Protocolo para Neurônios Cultivar Sympathetic de Gânglios Superior Rat Cervical (SCG)

Este procedimento começa com o isolamento dos gânglios simpáticos cervicais superiores de ratos neonatos no dia pós-natal zero. Cada cérebro possui dois gânglios simpáticos cervicais superiores. Aproximadamente 24 gânglios podem ser obtidos de uma única ninhada de filhotes de rato.

A dissociação dos gânglios começa com mergulhos e tratamento por 30 minutos. A dissociação adicional é realizada por meio de repiques repetidos com uma pipeta de vidro polida ao fogo, resultando em uma suspensão de células isoladas. Os neurônios simpáticos são então semeados em placas revestidas com colágeno ENC.

Olá, sou Nila Zurin do laboratório do Dr. Lloyd Green, do Departamento de Patologia e Biologia Celular da Universidade Columbia. Hoje demonstraremos como isolar e cultivar neurônios simpáticos primários dos gânglios cervicais superiores de filhotes vermelhos recém-nascidos. Em nosso laboratório, geralmente utilizamos essas células para estudar apoptose em resposta à retirada do fator de crescimento nervoso.

Então vamos começar. Iniciamos o procedimento revestindo uma placa de cultura com colágeno de cauda de rato 24 horas antes de realizar a dissecação. Dependendo da natureza do experimento, utiliza-se uma placa de cultura de 24 ou 48 poços.

A seguir, serão preparadas as mídias e equipamentos das soluções. Esses materiais e reagentes podem ser encontrados no protocolo descrito no texto que acompanha este vídeo. É importante observar que a solução de uridina e cinco FDU deve ser preparada imediatamente antes do uso.

Continue o preparo com o fogo. Polir as pipetas de vidro para os passos de titulação. A ponta da pipeta de vidro é mantida na chama por alguns segundos enquanto gira, para afinar e suavizar.

O polimento inicial com chama deve ser realizado em uma cabine de cultura celular estéril. Para iniciar a dissecação, colete filhotes de ratos neonatos de P zero a P um. Um filhote de rato neonato é rapidamente limpo com etanol 70% para reduzir a contaminação.

Após a decapitação, a cabeça é colocada sobre a placa de dissecação com o lado ventral voltado para cima e a extremidade caudal orientada em sua direção. A traqueia seccionada deve estar prontamente visível. Agulhas estéreis de seringa são utilizadas para fixar a cabeça seccionada à placa de dissecação da seguinte maneira.

Insira um alfinete através do palato em direção ao suporte e o segundo alfinete através da medula espinhal seccionada em direção ao suporte. Após mover a bandeja de dissecação para debaixo do microscópio e olhar através das oculares, use dois pares de pinças para remover a pele e a gordura ao redor da traqueia. Tendo o cuidado de não ir muito fundo, um par de músculos que correm quase paralelos um ao outro será exposto em ambos os lados da traqueia.

Durante a dissecação, será necessário irrigar com PBS estéril frio ou meio RPMI 1640 sem soro e frio, administrado com uma pipeta Pasteur estéril, para remover o excesso de sangue. Isso pode ser feito uma vez ou mais de uma vez, dependendo da velocidade do trabalho. Em seguida, utiliza-se a pinça para cortar e remover o músculo de um dos lados primeiro.

Uma vez removido o músculo, a artéria carótida ficará visível. Esta artéria corre ao lado da traqueia e se bifurca em uma estrutura semelhante a uma fita em formato de Y. Essa bifurcação é um marco anatômico importante e, uma vez localizada, será relativamente fácil encontrar os gânglios cervicais superiores.

A artéria é seccionada na extremidade mais próxima do corpo e levantada levemente com a pinça. A outra extremidade da artéria permanece presa. Uma vez feito isso, o gânglio cervical superior tornar-se-á visível.

Deve-se observar que se trata de uma pequena massa de tecido com formato de amêndoa e aparência brilhante, presa frouxamente à artéria no ponto de bifurcação, e que possui conectivos pré e/ou pós-ganglionares semelhantes a fios. Um segundo par de pinças é utilizado para remover suavemente o gânglio cervical superior e colocá-lo em uma pequena placa de cultura de 35 milímetros contendo meio RPMI 1640 sem soro e frio. Em seguida, o gânglio é extraído do outro lado da traqueia seguindo o mesmo protocolo.

Após todos os gânglios terem sido dissecados, eles são liberados, tanto quanto possível, de tecidos estranhos. Observando pelo microscópio, pode-se notar que os gânglios possuem fragmentos aderidos de gordura da artéria carótida ou de outros tecidos; pinças são usadas para remover esses materiais indesejados. Os conectivos pré e/ou pós-ganglionares também são aparados.

Cada gânglio possui cerca de 10.000 neurônios. Uma vez que os neurônios são semeados, eles regenerarão seus neuritos. Os gânglios são então colocados em um tubo cônico estéril de polipropileno de 15 mililitros contendo meio RPMI 1640.

Em seguida, estabelece-se o cultivo de neurônios simpáticos. Os gânglios são centrifugados a 200 ×g por dois minutos e o sobrenadante é descartado. Os gânglios são ressuspendidos em 0,5 a um mililitro de solução de tripsina 0,25% e, em seguida, colocados em banho-maria ou incubadora a 37 °C por 30 minutos para ajudar na dissociação das células nos gânglios.

Após 30 minutos, adicionam-se 10 mililitros de meio completo para diluir e neutralizar a tripsina. Em seguida, as soluções são centrifugadas a 200 ×g durante dois minutos. O sobrenadante é então descartado e os gânglios são ressuspendidos em dois mililitros de meio final.

Usando uma das pontas de pipeta previamente preparadas e polidas ao fogo com abertura ampla, as células são ainda dissociadas por aspirar e dispensar os gânglios para cima e para baixo 20 vezes. O tubo é então colocado no gelo por alguns minutos. Em seguida, a ponta da pipeta é novamente polida ao fogo para tornar a abertura ainda mais estreita.

Após o resfriamento da pipeta, os gânglios são triturados mais 20 vezes. O meio ficará progressivamente mais turvo, indicando que as células estão sendo dissociadas. Este passo é repetido mais uma ou duas vezes, dependendo do grau de dissociação das células.

Após algum tempo, os gânglios estarão dissociados em neurônios e não serão visíveis gânglios intactos no tubo. Pode haver algum material tecidual que neste momento não se dissocie. O tubo é deixado em repouso sobre gelo por alguns minutos para que qualquer detrito não associado possa sedimentar no fundo.

Coleta-se cuidadosamente todo o sobrenatante, exceto cerca de 50 microlitros, e transfere-se para outro tubo. Deixam-se 50 microlitros no fundo do tubo para evitar a transferência de detritos não associados. Adiciona-se mais meio final ao tubo contendo as células dissociadas.

O volume do meio final adicionado depende do tipo de placa de cultura que se está utilizando para cultivar os neurônios. Por exemplo, se uma placa de 24 poços for utilizada, então plaque um gânglio por poço em 0,5 mililitros de meio final por poço.

Uma ninhada típica de ratos consiste em 12 filhotes, o que resultaria em 24 gânglios. Isso é suficiente para semear uma placa de 24 poços, e o volume total do meio final é de 12 mililitros. O uso de uridina cinco FDU no meio final impedirá a proliferação e promoverá a morte de uma pequena população de gliócitos e outros tipos celulares.

Presente na cultura, as células são alimentadas a cada 48 horas, substituindo dois terços do meio. Com RPMI fresco mais 1% de soro de cavalo mais NGF e uridina e cinco FDU. Inicialmente, a cultura contém neurônios simpáticos que parecem redondos, sem neurônios.

Neurônios curtos tornam-se visíveis 24 horas após a dissecação e progridem gradualmente em densidade e ramificação ao longo do tempo. Acabamos de mostrar como isolar e cultivar neurônios simpáticos primários dos gânglios cervicais superiores de ratos recém-nascidos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de: primeiro, dedicar tempo e cuidado para limpar os gânglios, removendo todos os detritos, vasos sanguíneos e gordura.

Esta etapa é importante para garantir uma cultura mais ou menos homogênea e livre de tipos celulares estranhos. Em segundo lugar, durante a etapa de dissociação, seja paciente e dedique tempo a separar os neurônios para que não sejam encontrados em grandes aglomerados. Uma vez assentados nas placas, grandes aglomerados tornarão o processo difícil.

Em aplicações posteriores, como seccionar ou infectar os neurônios, a imunomarcação também pode ser prejudicada, e quaisquer experimentos que exijam a contagem dos neurônios serão difíceis de realizar. Por fim, não é necessário suplementar o meio com penicilina-estreptomicina. Toda vez que as culturas são alimentadas, a adição de penicilina-estreptomicina é necessária apenas na primeira vez em que as células são semeadas.

Adicione uridina cinco FDU fresca ao meio toda vez que o meio for trocado. Nosso laboratório utilizou culturas neuronais simpáticas para estudar apoptose em resposta à retirada do fator de crescimento nervoso. É isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.