Isolamento e Cultura de Pós-Natal do rato Cerebelar Granule Células Progenitoras Neuron e Neurônios

Este procedimento começa com a remoção do cerebelo de P quatro a P cinco. As meninges de camundongos recém-nascidos e o plexo coroide são removidos de cerebelos individuais, que são então coletados em um tubo cônico de 15 mililitros. Os cerebelos são dissociados com papaína e transformados em uma suspensão simples de células com agitação suave.

Essa suspensão é filtrada por gravidade através de uma malha de náilon com tamanho de poro de 70 mícrons. O fluxo que passa é cuidadosamente depositado sobre um gradiente descontínuo de perca e centrifugado para separar as células granulares da glia em neurônios e neurônios do gene Perkin. As células na interface do gradiente são coletadas e pré-plantadas em placas revestidas com poli-l-lisina.

Para remover ainda mais as células gliais, os neurônios granulares são coletados, contados e semeados em densidades desejadas em lamínulas de vidro revestidas com poli-L-lisina ou placas de cultura de plástico. Olá, sou Hey Young Lee do laboratório do Dr. Lloyd Green, do Departamento de Patologia da Universidade de Columbia. Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento e cultivo de neurônios granulares cerebelares de camundongos pós-natais.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a proliferação e diferenciação de neuroprogenitores de células granulares. Então, vamos começar. Este procedimento inicia-se com o uso de etanol a 70% na área de dissecação para dissociar células granulares cerebelares; utilizamos o sistema de dissociação Papain.

Ao iniciar um novo kit, prepare a solução inibidora de albumina OVO equate MOID. Para isso, pegue 32 mililitros de solução salina balanceada de Earl ou EBSS, fornecida no kit, e adicione à mistura de albumina OVO moid. Deixe de lado enquanto prepara os outros componentes, permitindo que o conteúdo se dissolva.

Em seguida, adicione cinco mililitros de EBSS a um frasco de papaína do kit de dissociação. Cada frasco é suficiente para dissociar de quatro a 15 cerebelos de camundongos P5. Em seguida, coloque o frasco de papaína em uma estufa com 5% de CO₂ a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos, até que a papaína esteja completamente dissolvida e a solução apareça límpida.

Mantenha a solução em temperatura ambiente durante a dissecação. Em seguida, adicione 500 microlitros de EBSS ao frasco 1D NAS do kit. Misture suavemente batendo levemente no frasco.

Como o DNAS é sensível à desnaturação por cisalhamento, adicione 250 microlitros desta solução ao frasco de pepane para obter uma concentração final de 20 unidades por mil e 0,005% de DNA; guarde o DNA restante para uso em etapas posteriores. Uma vez que as ferramentas e reagentes estejam prontos, prossiga com a dissecação dos cerebelos e remoção das meninges para este procedimento. Camundongos C57 black six são utilizados entre os dias pós-natais quatro e seis.

Essa faixa etária é ideal para o cultivo de células granulares porque o número de progenitores de células granulares da camada granular externa ou EGL está em um máximo. Pipete 15 mililitros de HBSS com glicose em uma placa de cultura de tecidos plástica de 60 milímetros e 10 mililitros em um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Coloque o tubo no gelo, limpe a cabeça do filhote com etanol a 70%. Use uma tesoura fina para remover a cabeça.

Transfira a cabeça para a câmara de fluxo laminar e segure-a com pinça de modo que a parte posterior do crânio fique claramente visível. Insira a tesoura de dissecação microcirúrgica no forame magno para acessar o cérebro e, em seguida, corte em linha reta em direção aos olhos. Use uma pinça fina Dumont.

Número cinco, pinça para remover a pele e levantar o crânio a fim de expor o cérebro. Em seguida, pinçar o cerebelo e a porção adjacente do mesencéfalo. Transfira-o para a placa contendo HBSS com glicose.

Observe que é mais fácil manipular o cerebelo e remover as meninges se o cerebelo ainda estiver preso ao tecido circundante. Em seguida, coloque o tecido sob um microscópio estereoscópico. Depois, use um par de pinças para fixar o cerebelo à placa.

Use uma pinça fina Dumont número cinco para remover delicadamente as meninges do cerebelo, bem como entre os lobos. Você notará vasos sanguíneos na superfície do cerebelo.

Esses vasos sanguíneos são uma boa maneira de identificar as meninges. Continue removendo as meninges até que o cerebelo adquira uma aparência branca e aveludada. Em seguida, separe o cerebelo do restante do mesencéfalo.

Coloque-o sobre o seu lado ventral e remova o plexo coroide, que tem a aparência de uma fita avermelhada entre o cerebelo ventral e o mesencéfalo adjacente. Assim que o cerebelo for dissecado, coloque-o em HBSS com glicose gelado no tubo cônico de 15 mililitros sobre gelo. Após dissecar três cérebros, substitua a solução de dissecação por HBSS com glicose fresco.

À medida que você ganha mais familiaridade com a dissecação cerebelar, tente reduzir o tempo de dissecação para não mais de seis minutos por filhote. Quando as dissecações estiverem concluídas, prossiga com a suspensão celular. Passo para gerar uma suspensão celular a partir das dissecações cerebelares.

Primeiro, remova o HBSS com glicose do tubo e substitua-o pela solução de papaína. Embora o kit recomende cortar o tecido em pequenos pedaços, verificamos que isso não é necessário nesta idade. Coloque o tecido e a solução de papaína em uma incubadora com 5% de CO₂ a 37 °C por 15 a 20 minutos.

Para quatro a oito cerebelos, incubar por 15 minutos. Para um número maior, incubar por até meia hora. Agitar suavemente o tubo a cada três a quatro minutos.

Após a conclusão da incubação, inicie a etapa de pipetagem: recubra uma ponteira estéril de pipeta P1000 com FBS, pipetando para cima e para baixo duas vezes. Agora, pipete a mistura. Certifique-se de pipetar suavemente para evitar a formação de bolhas de ar.

Cerca de 10 movimentos para cima e para baixo com a pipeta são suficientes para dissociar o tecido. A solução deve ficar turva. Deixe a suspensão repousar por 30 a 60 segundos para que quaisquer pedaços grandes de tecido não dissociado sedimentem no fundo do tubo.

Embora pipetas de vidro polidas a fogo possam ser usadas para a pipetagem, verificamos que ponteiras estéreis de P1000 revestidas com soro funcionam igualmente bem. Em seguida, transfira as células em suspensão para um novo tubo cônico de 15 mL usando uma ponteira de pipeta revestida com soro, tomando cuidado para não transferir os fragmentos de tecido não associados que estão no fundo. Em seguida, centrifugue a suspensão celular a aproximadamente 200 ×g por cinco minutos.

À temperatura ambiente durante a centrifugação, prepare o meio de suspensão de ressuspensão. Para isso, adicione 2,7 mililitros de EBSS em um tubo estéril. Em seguida, adicione 300 microlitros da solução reconstituída do inibidor de albumina OVO MOID.

Finalmente, adicione 150 microlitros da solução de DNA. Após a conclusão da centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda imediatamente o pellet celular na solução diluída de inibidor de albumina de DNA. Novamente, utilize uma ponteira revestida com soro para ressuspendar o pellet.

Agora, prepare um gradiente de densidade descontínuo. Para isso, adicione cinco mililitros da solução inibidora de albumina oval MOID a um tubo cônico de 15 mililitros. Sobreponha a suspensão celular sobre a solução adicionando suavemente as células ao longo da parede do tubo e, em seguida, centrifugue a aproximadamente 70 ×g por seis minutos.

À temperatura ambiente, as células dissociadas sedimentarão no fundo do tubo, enquanto os fragmentos de membrana permanecerão na interface. Se desejar obter culturas enriquecidas em células granulares, não há necessidade de purificação adicional. Descarte o sobrenadante SUP e ressuspenda imediatamente o sedimento em quatro mililitros de meio com 10% de FBS contendo 50 microlitros de DNAs.

Filtre esta suspensão por gravidade através de uma malha de náilon com tamanho de poro de 70 micrômetros. Este passo remove células não neuronais grandes e proporciona uma melhor suspensão de células individuais. Em seguida, ignore o próximo passo de separação por gradiente de percoll e prossiga para o passo de semeadura celular.

Ou, se desejar purificar ainda mais os neurônios granulares da glia e dos grandes interneurônios, prossiga para o gradiente Percoll. Passo: descarte o sobrenadante e imediatamente ressuspenda o pellet em dois mililitros de HBSS com glicose contendo 50 microlitros de DNAse.

Novamente, filtre a suspensão através de uma malha de náilon. Antes de iniciar a separação em gradiente de Percoll, prepare dois pipetos Pasteur com pontas polidas ao fogo. Aqueça suavemente a ponta de um pipeto até que a borda fique lisa e o diâmetro interno tenha cerca da metade do tamanho original. Tenha cuidado para não tornar a abertura muito pequena.

Agora prepare o gradiente de Percoll. Coloque 10 mL de solução de Percoll a 35% em um tubo cônico estéril de 50 mL. Em seguida, carregue 10 mL de Percoll a 60% em uma seringa estéril de 10 mL com uma agulha espinal estéril acoplada.

Cubra suavemente a solução de 60% por camada sob a solução de 35% deixando a ponta da seringa tocar o fundo do tubo. Tenha cuidado para manter uma interface nítida entre as duas camadas. Em seguida, adicione as células ao topo do gradiente.

Usando uma pipeta polida ao fogo, adicione suavemente as células ao longo da lateral do tubo sem perturbar a interface. Após sobrepor cuidadosamente as células, coloque o tubo no centrifugador. Inicie a centrifugação em aproximadamente 18 G. Aumente a velocidade um degrau a cada 20 segundos, de modo que leve aproximadamente dois minutos para atingir 1800 G. Após 10 minutos a 1800 G, reduza a velocidade gradualmente um degrau a cada 20 segundos.

Quando a centrifugação estiver concluída, remova a interface superior do gradiente e descarte-a. Esta interface contém grandes células ggl bikini e interneurônios. Em seguida, use uma pipeta flamejada para remover cuidadosamente as células presentes na interface.

Transfira as células para um tubo de 50 ml. Se o volume for maior que 15 ml, divida-as em dois tubos de 50 ml e re-suspenda em três volumes de HB S'S com glicose, misturando por inversão várias vezes. Em seguida, centrifugue por cinco minutos a 1100 ×g. Remova agora o sobrenadante e adicione 4 ml de meio contendo 10% de FBS e 50 microlitros de D ns reus.

Suspenda suavemente o pellet usando uma pipeta polida ao fogo para formar uma suspensão de células únicas. Uma vez que as células sejam ressuspendidas, prossiga com o pré-plaqueamento. As células pré-plaqueiam as células coletadas em uma placa revestida com poli-L-lisina por 20 minutos.

Em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Durante a incubação, as astróglia e as células mais pesadas irão sedimentar e aderir às placas, enquanto os neurônios granulares pequenos e as células progenitoras neuronais permanecerão flutuando ou fracamente aderidas. Após 20 minutos, toque suavemente na placa para desprender as células granulares fracamente aderidas.

Em seguida, transfira a suspensão celular para uma placa nova revestida com poli-L-lisina e repita a incubação. Depois, colete os neurônios granulares e as células progenitoras neuronais em um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 200 ×g por cinco minutos. Em seguida, ressuspenda o pellet em 1 mL de meio livre de C e conte utilizando um hemocitômetro.

Por fim, adicione meio sem soro para atingir a densidade celular desejada para semeadura em densidade média. Para placas de seis poços. Utilize aproximadamente três milhões e meio a quatro milhões de células para placas de quatro poços.

Utilize 650.000 células. Mantenha as células em um incubador a 37 graus com 5% de CO2. Troque o meio completamente 24 horas após o plaqueamento inicial, e posteriormente a cada dois ou três dias.

Aqui estão algumas imagens de culturas saudáveis de neurônios granulares e células progenitoras. 24 horas após a semeadura e seis dias após a semeadura. Essas células podem ser mantidas em cultura por até duas semanas.

Observe que, nas 24 horas seguintes ao plaqueamento, células saudáveis se espalharão uniformemente ao redor das lamínulas ou do poço de plástico e emitirão prolongamentos. A agregação celular e a presença de varicosidades nos prolongamentos celulares indicam que as células estão doentes ou que o substrato de poli-l-lisina é tóxico. Conforme visto no diagrama, os precursores de neurônios granulares começam a se diferenciar após o plaqueamento e expressam marcadores.

Representativo de sua diferenciação. O estado de proliferação de precursores de neurônios granulares pode ser substancialmente prolongado pela adição de hedgehog sonico ao meio. A laminina também pode ser adicionada como substrato, além da polilisina, para promover o crescimento dos neuritos.

Essas características da cultura de células granulares oferecem um sistema para estudar a biologia dos neurônios granulares ou a regulação da diferenciação de células progenitoras em neurônios. Acabamos de mostrar como isolar e cultivar progenitores neurais e neurônios granulares cerebelares MAO. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o rendimento aproximado é de 4 a 5 vezes 10 elevado à sexta.

Das seis células por pupa, as densidades de plaqueamento podem variar entre e cinco vezes o centro das cinco células por centímetro quadrado. Assim, se o passo do gradiente de percoll for ignorado, então oito pupas de camundongo do quinto dia pós-natal podem render células suficientes para seis placas de cultura de quatro poços nas minhas mãos. O uso do passo do gradiente de percoll reduzirá o rendimento de células em aproximadamente 25 a 30%. No entanto, o percentual de neurônios granulares nas culturas aumenta de 90 a 95% para 99%. Células granulares enriquecidas obtidas sem o passo de separação por gradiente de percoll têm sido usadas para estudar a regulação da proliferação e diferenciação de progenitores de neurônios granulares. Contudo, se as culturas forem utilizadas por mais de alguns dias in vitro, recomenda-se a inclusão do passo do gradiente de percoll, a fim de diminuir a contaminação dos neurônios granulares por células não neuronais proliferativas.

Além disso, certifique-se de que as soluções utilizadas para preparar o gradiente per cot estejam frescas, pois um tampão inadequado leva a uma maior morte celular. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.