma e xilazina a 10 miligramas por quilograma, administradas por via intraperitoneal. Durante a anestesia, mantenha o camundongo aquecido em um incubador a 37 graus Celsius. Após confirmar que o animal está completamente anestesiado por meio do reflexo de retirada do dedo, faça a depilação do pescoço e, em seguida, posicione o camundongo no aparelho estereotáxico, como este fabricado pela David Kink. Em contato direto com o tapete aquecedor, insira uma sonda de temperatura retal para que o calor do tapete possa ser ajustado de acordo com a temperatura corporal do camundongo.
Fixe a cabeça com os adaptadores para cabeça, limpe a pele do pescoço com iodo-povidona 10% e etanol 70% três vezes e faça uma incisão sagital abaixo da porção posterior da cabeça ou occipital. Os próximos passos devem ser realizados sob microscópio de dissecação utilizando pinças rombas. Separe o tecido subcutâneo e os músculos M por ventor services e M rectus capita dorsalis major de modo que a dura-máter do forame magno seja exposta. Utilize adequadamente um par de retratores microcirúrgicos para manter os músculos afastados.
Por fim, posicione o camundongo com a cabeça em um ângulo de 135 graus em relação ao corpo. O camundongo está agora pronto para a coleta de LCR. Essa técnica de coleta de LCR a partir do forame magno foi publicada anteriormente.
Figura C um A sob o microscópio de dissecação. A meninge aparece como um triângulo invertido brilhante e transparente, através do qual o bulbo raquidiano e um vaso sanguíneo importante são visíveis. Artéria dural espinhal C figura um B. Pode-se observar a pulsação circulatória do bulbo e do espaço adjacente de LCR.
Seque a dura-máter com um cotonete estéril, introduza a ponta capilar no forame ílio do esterno através da dura-máter, lateralmente à artéria dorsal espinhal. Haverá uma mudança nítida na resistência quando a ponta capilar for inserida corretamente, e o LCR fluirá então para o interior da ponta capilar. Após a coleta do LCR, remova cuidadosamente a ponta capilar e conecte-a a uma seringa de três mililitros utilizando um tubo de polietileno com diâmetro interno de um milímetro.
Injete o LCR em um tubo de 0,5 mililitro. Rotule o tubo e congele-o imediatamente em gelo seco. Após congelado, transfira o LCR para um congelador a menos 80 graus Celsius.
A técnica de coleta acabada de demonstrar é extremamente suave e permite que amostras subsequentes de LCR sejam obtidas do mesmo camundongo ao longo de um intervalo de dois a três meses. Assim, após a coleta, os músculos e a pele do pescoço devem ser realinhados e fechados com pontos. Após o fechamento da incisão com pontos, injete cerca de um mililitro de solução salina 0,9% NaCl subcutaneamente para reidratar o camundongo.
Mantenha o camundongo aquecido a aproximadamente 37 graus Celsius até que se recupere. Monitore seu peso no primeiro e no sétimo dia após a cirurgia. Acabei de mostrar como coletar líquido cefalorraquidiano do sistema mag do camundongo.
Ao realizar este procedimento, existem três pontos importantes a serem lembrados. Primeiro, posicione corretamente a cabeça e o corpo do camundongo no estereotáxico para que o ator do Cy Magna possa ser exposto ao máximo possível. Segundo, evite cuidadosamente os vasos sanguíneos ao penetrar o durômetro com a capilar.
Caso contrário, sua amostra será contaminada pelo sangue. Por último, mas não menos importante, lembre-se de manter seus camundongos aquecidos durante todo o procedimento para prevenir hipotermia. A hipotermia não é apenas prejudicial aos seus camundongos, mas também pode afetar significativamente seus resultados, induzindo uma produção de beta ou relação de hipofosforilação de tall.
Ok, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma técnica aperfeiçoada para coleta seriada de líquido cefalorraquidiano (LCR) em modelos de camundongos transgênicos da doença de Alzheimer (DA). O método permite uma melhor compreensão das alterações nos níveis de Aβ ou tau no LCR à medida que a doença progride.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa sobre Doença de Alzheimer
- Modelos de Camundongos Transgênicos
Contexto
- Modelos de camundongos transgênicos são valiosos para o estudo da doença de Alzheimer.
- Os níveis de Aβ e tau no LCR são biomarcadores críticos para a progressão da DA.
- Compreender essas alterações pode orientar estratégias terapêuticas.
- Os métodos atuais de coleta de LCR podem necessitar refinamento para maior precisão.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar uma técnica aperfeiçoada para coleta de LCR em camundongos.
- Facilitar estudos longitudinais de biomarcadores de DA.
- Melhorar a confiabilidade da análise de LCR em modelos transgênicos.
Métodos Utilizados
- Anestesia do camundongo antes do procedimento.
- Preparação cirúrgica incluindo incisão da pele e separação muscular.
- Uso de uma micropipeta de vidro para penetrar a dura-máter e coletar o LCR.
- Cuidados pós-amostragem incluindo sutura e suporte de hidratação.
Resultados Principais
- A técnica aperfeiçoada permite a coleta eficaz de LCR.
- Maior precisão na medição dos níveis de Aβ e tau.
- Facilita amostragens repetidas para estudos longitudinais.
- Aprimora a compreensão da progressão da DA em modelos murinos.
Conclusões
- A técnica aperfeiçoada de punção é uma ferramenta valiosa para a pesquisa em DA.
- Ela permite um melhor monitoramento dos biomarcadores no LCR ao longo do tempo.
- Esse método pode levar a melhores entendimentos dos mecanismos da doença de Alzheimer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A coleta seriada de líquido cefalorraquidiano (LCR) da cisterna magna em modelos murinos permite o acompanhamento longitudinal de biomarcadores essencial para a pesquisa da doença de Alzheimer (DA). Esta técnica aperfeiçoada minimiza a variabilidade entre animais, favorecendo maior confiança preditiva em estudos translacionais de biomarcadores. A abordagem reforça a descoberta precoce e a tomada de decisões pré-clínicas ao permitir avaliações repetidas e quantitativas da dinâmica de Aβ e da proteína tau em sistemas relevantes para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos da doença por meio do acompanhamento das alterações do Aβ e da proteína tau no LCR ao longo do tempo em modelos transgênicos.
- Apoia a validação funcional de alvos ao correlacionar os níveis de biomarcadores no LCR com a patologia cerebral.
- Facilita a confiança preditiva na seleção de biomarcadores para estudos de progressão da DA.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece amostras de LCR validadas para ensaios quantitativos e ELISA posteriores.
- Melhora a reprodutibilidade dos ensaios ao permitir a coleta seriada do mesmo animal.
- Permite a avaliação confiável de intervenções terapêuticas sobre os perfis de biomarcadores no LCR.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha as alterações dos biomarcadores no LCR com a progressão da doença em modelos pré-clínicos de DA.
- Apoia a continuidade translacional ao permitir a comparação direta entre desfechos no LCR e no tecido cerebral.
- Reduz os riscos nas decisões de avanço baseadas em biomarcadores para candidatos terapêuticos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Essa técnica integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir coletas repetidas e minimamente invasivas de LCR para análise de biomarcadores em modelos murinos de neurodegeneração.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a dinâmica de biomarcadores e vias mecanicistas em modelos de DA.
- Triagem: Fornece amostras padronizadas e quantitativas de LCR para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Oferece conjuntos de dados longitudinais para comparação estatística de trajetórias de biomarcadores.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados pré-clínicos de biomarcadores com a interpretação de dados de LCR humano.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para coleta serial de LCR em diversos modelos de doenças neurodegenerativas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos baseados em biomarcadores e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Padroniza a coleta de LCR, melhora a reprodutibilidade e apoia estudos longitudinais escalonáveis.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper estudos de validação de biomarcadores e de intervenções terapêuticas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos para DA e terapias candidatas com base em dados robustos de biomarcadores.
Considerações de Implementação
- Requer experiência técnica em microcirurgia e manejo de animais.
- Necessita de acesso a instrumentos estereotáxicos, puxadores de microcapilares e plataformas de ELISA.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para garantir a integridade das amostras e a reprodutibilidade.
- Adaptável a diversos modelos de camundongos transgênicos, com atenção às particularidades anatômicas e procedimentais.
- A cuidadosa prevenção da contaminação sanguínea e a manutenção do bem-estar animal são fundamentais para resultados válidos.
