Name: Isolamento e Cultura de Pós-Natal do rato Cerebelar Granule Células Progenitoras Neuron e Neurônios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 4 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar neurônios de grânulos cerebelares de camundongos pós-natais usando dissociação com papaina e gradiente de percoll. Este método permite estudar proliferação e diferenciação de progenitores neurais em neurociência.

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Agradecemos a Barbara Carletti e Anna Marie Kenney para sugestões de valor inestimável. H. é suportado pelo Training Grant &quot;Hormônios: Bioquímica e Biologia Molecular&quot;, DK07328. Apoiado em parte pelo NIH conceder 5R01 NS16951 (CAM).

Parte 1: Configurando (1-2 dias antes da dissecção) (Não mostrado no vídeo) <ol><li> Preparar soluções CULTURA E MEDIA: <ul><li> 4X CMF-PBS-EDTA (cálcio e magnésio free-tampão fosfato salina-EDTA para diluições de Percoll): litro, adicione 32 g NaCl, 1,2 g KCl, 8 g de glicose, 2 g NaH 2 PO 4, 1 g KH 2 PO 4, 8 ml de 2% NaHCO stock 3, 10 ml 1M EDTA (pH 8,0) para água destilada / deionizada. Ajuste o volume para 1 litro eo pH para 7,4. Filtro de esterilizar. </li><li> HBSS GLUCOSE: Adicionar glucose (6 gramas / litro) para cálcio e magnésio da solução de Hank livre de sal Balance (HBSS) e filtro estéril. 500 ml pode ser armazenado a 4 ° C por até um mês. </li><li> Meios de cultura: sem soro médio (SFM) e 10% médio FBS. A 48 ml de Neurobasal A-Médio adicionar 500 mL 100X Glutamax I, 500 100X mL penicilina-estreptomicina (final 100 Unidades penicilina e estreptomicina 100 mg), 6,25 mL KCl 2 M (final 250 mM). Dividido em duas alíquotas de 9 ml e 40 ml. Para preparar 10% de médio FBS, adicionar 1 ml de inativado pelo calor FBS à alíquota de 9 ml. Para preparar SFM, adicionar 800 mL do suplemento sem soro B-27 à alíquota de 40 ml. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C para um máximo de duas semanas. Para melhores resultados fazer novas mídias para cada experimento. </li></ul></li><li> Preparar diluições PERCOLL: <ul><li> Percoll é fornecido como um líquido e deve ser acidificado antes de usar. Para preparar o estoque, adicionar HCl 1N, pouco a pouco para a solução Percoll durante um período de 1-2 horas até que o pH 7,4 é atingido. Adicionando o HCl muito rapidamente fará com que o Percoll para agregar. Cerca de 6.5ml de 1N HCl são necessários para cada litro de Percoll. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C. </li><li> A 35% e 60% (vol: vol) diluição Percoll será utilizado na etapa de gradiente de Percoll. Preparar 100 ml Percoll diluições contendo 35 ou 60 ml de Percoll estoque, 25 ml de 4X CMF-PBS-EDTA e água destilada / deionizada H2O ao volume final. Adicione algumas gotas de azul de toluidina para a solução de 60%, ele vai ajudar a visualizar a interface e as células. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C. </li><li> 4X CMF-PBS-EDTA não deve ser mais de 3 meses, como buffer inadequada causará a morte celular aumentou durante o procedimento. </li></ul></li><li> Lamelas PREPARAÇÃO: lamínulas de vidro (melhor se de Carolina Supply Company Biológicas) são lavados com HCl 10% durante a noite a temperatura ambiente com agitação leve, enxaguar bem com água destilada / deonized água e armazenadas em etanol 70%. Antes do uso, lamínulas simples são chama-esterilizados por breves instantes, segurando-os com uma pinça sobre uma flama aberta (bico de Bunsen), até a evaporação do etanol. Lamínulas de 12 mm de vidro podem ser colocadas em placas de quatro bem-cultura e de 25 mm lamínulas em placas de 6 poços cultura. </li><li> NAVIOS DE REVESTIMENTO DE SUBSTRATO COM CULTURA: Para imunofluorescência ou lamelas de drogas tratamentos de vidro são mais adequadas, pois podem ser facilmente montados em lâminas de vidro para visualização sob um microscópio. Quando um grande número de células necessárias para a recolha de amostras de proteína ou RNA, as células podem ser cultivadas em cultura de plástico noite dishes.The antes da dissecação, lamínulas de vidro ou pratos de plástico para a cultura devem ser revestidos com poli-D-lisina (500 mg / ml; 800 mL / poço de 6-lamelas ou 350 mL / poço para 4 bem-chapas). 5 mg / ml solução estoque de poli-D-lisina é armazenada a -20 ° C, em seguida, diluídos em água destilada / deonized estéril e direito estéril filtrado antes do uso. Embarcações de cultura são incubados a 37 ° C durante a noite (ou pelo menos por 2 horas antes do plaqueamento) e lavadas duas vezes com direito a água destilada estéril / deonized antes do plaqueamento. </li><li> Preparar pratos PREPLATING: Estes pratos serão utilizados para a pré-revestimento de células isoladas do cerebelo diante da cultura para remover os contaminantes da glia, que aderem mais facilmente a uma menor concentração de substrato. Revestimento dois de 60 mm de plástico placas de cultura com 4 ml por prato de poli-D-lisina (100 mg / ml; Note que este é 1 / 5 da concentração utilizada para cultura). Incubar a 37 ° C durante a noite (ou pelo menos por 2 horas antes da dissecção). Logo antes da dissecção, remover a solução de poli-D-lisina, lavar a louça duas vezes com água estéril e deixar secar no capô. </li><li> Esterilizar instrumentos de dissecação em autoclave ou no dia da dissecção, mergulhe as ferramentas em etanol 70% por 20 minutos. Ferramentas necessárias: uma tesoura Permaset, tesoura microdissecting, quatro Dumont # 5 pinças de dissecação. </li></ol> Parte 2: Preparando-se para dissecção (dia de dissecção) - (demonstrado em vídeo) Todos os seguintes procedimentos são realizados em uma capa de cultura de tecidos, a menos que observou. <ol><li> Limpe a área de dissecação com etanol 70%. Aquecer a mídia para 37 ° C em banho-maria ou em um 5% CO 2 37 ° C incubadora. </li><li> Ao criar um novo sistema de papaína dissociação Kit (Worthington), preparar a solução de albumina-ovomucoid inibidor. Adicionar 32 mlde EBSS (solução salina balanceada de Earle, fornecido no kit) para a mistura de inibidor de albumina ovomucoid e permitir que o conteúdo para dissolver enquanto prepara os outros componentes. Reconstituir para o primeiro uso, em seguida, armazenar o restante solução a 2-8 ° C e seu uso até os cinco isolamentos permitido por cada kit estão concluídas. </li><li> Adicionar 5 ml de EBSS para um frasco papaína do Kit dissociação (cada frasco é suficiente para a dissociação de 4-15 cerebelos de ratos pós-natais dia 5). Coloque o frasco papaína em 5% de CO 2 37 ° C incubadora ou 37 ° C banho-maria por 5 a 10 minutos até que a papaína é completamente dissolvido ea solução aparece clara. Manter a solução em temperatura ambiente durante a dissecção. </li><li> Adicionar 500 mL de EBSS para um frasco DNase do Kit dissociação. Misture delicadamente tocando no frasco desde DNase é sensível a desnaturação de cisalhamento. Adicionar 250 mL desta solução para o frasco contendo a papaína (concentração final é de 20 unidades / ml papaína e DNase 0,005%). Salve o frasco DNase restante para utilização na etapa 5.1 ou 6.1. </li></ol> Parte 3: Dissecção e remoção Meninges <ol><li> A idade ideal para a cultura de células de grânulos de camundongos C57BL/6J é dia pós-natal 4-6, quando o número de células progenitoras grânulo na EGL peaks1, 10. Dissecar filhotes de cada vez e como você se torna mais familiarizado com a dissecção cerebelar tentar reduzir o tempo de dissecação para não mais de 6 minutos por filhote. Velocidade é da essência. Se o passo gradiente Percoll é ignorada, oito filhotes dias pós-natal do rato-5 pode produzir células suficientes para uma placa de cultura de 6 poços (ou seis de 25 mm lamelas) ou por seis pratos quatro bem-cultura (ou 24 12 - lamínulas mm). Rendimento aproximado é de 4 a 5x106 células por densidades das crias e revestimento pode variar entre 1 e 5X105 cells/cm2. Como as células de 15-20% são perdidos durante o step4 Percoll, mais animais são necessários para obter a densidade mesma célula desejada. </li><li> Pipetar 15 ml de HBSS glicose em uma placa de cultura de 60 mm de plástico e tecido 10 ml em uma estéril 15 ml Falcon tubo plástico cônico. Coloque sobre o gelo. </li><li> Fora a capa, limpe a cabeça do cachorro com etanol 70%. Use uma tesoura Permaset para decapitar o filhote. (Decapitação não será mostrado no vídeo.) </li><li> No bairro, segure a cabeça com uma pinça Dumont para que você possa ver claramente a parte de trás do crânio. Acesso ao cérebro através da inserção de uma tesoura microdissecting no forame magno e corte reto em direção aos olhos. Utilizando uma pinça, descascar a pele e levante a caveira para expor o cérebro. Utilizando uma pinça Dumont, belisque o cerebelo eo mesencéfalo circundante e transferi-lo para o prato com HBSS glicose. (É mais fácil manipular o cerebelo e remover as meninges se o cerebelo é ainda ligado ao tecido circunvizinho). </li><li> Sob o microscópio de dissecação, descascar delicadamente as meninges fora do cerebelo e também entre os lobos com uma fina Dumont # 5 forceps durante o uso do fórceps, inseri-baixo do cerebelo para a chapa. Você vai notar vasos sanguíneos na superfície do cerebelo. Estes vasos sanguíneos são uma boa maneira de identificar as meninges. Remove as meninges até o cerebelo assume uma aparência branca emaranhada. Separar o cerebelo do resto do mesencéfalo. Ligá-lo ao seu lado ventral e remover o plexo coróide, que se parece com uma fita vermelha entre o cerebelo e mesencéfalo ventral adjacente. Coloque cada cerebelo no frio HBSS glicose em um tubo de 15 ml cônico no gelo logo dissecado. Mudar a solução de dissecação a fresco HBSS glicose após dissecar três cérebros. </li></ol> Parte 4: suspensão de células <ol><li> Depois de todas as dissecções terminar, remova o HBSS glicose do tubo e substituí-lo com a solução de papaína feita no passo 2.4. Embora o kit recomenda cortar o tecido em pedaços pequenos, descobrimos que não é necessário cortar ou picar o cerebelos nesta idade. Coloque o tecido solução papaína + (em um tubo cônico de 15 ml) a 37 ° C banho-maria ou 5% de CO 2 37 ° C incubadora por 15 a 20 minutos. Para 4-8 cerebelos, 15 minutos a 37 ° C é suficiente, pois um número maior de cerebelos 20 a 30 minutos é melhor. Agite suavemente o tubo a cada 3 a 4 minutos. </li><li> Triturar a mistura com uma ponta de pipeta estéril p1000 aerossol que foi revestido com FBS. Fazer este passo com cuidado para evitar qualquer formação de bolhas de ar. Pipetas de vidro polido fogo pode ser usado, mas nós achamos que o soro revestido estéril p1000 dicas aerosol funcionar tão bem. Para revestir a ponta da pipeta com FBS, pipeta FBS cima e para baixo duas vezes imediatamente antes da utilização. Cerca de 10 movimentos para cima e para baixo com a pipeta é suficiente para dissociar o tecido. A solução irá tornar-se turva. Permitir a suspensão para se sentar durante 30-60 segundos, para que todos os pedaços grandes de tecido não dissociado vai assentar no fundo do tubo. </li><li> Remover as células em suspensão (cuidado para não remover os pedaços de tecido não dissociado na bottom) em um novo tubo de 15 ml com uma ponteira de soro revestido. Centrifugar a aproximadamente 200xg por 5 minutos em temperatura ambiente. Prepare re-suspensão médio. Para fazer isso, misturar 2,7 ml EBSS com 300 ml de solução reconstituída inibidor albumina ovomucoid em um tubo estéril. Adicionar 150 ml de solução DNase a partir do passo 2.4. </li><li> Após a centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender imediatamente o pellet celular na DNase diluído / solução inibidora de albumina preparada no passo 4.3 com um soro revestido p1000 aerosol pipeta ponta. </li><li> Prepare um gradiente de densidade descontínua como se segue. Adicionar 5 ml de albumina-ovomucoid solução inibidora para um tubo de 15 ml. Cuidadosamente camada de suspensão da célula na parte superior. Centrifugar a aproximadamente 70xg por 6 minutos em temperatura ambiente. Células dissociadas pellet no fundo do tubo, fragmentos de membrana permanecer na interface. </li><li> Se você deseja obter culturas que são ricos em células granulares, ignorar o Percoll etapa de separação de gradiente (que produz culturas puras de células granulares do cerebelo), e prosseguir para a Parte 6. Se você deseja isolar ainda mais as células grânulo da glia e interneurônios grande por separação por gradiente de Percoll, vá para a Parte 5. Uso do gradiente de Percoll passo vai reduzir o rendimento das células. Em nossas mãos, a redução no rendimento é de aproximadamente 20-35%. No entanto, há um aumento no enriquecimento de neurônios granulares e células progenitoras de cerca de 90% para 95-99%. </li></ol> Parte 5: Separação Gradiente de Percoll <ol><li> Desprezar o sobrenadante e imediatamente ressuspender o sedimento em 2 ml de HBSS glicose com 50 ul de DNase a partir do passo 2.4. Filtrar a suspensão de células através de uma malha de nylon (tamanho dos poros 70 mm) pela gravidade. Esta etapa irá remover grandes células não-neuronais e prevê uma suspensão melhor única célula. </li><li> Prepare-fogo duas pipetas de vidro polido Pasteur. Para fazer isso, gentilmente chama a ponta de uma pipeta de vidro até a borda é alisado eo levou pipeta é de 40-50% do tamanho original. Tome cuidado para não fazer a abertura muito pequena. </li><li> Prepare gradiente de Percoll. Coloque 10 ml de solução de Percoll 35% em um tubo estéril 50 ml. Percoll 60% (10 ml) é carregado para uma seringa de 10 ml estéril com uma agulha estéril espinhal anexado. Suavemente a camada de solução de Percoll 60% abaixo da solução de 35%, adicionando a solução de 60% no fundo do tubo com a agulha espinhal. Tome o cuidado de manter uma interface nítida entre as duas camadas. Adicionar as células para o topo do gradiente utilizando uma pipeta-fogo polido, adicionando-os delicadamente ao longo do lado do tubo, sem perturbar a interface. </li><li> Coloque cuidadosamente o tubo na centrífuga e centrifugar a 1800xg. Rampa até a velocidade de um passo a cada 20 segundos (incrementos de velocidade são as seguintes: aproximadamente 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg) para que ele leva cerca de 2 minutos para chegar à velocidade desejada. Iniciar o temporizador de 10 min, quando 1800xg é atingido. Quando terminar, diminua a velocidade gradualmente um passo a cada 20 segundos. </li><li> Remover a interface superior do gradiente (contendo glia grande, células de Purkinje, e interneurônios) e descarte. </li><li> Remova cuidadosamente as células na interface entre os 35% e Percoll 60%, com uma pipeta-fogo polido e transferir para um tubo de 50 ml. Ressuspender em 3 volumes de HBSS glicose e misturar por inversão várias vezes. Centrifugar durante 5 minutos a 1100xg. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 4 ml de 10% FBS médio com 50 ul de DNase. Ressuspender o sedimento delicadamente com uma pipeta-fogo polido para formar uma suspensão única célula. Avance para o passo 6.2. </li></ol> Parte 6: Pré-plating e Galvanização <ol><li> Desprezar o sobrenadante e imediatamente ressuspender o sedimento em 4 ml de 10% FBS médio com 50 ul de DNase a partir do passo 2.4. Filtrar a suspensão de células através de uma malha de nylon (tamanho dos poros 70 mm) pela gravidade. Esta etapa irá remover grandes células não-neuronais e prevê uma suspensão melhor única célula. </li><li> A placa de células coletadas em um poli-D-lisina prato pré-plating revestido por 20 minutos em 5% de CO 2 37 ° C incubadora. Repita com um prato de doce. As células astroglia e mais pesado vai sossegar e aderir aos pratos e deixar os neurônios de grânulos pequenos e células progenitoras neurônio flutuante. Após a incubação, os neurônios granulares frouxamente aderido e células progenitoras neuronais são facilmente desmontáveis ​​e afrouxou com toque suave do prato. </li><li> Recolher os neurônios granulares e células progenitoras neurônio em um tubo cônico de 15 ml e centrifugar a 200xg por 5 minutos. Ressuspender o sedimento em 1 ml de soro livre de médio e contar uma alíquota de 10 ml utilizando um hemocitômetro. </li><li> Adicionar soro livre de meio para alcançar a densidade de célula desejada. Directrizes gerais para números de células para a chapa de média densidade: por 6 bem-pratos, 3,5-4000000 células; para placas de quatro poços, 650.000 células. Para 6-bem placas de cultura, eu placa 1,5 ml / poço e para 4 bem-plates, eu chapa de 0,5 ml / poço. As células são mantidas em 5% de CO 2 37 ° C incubadora. Mudar o meio completamente 24 horas mais tarde, com alterações posteriores a cada dois ou três dias. </li></ol>

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Development+of+the+cerebellar+system%3A+in+relation+to+its+evolution%2C+structure%2C+and+functions%22">Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1997).</li>
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</ol>

Este protocolo é baseado em modificações de procedimentos que têm sido descritos na 3,7,11 passado. Há vários pontos importantes a considerar como discutido abaixo. Os neurônios granulares e células progenitoras aderir dentro de 2 horas de placas. Células saudáveis ​​têm uma morfologia redonda sob o microscópio de contraste de fase 4. Dentro de 24 horas após o plaqueamento, as células saudáveis ​​vai se espalhar uniformemente ao redor as lamelas ou o bem de plástico e formarão processos. Na época da mudança méd...

<table><tbody><tr><td>Filtro celular com poros de malha de 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Agulha espinal</td><td>BD Biosciences</td><td>405182</td><td>20G x 3-1/2 polegadas</td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina, peso molecular&amp;gt;300.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>Cada novo lote de Poli-D-Lisina deve ser testado.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1644</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-103</td><td>Deve ser livre de cálcio e magnésio.</td></tr><tr><td>Meio Neurobasal A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento livre de soro B-27 (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura circulares de 12 mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td>Estas são fabricadas na Alemanha pela Deckglaser.</td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura circulares de 25 mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3037</td><td>Estas são fabricadas na Alemanha pela Deckglaser.</td></tr><tr><td>Sistema de Dissociação com Papaína</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK 003150</td><td>O kit é suficiente para cinco isolamentos.</td></tr><tr><td>Tesoura Permaset</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6782</td><td></td></tr><tr><td>Dumont nº 5 (Dumostar)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4978</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 4 poços</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 6 poços</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140685</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura de pós-natal do rato cerebelar granule células progenitoras neuron e neurônios

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

O córtex cerebelar é uma estrutura bem descrito que oferece oportunidades únicas para o estudo das propriedades neuronais e 1,2 de desenvolvimento. Dos tipos cerebelar neuronal (células granulares, células de Purkinje e interneurônios inibitórios), neurônios granulares são de longe os mais numerosos e são o tipo mais abundante de neurônios no cérebro de mamíferos. Em roedores, os neurônios granulares do cerebelo são gerados durante as duas primeiras semanas pós-natal a partir de células progenitoras na camada mais externa do córtex cerebelar, a camada granular externa (EGL). O protocolo aqui apresentado descreve técnicas para enriquecer e neurônios granulares cultura e suas células progenitoras da pós-natal do cerebelo de rato. Iremos descrever os procedimentos para obter culturas de pureza aumentando 3,4, o que pode ser usado para estudar a diferenciação de proliferação de células progenitoras em neurônios granulares 5,6. Uma vez que as células progenitoras diferenciar, as culturas também proporcionam uma população homogênea de neurônios granulares para manipulação experimental e caracterização de fenômenos como a sinaptogênese, a função de receptor de glutamato 7, interação com outras células purificadas cerebelar 8,9 ou morte celular 7.

Aqui apresentamos um método para isolar e cultivar células granulares do cerebelo e neurônio progenitor neurônios granulares do cerebelo de rato pós-natal.

Isolamento e Cultura de Pós-Natal do rato Cerebelar Granule Células Progenitoras Neuron e Neurônios

O córtex cerebelar é uma estrutura bem descrita que oferece oportunidades únicas para o estudo das propriedades e do desenvolvimento neuronal1,2. Dos...

Este procedimento começa com a remoção do cerebelo de P quatro a P cinco. As meninges de camundongos recém-nascidos e o plexo coroide são removidos de cerebelos individuais, que são então coletados em um tubo cônico de 15 mililitros. Os cerebelos são dissociados com papaína e transformados em uma suspensão simples de células com agitação suave.Essa suspensão é filtrada por gravidade através de uma malha de náilon com tamanho de poro de 70 mícrons. O fluxo que passa é cuidadosamente depositado sobre um gradiente descontínuo de perca e centrifugado para separar as células granulares da glia em neurônios e neurônios do gene Perkin. As células na interface do gradiente são coletadas e pré-plantadas em placas revestidas com poli-l-lisina.Para remover ainda mais as células gliais, os neurônios granulares são coletados, contados e semeados em densidades desejadas em lamínulas de vidro revestidas com poli-L-lisina ou placas de cultura de plástico. Olá, sou Hey Young Lee do laboratório do Dr. Lloyd Green, do Departamento de Patologia da Universidade de Columbia. Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento e cultivo de neurônios granulares cerebelares de camundongos pós-natais.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a proliferação e diferenciação de neuroprogenitores de células granulares. Então, vamos começar. Este procedimento inicia-se com o uso de etanol a 70% na área de dissecação para dissociar células granulares cerebelares; utilizamos o sistema de dissociação Papain.Ao iniciar um novo kit, prepare a solução inibidora de albumina OVO equate MOID. Para isso, pegue 32 mililitros de solução salina balanceada de Earl ou EBSS, fornecida no kit, e adicione à mistura de albumina OVO moid. Deixe de lado enquanto prepara os outros componentes, permitindo que o conteúdo se dissolva.Em seguida, adicione cinco mililitros de EBSS a um frasco de papaína do kit de dissociação. Cada frasco é suficiente para dissociar de quatro a 15 cerebelos de camundongos P5. Em seguida, coloque o frasco de papaína em uma estufa com 5% de CO₂ a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos, até que a papaína esteja completamente dissolvida e a solução apareça límpida.Mantenha a solução em temperatura ambiente durante a dissecação. Em seguida, adicione 500 microlitros de EBSS ao frasco 1D NAS do kit. Misture suavemente batendo levemente no frasco.Como o DNAS é sensível à desnaturação por cisalhamento, adicione 250 microlitros desta solução ao frasco de pepane para obter uma concentração final de 20 unidades por mil e 0,005% de DNA; guarde o DNA restante para uso em etapas posteriores. Uma vez que as ferramentas e reagentes estejam prontos, prossiga com a dissecação dos cerebelos e remoção das meninges para este procedimento. Camundongos C57 black six são utilizados entre os dias pós-natais quatro e seis.Essa faixa etária é ideal para o cultivo de células granulares porque o número de progenitores de células granulares da camada granular externa ou EGL está em um máximo. Pipete 15 mililitros de HBSS com glicose em uma placa de cultura de tecidos plástica de 60 milímetros e 10 mililitros em um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Coloque o tubo no gelo, limpe a cabeça do filhote com etanol a 70%. Use uma tesoura fina para remover a cabeça.Transfira a cabeça para a câmara de fluxo laminar e segure-a com pinça de modo que a parte posterior do crânio fique claramente visível. Insira a tesoura de dissecação microcirúrgica no forame magno para acessar o cérebro e, em seguida, corte em linha reta em direção aos olhos. Use uma pinça fina Dumont.Número cinco, pinça para remover a pele e levantar o crânio a fim de expor o cérebro. Em seguida, pinçar o cerebelo e a porção adjacente do mesencéfalo. Transfira-o para a placa contendo HBSS com glicose.Observe que é mais fácil manipular o cerebelo e remover as meninges se o cerebelo ainda estiver preso ao tecido circundante. Em seguida, coloque o tecido sob um microscópio estereoscópico. Depois, use um par de pinças para fixar o cerebelo à placa.Use uma pin&ccedil;a fina Dumont n&uacute;mero cinco para remover delicadamente as meninges do cerebelo, bem como entre os lobos. Voc&ecirc; notar&aacute; vasos sangu&iacute;neos na superf&iacute;cie do cerebelo.Esses vasos sanguíneos são uma boa maneira de identificar as meninges. Continue removendo as meninges até que o cerebelo adquira uma aparência branca e aveludada. Em seguida, separe o cerebelo do restante do mesencéfalo.Coloque-o sobre o seu lado ventral e remova o plexo coroide, que tem a aparência de uma fita avermelhada entre o cerebelo ventral e o mesencéfalo adjacente. Assim que o cerebelo for dissecado, coloque-o em HBSS com glicose gelado no tubo cônico de 15 mililitros sobre gelo. Após dissecar três cérebros, substitua a solução de dissecação por HBSS com glicose fresco.À medida que você ganha mais familiaridade com a dissecação cerebelar, tente reduzir o tempo de dissecação para não mais de seis minutos por filhote. Quando as dissecações estiverem concluídas, prossiga com a suspensão celular. Passo para gerar uma suspensão celular a partir das dissecações cerebelares.Primeiro, remova o HBSS com glicose do tubo e substitua-o pela solução de papaína. Embora o kit recomende cortar o tecido em pequenos pedaços, verificamos que isso não é necessário nesta idade. Coloque o tecido e a solução de papaína em uma incubadora com 5% de CO₂ a 37 °C por 15 a 20 minutos.Para quatro a oito cerebelos, incubar por 15 minutos. Para um número maior, incubar por até meia hora. Agitar suavemente o tubo a cada três a quatro minutos.Após a conclusão da incubação, inicie a etapa de pipetagem: recubra uma ponteira estéril de pipeta P1000 com FBS, pipetando para cima e para baixo duas vezes. Agora, pipete a mistura. Certifique-se de pipetar suavemente para evitar a formação de bolhas de ar.Cerca de 10 movimentos para cima e para baixo com a pipeta são suficientes para dissociar o tecido. A solução deve ficar turva. Deixe a suspensão repousar por 30 a 60 segundos para que quaisquer pedaços grandes de tecido não dissociado sedimentem no fundo do tubo.Embora pipetas de vidro polidas a fogo possam ser usadas para a pipetagem, verificamos que ponteiras estéreis de P1000 revestidas com soro funcionam igualmente bem. Em seguida, transfira as células em suspensão para um novo tubo cônico de 15 mL usando uma ponteira de pipeta revestida com soro, tomando cuidado para não transferir os fragmentos de tecido não associados que estão no fundo. Em seguida, centrifugue a suspensão celular a aproximadamente 200 ×g por cinco minutos.À temperatura ambiente durante a centrifugação, prepare o meio de suspensão de ressuspensão. Para isso, adicione 2,7 mililitros de EBSS em um tubo estéril. Em seguida, adicione 300 microlitros da solução reconstituída do inibidor de albumina OVO MOID.Finalmente, adicione 150 microlitros da solução de DNA. Após a conclusão da centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda imediatamente o pellet celular na solução diluída de inibidor de albumina de DNA. Novamente, utilize uma ponteira revestida com soro para ressuspendar o pellet.Agora, prepare um gradiente de densidade descontínuo. Para isso, adicione cinco mililitros da solução inibidora de albumina oval MOID a um tubo cônico de 15 mililitros. Sobreponha a suspensão celular sobre a solução adicionando suavemente as células ao longo da parede do tubo e, em seguida, centrifugue a aproximadamente 70 ×g por seis minutos.À temperatura ambiente, as células dissociadas sedimentarão no fundo do tubo, enquanto os fragmentos de membrana permanecerão na interface. Se desejar obter culturas enriquecidas em células granulares, não há necessidade de purificação adicional. Descarte o sobrenadante SUP e ressuspenda imediatamente o sedimento em quatro mililitros de meio com 10% de FBS contendo 50 microlitros de DNAs.Filtre esta suspensão por gravidade através de uma malha de náilon com tamanho de poro de 70 micrômetros. Este passo remove células não neuronais grandes e proporciona uma melhor suspensão de células individuais. Em seguida, ignore o próximo passo de separação por gradiente de percoll e prossiga para o passo de semeadura celular.Ou, se desejar purificar ainda mais os neurônios granulares da glia e dos grandes interneurônios, prossiga para o gradiente Percoll. Passo: descarte o sobrenadante e imediatamente ressuspenda o pellet em dois mililitros de HBSS com glicose contendo 50 microlitros de DNAse.Novamente, filtre a suspensão através de uma malha de náilon. Antes de iniciar a separação em gradiente de Percoll, prepare dois pipetos Pasteur com pontas polidas ao fogo. Aqueça suavemente a ponta de um pipeto até que a borda fique lisa e o diâmetro interno tenha cerca da metade do tamanho original. Tenha cuidado para não tornar a abertura muito pequena.Agora prepare o gradiente de Percoll. Coloque 10 mL de solução de Percoll a 35% em um tubo cônico estéril de 50 mL. Em seguida, carregue 10 mL de Percoll a 60% em uma seringa estéril de 10 mL com uma agulha espinal estéril acoplada.Cubra suavemente a solução de 60% por camada sob a solução de 35% deixando a ponta da seringa tocar o fundo do tubo. Tenha cuidado para manter uma interface nítida entre as duas camadas. Em seguida, adicione as células ao topo do gradiente.Usando uma pipeta polida ao fogo, adicione suavemente as células ao longo da lateral do tubo sem perturbar a interface. Após sobrepor cuidadosamente as células, coloque o tubo no centrifugador. Inicie a centrifugação em aproximadamente 18 G. Aumente a velocidade um degrau a cada 20 segundos, de modo que leve aproximadamente dois minutos para atingir 1800 G. Após 10 minutos a 1800 G, reduza a velocidade gradualmente um degrau a cada 20 segundos.Quando a centrifugação estiver concluída, remova a interface superior do gradiente e descarte-a. Esta interface contém grandes células ggl bikini e interneurônios. Em seguida, use uma pipeta flamejada para remover cuidadosamente as células presentes na interface.Transfira as células para um tubo de 50 ml. Se o volume for maior que 15 ml, divida-as em dois tubos de 50 ml e re-suspenda em três volumes de HB S'S com glicose, misturando por inversão várias vezes. Em seguida, centrifugue por cinco minutos a 1100 ×g. Remova agora o sobrenadante e adicione 4 ml de meio contendo 10% de FBS e 50 microlitros de D ns reus.Suspenda suavemente o pellet usando uma pipeta polida ao fogo para formar uma suspensão de células únicas. Uma vez que as células sejam ressuspendidas, prossiga com o pré-plaqueamento. As células pré-plaqueiam as células coletadas em uma placa revestida com poli-L-lisina por 20 minutos.Em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Durante a incubação, as astróglia e as células mais pesadas irão sedimentar e aderir às placas, enquanto os neurônios granulares pequenos e as células progenitoras neuronais permanecerão flutuando ou fracamente aderidas. Após 20 minutos, toque suavemente na placa para desprender as células granulares fracamente aderidas.Em seguida, transfira a suspensão celular para uma placa nova revestida com poli-L-lisina e repita a incubação. Depois, colete os neurônios granulares e as células progenitoras neuronais em um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 200 ×g por cinco minutos. Em seguida, ressuspenda o pellet em 1 mL de meio livre de C e conte utilizando um hemocitômetro.Por fim, adicione meio sem soro para atingir a densidade celular desejada para semeadura em densidade média. Para placas de seis poços. Utilize aproximadamente três milhões e meio a quatro milhões de células para placas de quatro poços.Utilize 650.000 células. Mantenha as células em um incubador a 37 graus com 5% de CO2. Troque o meio completamente 24 horas após o plaqueamento inicial, e posteriormente a cada dois ou três dias.Aqui estão algumas imagens de culturas saudáveis de neurônios granulares e células progenitoras. 24 horas após a semeadura e seis dias após a semeadura. Essas células podem ser mantidas em cultura por até duas semanas.Observe que, nas 24 horas seguintes ao plaqueamento, células saudáveis se espalharão uniformemente ao redor das lamínulas ou do poço de plástico e emitirão prolongamentos. A agregação celular e a presença de varicosidades nos prolongamentos celulares indicam que as células estão doentes ou que o substrato de poli-l-lisina é tóxico. Conforme visto no diagrama, os precursores de neurônios granulares começam a se diferenciar após o plaqueamento e expressam marcadores.Representativo de sua diferenciação. O estado de proliferação de precursores de neurônios granulares pode ser substancialmente prolongado pela adição de hedgehog sonico ao meio. A laminina também pode ser adicionada como substrato, além da polilisina, para promover o crescimento dos neuritos.Essas características da cultura de células granulares oferecem um sistema para estudar a biologia dos neurônios granulares ou a regulação da diferenciação de células progenitoras em neurônios. Acabamos de mostrar como isolar e cultivar progenitores neurais e neurônios granulares cerebelares MAO. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o rendimento aproximado é de 4 a 5 vezes 10 elevado à sexta.Das seis células por pupa, as densidades de plaqueamento podem variar entre e cinco vezes o centro das cinco células por centímetro quadrado. Assim, se o passo do gradiente de percoll for ignorado, então oito pupas de camundongo do quinto dia pós-natal podem render células suficientes para seis placas de cultura de quatro poços nas minhas mãos. O uso do passo do gradiente de percoll reduzirá o rendimento de células em aproximadamente 25 a 30%. No entanto, o percentual de neurônios granulares nas culturas aumenta de 90 a 95% para 99%. Células granulares enriquecidas obtidas sem o passo de separação por gradiente de percoll têm sido usadas para estudar a regulação da proliferação e diferenciação de progenitores de neurônios granulares. Contudo, se as culturas forem utilizadas por mais de alguns dias in vitro, recomenda-se a inclusão do passo do gradiente de percoll, a fim de diminuir a contaminação dos neurônios granulares por células não neuronais proliferativas.Além disso, certifique-se de que as soluções utilizadas para preparar o gradiente per cot estejam frescas, pois um tampão inadequado leva a uma maior morte celular. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra a técnica para isolar e cultivar neurônios granulares cerebelares primários de camundongos. As células são tratadas com um antimetabólito para eliminar as células gliais em proliferação e produzir uma cultura pura de neurônios granulares cerebelares.

Isolamento e cultura de neurônios granulares cerebelares primários de camundongos

Este vídeo demonstra o isolamento e o cultivo de células progenitoras neurais cerebelares do cerebelo de um filhote de camundongo. Os progenitores dos neurônios do grânulo cerebelar são isolados e purificados por meio de adesão diferencial, removendo efetivamente os astrócitos. Esses progenitores cultivados subsequentemente se diferenciam em neurônios granulares cerebelares.

Isolando e Cultivando Progenitores de Neurônios Granulares Cerebelares Murinos

Este vídeo demonstra um método para isolar células-tronco do cerebelo pós-natal de camundongos e diferenciá-las em células neurais. As células-tronco da suspensão de células isoladas são purificadas usando esferas magnéticas revestidas com anticorpos e são cultivadas para formar neuroesferas. As neuroesferas são então mantidas em um meio de diferenciação para gerar células neurais.

Isolamento de células-tronco do cerebelo pós-natal de camundongo e diferenciação em células neurais

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