Name: Protocolo para Neurônios Cultivar Sympathetic de Gânglios Superior Rat Cervical (SCG) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar neurônios simpáticos primários de gânglios cervicais superiores de filhotes de ratos recém-nascidos. Este protocolo utiliza tratamento enzimático e dissociação mecânica para obter suspensão celular única em placa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NZ gostaria de agradecer aos membros do laboratório Subhas Biswas, Andrew Sproul, e Ryan Willet para a formação dela em dissecar e colheita neurônios simpáticos. Suportada por concessões do NIH-NINDS.

1. Preparação para a dissecação: <ol><li> Selecione o prato de cultura apropriado (10 cm ou placas de seis poços ou 24 poços, etc), dependendo da natureza de suas experiências, e revesti-los com rat tail-colágeno 24 horas antes da dissecção. Os métodos para a preparação de rato-cauda de colágeno e usá-lo para placas de cultura de revestimento têm sido descritos em outra parte (1). </li><li> Prepare uma solução de tripsina 0,25% em tampão fosfato salino (PBS) (sem EDTA) e filtro de esterilizar. Prepare um alíquotas ml e armazenar a -20 º C. </li><li> Prepare uma solução contendo 2,5 mM de cada Uridina e 5-FDU em água destilada / deionizada H 2 O. Filtro de esterilizar e preparar 50 mL alíquotas. Armazenar a -20 º C. </li><li> Prepare Médio Completo: meio de cultura RPMI 1640 com inativado pelo calor de 10% soro de cavalo (calor inativar incubando em banho-maria 56 º C por 30 minutos) e 5% de soro fetal bovino. </li><li> Prepare Médio Final: meio de cultura RPMI 1640 com inativado pelo calor 1% soro de cavalo + NGF (100ηg/ml concentração final) + penicilina / estreptomicina (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU solução (10 mM de concentração final) . Nota: este meio deve ser composto fresco antes de usar o tempo todo. Para um experimento em um formato de placa de 24 cavidades, a pessoa precisa preparar 12 ml deste meio. É recomendado que você prepare um pouco mais. NGF pode ser comprado de uma variedade de fontes comerciais (ver tabela no final deste protocolo). </li><li> Equipamento: Um vai precisar de um microscópio de dissecação e fonte de luz. Um iluminador de fibra óptica dupla gooseneck com dicas foco é o preferido. Além disso, teremos de limpar e esterilizar (em autoclave ou imersão em etanol 70% por pelo menos 20 minutos) as ferramentas de dissecção seguinte: dois pares de micro-dissecção pinças de aço inoxidável, e um par de tesouras de dissecação (também de aço inoxidável e tanto do Roboz). Duas agulhas de seringa estéril (26 gague x 1 ½ polegadas ou similar) também será necessário. É necessário criar um quadro de dissecção, que é um pedaço 3 &quot;x3&quot; de isopor embrulhado em papel de alumínio e coberto com uma Kimwipe. Pulverizar a placa com álcool 70% para descontaminar. Finalmente, prepare um fogo-polido pipeta de vidro de pastagem. , A fim de-fogo polonês, tome a pipeta de vidro e manter a ponta na chama por alguns segundos, enquanto gira. Após a inspeção, a ponta ficará mais suave ea abertura será mais estreito. Isso é necessário para a etapa onde as células serão dissociados. Executar fogo polimento em uma capa de cultura de células para que permanece a pipeta estéril. </li></ol> 2. Dissecção da Gânglios Cervical Superior: <ol><li> Coletar filhotes de rato recém-nascidos que estão em idade de P0 ou P1. </li><li> Rapidamente limpar o filhote para dissecação com etanol 70% para reduzir as chances de contaminação. </li><li> Rapidamente decapitar filhote com uma tesoura afiada (este passo não será mostrado no vídeo). Segure a cabeça, usando uma pinça estéril contra gaze esterilizada brevemente drenar o excesso de sangue. </li><li> Colocar a cabeça na almofada dissecção com o lado ventral para cima ea extremidade caudal orientada para você. A traquéia cortada deve ser facilmente visível. Use as agulhas de seringa estéril para proteger a cabeça cortada para o bloco de dissecação da seguinte forma: empurre um pino que o céu da boca no teclado e empurre o segundo pino que a traquéia cortada no teclado. Coloque a almofada sob o microscópio de dissecação e começar a dissecção. </li><li> Utilizando ambas as pinças (uma em cada mão), pele clara distância e gordura ao redor da traquéia, tomando cuidado para não ir muito fundo. Fazendo isso irá expor um par de músculos praticamente paralelos entre si em ambos os lados da traquéia. Nota: durante a dissecção, você vai precisar para irrigar com o frio PBS estéril ou frio, isento de soro RPMI 1640, entregues com uma estéril, pipeta Pasteur para lavar o excesso de sangue e para manter a área limpa e úmida. Isso pode ser feito apenas uma vez ou mais de uma vez dependendo de quão rápido se trabalha. Para um dissector experiência, que leva apenas cerca de 2-3 minutos para dissecar um par de gânglios. </li><li> Use a pinça para cortar e remover o músculo de um lado primeiro. </li><li> Uma vez que o músculo é removido, a artéria carótida se tornará visível. Muitas vezes é a luz rosada e contém sangue. Pode parecer cor mais clara que outros vasos sanguíneos que você pode ver na vizinhança e por esta razão a artéria carótida pode não ser notado de imediato. Esta artéria corre ao lado da traquéia e bifurca-se em o que parece um &quot;Y&quot; em forma de fita. Esta bifurcação é um marco importante e uma vez que está localizado, será relativamente fácil encontrar a SCG. </li><li> Sever artéria no final mais caudal e levante-o ligeiramente com a pinça (do outro lado ainda está em anexo). Uma vez que você fizer isso, você vai ver uma forma de amêndoa, massa olhar brilhante pequena de tecido que é vagamente ligado à artéria apenas no ponto de bifurcação e que tem thread-como pré e / ou pós-ganglionares conectivos. Este é o gânglio cervical superior. Use um segundo par de pinças na outra mão para retirá-la com cuidado e coloque em um prato de cultura pequeno (35 mm) contendo frio, isento de soro RPMI 1640. </li><li> Em seguida, extrair o gânglio do outro lado da traquéia seguindo o mesmo protocolo. </li></ol> 3. A limpeza da Gânglios: <ol><li> Uma vez que todos os gânglios foram dissecados, eles devem ser libertados, tanto quanto possível de tecido estranho. </li><li> Sob o microscópio de dissecção, você pode ver que os gânglios ter anexado pedaços de artéria carótida, tecido adiposo ou outros. Trabalho com uma pinça em cada mão para arreliar fora esses materiais indesejados. Lugar limpo gânglios em um estéril 15ml cônicos, tubos de polipropileno, contendo meio RPMI 1640. </li><li> Conectivos pré e / ou pós-ganglionares também deve ser aparado. Cada gânglio tem cerca de 10 mil neurônios. Uma vez que os neurônios são banhados, eles vão regenerar suas neurites. </li></ol> 4. Estabelecer cultura Neuron simpática: <ol><li> Centrifugar os gânglios no 200xg por 2 minutos e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender os gânglios em 0,5 a 1 ml da solução de tripsina 0,25%. Coloque em uma 37 ˚ C banho-maria ou incubadora durante 30 minutos. Isso ajudará a dissociar as células nos gânglios. </li><li> Após 30 minutos, adicione 10 ml de meio completo para diluir-se e neutralizar os tripsina e centrifugar a 200xg por 2 minutos. </li><li> Elimine o sobrenadante e ressuspender em 2 ml de meio final. </li><li> Além disso dissociar as células por trituração dos gânglios cima e para baixo com o fogo-polido pipeta de vidro de pastagem. Triturar os gânglios 20 vezes e colocar o tubo no gelo por alguns minutos. </li><li> Enquanto isso, o fogo-polonês pipeta a mais para fazer a abertura mais estreita (cerca de 2 mm / 3 a 02/01 de diâmetro). Aguarde alguns minutos até que esfrie e triturar os gânglios 20 vezes mais. Como você continuar, o meio se tornará progressivamente cloudier indicando que as células estão a ser dissociados. Repita este passo uma ou duas vezes mais, dependendo de quão bem as células se dissociam. Depois de algum tempo, você vai notar que todos os gânglios têm o dissociada em neurônios e gânglios intactos não são visíveis no tubo. Pode haver algum material de tecido que não se dissociam. Neste ponto, vamos sentar o tubo no gelo por alguns minutos para que todos os detritos não dissociado pode se depositar no fundo. Agora, cuidadosamente, coletar quase todos do meio da parte superior e coloque em outro tubo. Para garantir que você não recolhem os detritos não dissociado, deixar cerca de 50 ul na parte inferior do tubo. Adicionar mais do meio para o final do tubo contendo células dissociadas: este volume depende do tipo de uma placa de cultura está usando para a cultura de neurônios. Por exemplo: se um prato de 24 é bem a ser empregado, então placa 0,5 gânglios por poço (~ 10 mil neurônios por poço) em 0,5 ml de meio de final por poço. Uma ninhada de ratos típico consiste de 12 filhotes, o que daria 24 gânglios. Isso é suficiente para uma placa de sementes de 24 poços eo volume total de meio final é de 12 ml. Nota: os gânglios também contêm uma pequena população de células gliais e outros tipos celulares que estarão presentes na cultura. Usando Uridine/5-FDU no médio final irá impedir a sua proliferação e promover a sua morte. </li><li> Células de alimentação a cada 48 horas, substituindo dois terços do meio RPMI fresco com 1% soro de cavalo + NGF e uridine/5-FDU. Nota: No início, a cultura contém neurônios simpáticos que olhar em volta sem neurites. Neurites curtos tornam visível 24 horas após a dissecção e progressivamente se tornam mais densos e mais ramificadas ao longo do tempo. </li></ol>

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. (1998).</li>
<li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li>
<li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nerve+Growth+Factor%3A+purification+as+a+30%2C000-molecular-weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li>
<li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chat+in+the+Trophic+Web%3A+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li>
<li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+%28NGF%29+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li>
<li>Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-dependent+kinases+participate+in+death+of+neurons+evoked+by+DNA-damaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents.</a> The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).</li>
<li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Nós usamos ratos Sprague Dawley de nossas culturas. Tire um tempo e cuidado ao limpar os gânglios. Remover todos os detritos, vasos sangüíneos e gordura. Este passo é importante para garantir uma cultura que é mais ou menos homogêneo e livre de tipos de células estranhas. A adição de uridine/5-FDU em grande parte eliminar qualquer resquício de células não-neuronais (mitose) contaminando a cultura ou, pelo menos, reprimir a sua proliferação. Além disso, durante a etapa de dissociação, ser paciente e ter tempo para separar os ...

<table><tbody><tr><td>Pinceta, aço inoxidável nº 5</td><td>Ferramenta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4976</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura, DEAVER reta com pontas finas e rombas - lâminas de 43 mm - 5,5</td><td>Ferramenta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6760</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 com L-Glutamina</td><td>Reagente</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Reagente</td><td>SAFC Global</td><td>12103c</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo doador</td><td>Reagente</td><td>JRH Biosciences</td><td>12449</td><td>Inativar pelo calor incubando em banho-maria a 56&amp;#x00B0;C por 30 minutos.</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina sem EDTA</td><td>Reagente</td><td>Difco Laboratories</td><td>MT 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-5&amp;rsquo; deoxiuridina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8791</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Reagente</td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação e fonte de luz</td><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de 15 ml</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura celular</td><td>Ferramenta</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para neurônios cultivar sympathetic de gânglios superior rat cervical (scg)

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

Os gânglios cervical superior (GCS) de ratos são pequenos, brilhantes, em forma de amêndoa estruturas que contêm neurônios simpáticos. Esses neurônios fornecem inervação simpática para a cabeça e pescoço e constituem uma população bem caracterizados e relativamente homogêneo (4). Neurônios simpáticos são dependentes de fator de crescimento neural (NGF) para a diferenciação, sobrevivência e crescimento axonal ea propagação de grande disponibilidade de NGF facilita sua cultura e manipulação experimental (2, 3, 6). Por estas razões, cultivadas neurônios simpáticos têm sido utilizadas em uma ampla variedade de estudos, incluindo o desenvolvimento neuronal e diferenciação, os mecanismos de morte celular programada e patológicos, e transdução de sinal (1, 2, 5 e 6). Dissecando o SCG de ratos recém-nascidos e neurônios simpáticos cultura não é muito complicado e pode ser dominada com bastante rapidez. Neste artigo, iremos descrever em detalhes como dissecar o SCG de filhotes de rato recém-nascido e para usá-los para estabelecer culturas de neurônios simpáticos. O artigo também descreve as etapas preparatórias e os vários reagentes e equipamentos que são necessários para alcançar este objectivo.

Este é um protocolo que descreve como isolar e cultura primária de neurônios simpáticos gânglios cervical superior (GCS) de filhotes de rato recém-nascido.

Protocolo para Neurônios Cultivar Sympathetic de Gânglios Superior Rat Cervical (SCG)

Os gânglios cervicais superiores (GCS) em ratos são estruturas pequenas, brilhantes e em forma de amêndoa que contêm neurônios simpáticos. Esses neurônios fornecem...

Este procedimento começa com o isolamento dos gânglios simpáticos cervicais superiores de ratos neonatos no dia pós-natal zero. Cada cérebro possui dois gânglios simpáticos cervicais superiores. Aproximadamente 24 gânglios podem ser obtidos de uma única ninhada de filhotes de rato.A dissociação dos gânglios começa com mergulhos e tratamento por 30 minutos. A dissociação adicional é realizada por meio de repiques repetidos com uma pipeta de vidro polida ao fogo, resultando em uma suspensão de células isoladas. Os neurônios simpáticos são então semeados em placas revestidas com colágeno ENC.Olá, sou Nila Zurin do laboratório do Dr. Lloyd Green, do Departamento de Patologia e Biologia Celular da Universidade Columbia. Hoje demonstraremos como isolar e cultivar neurônios simpáticos primários dos gânglios cervicais superiores de filhotes vermelhos recém-nascidos. Em nosso laboratório, geralmente utilizamos essas células para estudar apoptose em resposta à retirada do fator de crescimento nervoso.Então vamos começar. Iniciamos o procedimento revestindo uma placa de cultura com colágeno de cauda de rato 24 horas antes de realizar a dissecação. Dependendo da natureza do experimento, utiliza-se uma placa de cultura de 24 ou 48 poços.A seguir, serão preparadas as mídias e equipamentos das soluções. Esses materiais e reagentes podem ser encontrados no protocolo descrito no texto que acompanha este vídeo. É importante observar que a solução de uridina e cinco FDU deve ser preparada imediatamente antes do uso.Continue o preparo com o fogo. Polir as pipetas de vidro para os passos de titulação. A ponta da pipeta de vidro é mantida na chama por alguns segundos enquanto gira, para afinar e suavizar.O polimento inicial com chama deve ser realizado em uma cabine de cultura celular estéril. Para iniciar a dissecação, colete filhotes de ratos neonatos de P zero a P um. Um filhote de rato neonato é rapidamente limpo com etanol 70% para reduzir a contaminação.Após a decapitação, a cabeça é colocada sobre a placa de dissecação com o lado ventral voltado para cima e a extremidade caudal orientada em sua direção. A traqueia seccionada deve estar prontamente visível. Agulhas estéreis de seringa são utilizadas para fixar a cabeça seccionada à placa de dissecação da seguinte maneira.Insira um alfinete através do palato em direção ao suporte e o segundo alfinete através da medula espinhal seccionada em direção ao suporte. Após mover a bandeja de dissecação para debaixo do microscópio e olhar através das oculares, use dois pares de pinças para remover a pele e a gordura ao redor da traqueia. Tendo o cuidado de não ir muito fundo, um par de músculos que correm quase paralelos um ao outro será exposto em ambos os lados da traqueia.Durante a dissecação, será necessário irrigar com PBS estéril frio ou meio RPMI 1640 sem soro e frio, administrado com uma pipeta Pasteur estéril, para remover o excesso de sangue. Isso pode ser feito uma vez ou mais de uma vez, dependendo da velocidade do trabalho. Em seguida, utiliza-se a pinça para cortar e remover o músculo de um dos lados primeiro.Uma vez removido o músculo, a artéria carótida ficará visível. Esta artéria corre ao lado da traqueia e se bifurca em uma estrutura semelhante a uma fita em formato de Y. Essa bifurcação é um marco anatômico importante e, uma vez localizada, será relativamente fácil encontrar os gânglios cervicais superiores.A artéria é seccionada na extremidade mais próxima do corpo e levantada levemente com a pinça. A outra extremidade da artéria permanece presa. Uma vez feito isso, o gânglio cervical superior tornar-se-á visível.Deve-se observar que se trata de uma pequena massa de tecido com formato de amêndoa e aparência brilhante, presa frouxamente à artéria no ponto de bifurcação, e que possui conectivos pré e/ou pós-ganglionares semelhantes a fios. Um segundo par de pinças é utilizado para remover suavemente o gânglio cervical superior e colocá-lo em uma pequena placa de cultura de 35 milímetros contendo meio RPMI 1640 sem soro e frio. Em seguida, o gânglio é extraído do outro lado da traqueia seguindo o mesmo protocolo.Após todos os gânglios terem sido dissecados, eles são liberados, tanto quanto possível, de tecidos estranhos. Observando pelo microscópio, pode-se notar que os gânglios possuem fragmentos aderidos de gordura da artéria carótida ou de outros tecidos; pinças são usadas para remover esses materiais indesejados. Os conectivos pré e/ou pós-ganglionares também são aparados.Cada gânglio possui cerca de 10.000 neurônios. Uma vez que os neurônios são semeados, eles regenerarão seus neuritos. Os gânglios são então colocados em um tubo cônico estéril de polipropileno de 15 mililitros contendo meio RPMI 1640.Em seguida, estabelece-se o cultivo de neurônios simpáticos. Os gânglios são centrifugados a 200 ×g por dois minutos e o sobrenadante é descartado. Os gânglios são ressuspendidos em 0,5 a um mililitro de solução de tripsina 0,25% e, em seguida, colocados em banho-maria ou incubadora a 37 °C por 30 minutos para ajudar na dissociação das células nos gânglios.Após 30 minutos, adicionam-se 10 mililitros de meio completo para diluir e neutralizar a tripsina. Em seguida, as soluções são centrifugadas a 200 ×g durante dois minutos. O sobrenadante é então descartado e os gânglios são ressuspendidos em dois mililitros de meio final.Usando uma das pontas de pipeta previamente preparadas e polidas ao fogo com abertura ampla, as células são ainda dissociadas por aspirar e dispensar os gânglios para cima e para baixo 20 vezes. O tubo é então colocado no gelo por alguns minutos. Em seguida, a ponta da pipeta é novamente polida ao fogo para tornar a abertura ainda mais estreita.Após o resfriamento da pipeta, os gânglios são triturados mais 20 vezes. O meio ficará progressivamente mais turvo, indicando que as células estão sendo dissociadas. Este passo é repetido mais uma ou duas vezes, dependendo do grau de dissociação das células.Após algum tempo, os gânglios estarão dissociados em neurônios e não serão visíveis gânglios intactos no tubo. Pode haver algum material tecidual que neste momento não se dissocie. O tubo é deixado em repouso sobre gelo por alguns minutos para que qualquer detrito não associado possa sedimentar no fundo.Coleta-se cuidadosamente todo o sobrenatante, exceto cerca de 50 microlitros, e transfere-se para outro tubo. Deixam-se 50 microlitros no fundo do tubo para evitar a transferência de detritos não associados. Adiciona-se mais meio final ao tubo contendo as células dissociadas.O volume do meio final adicionado depende do tipo de placa de cultura que se está utilizando para cultivar os neurônios. Por exemplo, se uma placa de 24 poços for utilizada, então plaque um gânglio por poço em 0,5 mililitros de meio final por poço.Uma ninhada típica de ratos consiste em 12 filhotes, o que resultaria em 24 gânglios. Isso é suficiente para semear uma placa de 24 poços, e o volume total do meio final é de 12 mililitros. O uso de uridina cinco FDU no meio final impedirá a proliferação e promoverá a morte de uma pequena população de gliócitos e outros tipos celulares.Presente na cultura, as células são alimentadas a cada 48 horas, substituindo dois terços do meio. Com RPMI fresco mais 1% de soro de cavalo mais NGF e uridina e cinco FDU. Inicialmente, a cultura contém neurônios simpáticos que parecem redondos, sem neurônios.Neurônios curtos tornam-se visíveis 24 horas após a dissecação e progridem gradualmente em densidade e ramificação ao longo do tempo. Acabamos de mostrar como isolar e cultivar neurônios simpáticos primários dos gânglios cervicais superiores de ratos recém-nascidos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de: primeiro, dedicar tempo e cuidado para limpar os gânglios, removendo todos os detritos, vasos sanguíneos e gordura.Esta etapa é importante para garantir uma cultura mais ou menos homogênea e livre de tipos celulares estranhos. Em segundo lugar, durante a etapa de dissociação, seja paciente e dedique tempo a separar os neurônios para que não sejam encontrados em grandes aglomerados. Uma vez assentados nas placas, grandes aglomerados tornarão o processo difícil.Em aplicações posteriores, como seccionar ou infectar os neurônios, a imunomarcação também pode ser prejudicada, e quaisquer experimentos que exijam a contagem dos neurônios serão difíceis de realizar. Por fim, não é necessário suplementar o meio com penicilina-estreptomicina. Toda vez que as culturas são alimentadas, a adição de penicilina-estreptomicina é necessária apenas na primeira vez em que as células são semeadas.Adicione uridina cinco FDU fresca ao meio toda vez que o meio for trocado. Nosso laboratório utilizou culturas neuronais simpáticas para estudar apoptose em resposta à retirada do fator de crescimento nervoso. É isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

protocol-for-culturing-sympathetic-neurons-from-rat-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós descrevemos um protocolo para a utilização de proteína morfogenética óssea-7 (BMP-7) ou Matrigel para selectivamente induzir o crescimento dendrítica em primárias neurónios simpáticos dissociadas do gânglio cervical superior (SCG) de ratos neonatais.

Induzir o crescimento dendrítico no cultivadas neurônios simpáticos

O protocolo descreve um sistema de modelo eficiente e reprodutível para estudar vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) a latência e reactivação. O ensaio emprega homogéneos culturas de neurónios simpáticos e permite a dissecção molecular do vírus de neurónios-interacções usando uma variedade de ferramentas, incluindo a interferência de RNA e de expressão de proteínas recombinantes.

Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação

Este vídeo demonstra um procedimento para isolar neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) de embriões de ratos e co-cultivá-los com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann maduras. Os DRGs isolados são processados para isolar neurônios e células gliais. As células isoladas são cultivadas para purificar os neurônios, que são então co-cultivados com células semelhantes a células de Schwann (SCLCs) em um meio de co-cultura. A interação com os neurônios DRG leva à maturação...

Isolamento de neurônios DRG e cocultura com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann

Este vídeo descreve o isolamento e a cultura de células de Schwann das raízes espinhais de camundongos. As células isoladas são então cultivadas em meios específicos. As células de Schwann são isoladas por digestão diferencial e aderência. Eles são posteriormente transferidos para lamínulas revestidas com matriz extracelular para fixação e proliferação.

Isolamento de células de Schwann de raízes espinhais de camundongos

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células dos gânglios da raiz dorsal (DRG) da coluna vertebral de ratos. Os DRGs excisados da coluna vertebral são tratados com enzimas e dissociados mecanicamente para obter uma suspensão unicelular. As células são cultivadas em um meio contendo inibidores e fatores de crescimento que limitam a proliferação de células gliais e promovem o crescimento neuronal, respectivamente.

Estabelecendo uma cultura de células de gânglios da raiz dorsal primária a partir de uma coluna vertebral de rato

Aqui descrevemos uma célula de Schwann (SC) ensaio de migração em que SCs são capazes de desenvolver ao longo dos axônios estendem.

Analisando o desenvolvimento de células de Schwann Murino Junto axônios em crescimento

Este protocolo descreve o isolamento de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) isolados de ratos e a cultura de neurônios DRG em um sistema estático de cultura de células pré-esticadas para melhorar o alinhamento dos axônios, com subsequente co-cultura de células de Schwann (SCs) para promover a mielinização.

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Culturas primárias do (DRG) os gânglios das raízes dorsais são frequentemente usadas para estudar as funções fisiológicas ou eventos relacionados à patologia em neurônios sensoriais. Aqui, vamos mostrar o uso de culturas DRG lombares para detectar a liberação de neurotransmissores, depois neuropeptídio FF receptor tipo 2 estimulação com um agonista seletivo.

Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores

Este artigo descreve o isolamento e a culminação de neurônios simpáticos de ratos embrionários da gânglio cervical superior. Também fornece protocolos detalhados para coloração imunocitoquímica e para preparação de extratos neuronais para análise espectrométrica em massa.

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

As gânglios ciliares filhotes (CG) fazem parte do sistema nervoso parassimpático. Culturas neuronais de neurônios CG foram mostrados como modelos celulares eficazes no estudo das interações musculares nervosas. Descrevemos um protocolo detalhado para a dissecação, dissociação e cultura in vitro de neurônios CG de embriões de filhotes.

Isolamento e Cultura de Chick Ciliary Ganglion Neurons

O presente protocolo descreve um modelo murino de ablação de inervação adrenérgica através da identificação e ressecção do gânglio cervical superior.

Técnica cirúrgica para ganglionectomia cervical superior em modelo murino

Aprenda a isolar e cultivar neurônios simpáticos primários de gânglios cervicais superiores de filhotes de ratos recém-nascidos. Este protocolo utiliza tratamento enzimático e dissociação mecânica para obter suspensão celular única em placa.

Protocolo para Neurônios Cultivar Sympathetic de Gânglios Superior Rat Cervical (SCG)

Explorar mais vídeos