Name: counting bacteria with dilution plates
Uploaded: 2023-04-30T07:09:34.000Z
Duration: 10 min 53 s
Channel: JoVE

1. Настройка
<ol>
	<li>Блок-схема с перечислением всех материалов, пошаговым протоколом эксперимента и методом утилизации материалов должна быть записана в лабораторном блокноте и храниться рядом с экспериментальным рабочим местом. </li>
	<li>Рабочие места должны быть стерилизованы соответствующим антисептиком (70% этанола), а экспериментатор должен снизить риск загрязнения, надев чистую лабораторную одежду, которая также защищает их от аномалий воздействия. Подходящая одежда включает, помимо прочего, лабораторный халат, латексные или нитриловые перчатки, гуглы, респираторы и закрытую обувь. Очень важно всегда поддерживать асептическую технику. </li>
	<li>Приготовьте 90 мл 0,45% физиологического раствора. С помощью чистого мерного цилиндра отмерьте 90 мл стерильной воды и перелейте ее в чистую колбу Эрленмейера с маркировкой 0,45% физиологического раствора. Взвесьте 0,405 г хлорида натрия (Sigma-Aldrich NaCl S9888) и добавьте его в колбу с маркировкой 0,45% физиологического раствора. Перемешивайте до тех пор, пока не останется видимого растворенного вещества. </li>
	<li>По завершении экспериментатор должен повторно простерилизовать все поверхности и отбросить все нежелательные организмы, запасы разбавителя, чашки Петри или одноразовые инокуляционные петли в соответствии с рекомендациями OSHA. Лабораторную одежду можно снимать перед мытьем рук. </li>
</ol>
2. Подготовка СМИ
<ol>
	<li>Подбирайте среды, которые подходят для культивирования нужного организма. В большинстве сценариев бульон обеспечит достаточный рост бактерий. Поскольку здесь желательны организмы из протокола Виноградского, была собрана колонка, состоящая из карбоната кальция, серы, целлюлозы и грязи, и оставлена в покое на 7 дней. Указанная колонна разделена на аэробный, микроаэрофильный и анаэробный участки. </li>
	<li>Выберите среду, подходящую для осаждения интересующего организма. В качестве отвердителя обычно используется добавка в жидкую среду микробиологическим агаром. ЛБ среда/агар достаточна при отборе проб из аэробной, микроаэрофильной и анаэробной областей указанной колонны. Примечание: Образцы из микроаэрофильной области не отбирались для этой процедуры. Тем не менее, эти организмы следует культивировать в банках со свечами. Введение свечи в эту камеру выращивания перед запечатыванием создает среду с низким содержанием кислорода, подходящую для микроаэрофильной пролиферации. </li>
	<li>Поскольку мы хотим приготовить 250 мл, используйте колбы Эрленмейера объемом 500 мл (или больше), чтобы предотвратить выкипание при автоклавировании. Подпишите одну "Бульон", а другую "Агар". </li>
	<li>Определите количество среды, необходимое для создания каждого раствора, следуя рекомендациям производителя по концентрации. Используемый здесь агар LB готовится путем смешивания 25 г/л со сверхчистой водой. Для нашего объема 250 мл требуется раствор из 6,25 фунта агара/250 мл воды. Аналогичным образом, бульон LB готовится путем смешивания того же соотношения бульона LB и воды. Поскольку он не дополнен затвердевающим веществом, он не затвердевает при охлаждении. </li>
	<li>Взвесьте среду и смешайте ее с водой в пропорциях, соответствующих рекомендациям производителя. Добавьте 6,25 г LB Agar в колбу с надписью «Agar» и 6,25 г LB Broth в колбу с надписью «Broth». Добавьте по 250 мл сверхчистой воды в каждую колбу. </li>
	<li>Оберните каждую колбу алюминиевой фольгой и стерилизуйте среду в автоклаве не менее 15 минут при температуре 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм. </li>
	<li>Используя термостойкую перчатку или прокладку, после завершения цикла извлеките колбы из автоклава и поместите их на водяную баню при температуре 40-50°C. </li>
	<li>Как только будет достигнута соответствующая температура, вылейте содержимое колбы с надписью «Бульон» в колбу Эрленмейера объемом 250 мл или колбу с круглым дном. Пометьте колбу объемом 250 мл "solution0". </li>
	<li>Приобретите стерильные чашки Петри размером 10 x 15 мм размером 10 x 15 мм и промаркируйте их датой, названием, типом используемой среды и зоной колонны Виноградского, из которой будут собираться организмы. </li>
	<li>Снимите колбу с надписью «Агар» с водяной бани и начните наливать в каждую из 10 чашек Петри. В каждое блюдо следует добавлять не более 15 мл. Это также можно сделать с помощью пипетки и серологической пипетки объемом 25 мл для повышения точности. Используйте стерильный наконечник для пипетки, чтобы удалить все присутствующие пузырьки, а затем накройте крышками пластин и оставьте застывать на ночь. </li>
</ol>
3. Получение разбавителя
<ol>
	<li>Подготовьте десять пробирок, способных хранить 20 мл и более, в штативе и пометьте их маркировкой Т1-Т10. Номер каждой пробирки согласуется с коэффициентом разбавления, которому он соответствует (т.е. T4 = 1x10-4 или 0,0001 или 1/10 000 от исходной концентрации). </li>
	<li>Пипет 9 мл 0,45% физиологического раствора в каждую из 10 пробирок. </li>
	<li>Солевые заготовки теперь готовы к стерилизации автоклавом. Используйте алюминиевую фольгу, чтобы покрыть каждую из 10 пробирок, а затем переложите их на штатив для пробирок, совместимый с автоклавом. Стерилизовать не менее 15 минут при температуре 121°C, 15 фунтов на квадратный дюйм. </li>
	<li>Снимите заготовки в термостойких перчатках и дайте остыть. Накройте крышкой и храните при температуре 4°C до тех пор, пока пробирки не нагреются до комнатной температуры или когда они остынут на ощупь. </li>
</ol>
4. Культивирование целевого организма
<ol>
	<li>Инокулируйте "раствор0" с одной колонией из предварительно покрытой прожилками пластины или 50 μл замороженного поголовья. Дайте целевому организму время для репликации, поместив инокулированный «раствор0» в инкубатор при температуре 37°C на ночь с встряхиванием (при необходимости). (Примечание: Во избежание загрязнения колба должна быть закрыта. Если целевой организм является аэробным, используйте стерильную марлю и ватные пробки для предотвращения загрязнения. Если вы оцениваете области столбца Виноградского, просто удалите по 1 грамму из каждой желаемой зоны (аэробной и анаэробной для целей данного исследования) и ресуспендируйте в Т1, прежде чем переходить к шагу 5.3. </li>
</ol>
5. Серийное разведение
<ol>
	<li>Достаньте из инкубатора колбу с надписью «Питательный бульон» и энергично встряхните. </li>
	<li>Впрыскивайте 1 мл "раствора0" в пробирку с маркировкой Т1. Вихрь Т1. Если вы оцениваете экспланты Виноградского, взвесьте 1 грамм нужной зоны и добавьте ее к Т1 перед вортексом. (Примечание: 1 мл здесь используется для простоты - также можно использовать меньшие или большие объемы разбавителя). </li>
	<li>Удалите 1 мл из пробирки Т1 и добавьте его в пробирку Т2. Вихрь Т2. </li>
	<li>Удалите 1 мл из пробирки Т2 и добавьте его в пробирку Т3. Вихрь Т3. </li>
	<li>Удалите 1 мл из пробирки Т3 и добавьте его в пробирку Т4. Вихрь Т4. </li>
	<li>Извлеките 1 мл из пробирки Т4 и добавьте его в пробирку Т5. Вихрь Т5. </li>
	<li>Извлеките 1 мл из пробирки Т5 и добавьте его в пробирку Т6. Вихрь Т6. </li>
	<li>Удалите 1 мл из пробирки Т6 и добавьте его в пробирку Т7. Вихрь Т7. </li>
	<li>Удалите 1 мл из пробирки Т7 и добавьте его в пробирку Т8. Вихрь Т8. </li>
	<li>Удалите 1 мл из пробирки Т8 и добавьте его в пробирку Т9. Вихрь Т9. </li>
	<li>Удалите 1 мл из пробирки Т9 и добавьте его в пробирку Т10. </li>
</ol>
6. Покрытие разворота
<ol>
	<li>Нанесите 100 мкл разведенного образца из Т1 непосредственно на чашку Петри. Этот шаг можно, но не обязательно, повторять для каждой трубки. </li>
	<li>Приобретите стерильный одноразовый стержень для распыления или простерилизуйте стеклянный стержень. Двигаясь по часовой стрелке/против часовой стрелки, скользите горизонтальной частью разбрасывающего стержня, чтобы равномерно распределить образец внутри чашки Петри. </li>
	<li>Повторите для каждой зоны колонны Виноградского, которая должна быть оценена. </li>
	<li>Инкубируйте планшеты в инкубаторе при температуре 37°C в течение 24 часов. Для анаэробных организмов используют анаэробную камеру. </li>
</ol>
7. Полосы
<ol>
	<li>Выберите подходящее разведение вашего целевого организма. Например, раствор4 даст 1/10 000-е разведение от вашей первоначальной концентрации. Как правило, для перечисления микробов оцениваются разведения 1/1 000th (T3/раствор), 1/1 000 000th (T6/Solution6) и 1/1 000 000 000th (T9/Solution9). </li>
	<li>Используя пластиковую стерильную одноразовую инокуляционную петлю или многоразовую металлическую инокуляционную петлю, которая находилась под огнем не менее 10 секунд, погрузите в нужный раствор из шага 5. Откалиброванные посевные петли должны пропускать 0,01 мл. (Внимание: не позволяйте сгоревшей петле контактировать с бактериями сразу после снятия с огня)</li>
	<li>Слегка приподнимите крышку чашки Петри с одной стороны, чтобы только петля для прививки могла получить доступ к агару. Проведите петлей для прививки по верхней части фильтрующего материала зигзагообразным образом, стараясь не повредить агар. Опустите крышку чашки Петри. </li>
	<li>Используйте новую одноразовую петлю для прививки или повторно простерилизуйте многоразовую петлю. </li>
	<li>Поверните пластину примерно на 1/3rd (~118°) и уменьшите частоту зигзагообразного движения. </li>
	<li>Опять же, используйте новую одноразовую петлю или повторно простерилизуйте металлическую петлю перед последним вращением и снова уменьшите частоту зигзага. Опустите крышку чашки Петри. </li>
	<li>Повторяйте шаги 7.2 - 7.6 до тех пор, пока по крайней мере три чашки Петри не будут проточены для трех различных разведений, используя новую одноразовую петлю или повторно обжигая многоразовую петлю (Рисунок 2). </li>
	<li>Поместите чашки Петри с прожилками в инкубатор с температурой 37°C на ночь. Для анаэробных организмов используют анаэробную камеру. </li>
</ol>
8. Анализ данных и результаты
<ol>
	<li>Культуры собирали из кислородной и бескислородной зон 7-дневной виноградской колонны. Эти зоны пригодны для гетеротрофных и железоокисляющих анаэробов соответственно. </li>
	<li>Колоночные экспланты последовательно разбавляли перед нанесением полос или распылением на пластины LB Agar. </li>
	<li>Стрикинг выявил смешанную популяцию из каждой из оцениваемых зон Виноградского. Раскладные тарелки дали аналогичные результаты. </li>
	<li>Чтобы рассчитать КОЕ/мл или КОЕ/г, усредните количество подсчитанных колоний из трех планшетов. Умножьте среднее количество колоний на коэффициент разбавления и разделите на количество аликвот. Например, если в среднем 65 колоний были подсчитаны на планшетах, инокулированных 0,1 мл раствора6} (T6), то описанная ранее формула будет равна 650 000 000 КОЕ/мл. </li>
	<li>Изолированные колонии теперь могут быть выбраны из каждой пластины для использования в анализах обогащения для определения видовой идентичности. </li>
</ol>

Для подсчета бактерий и выделения штаммов с помощью гальванического покрытия требуются регулируемые концентрации целевых организмов. Таким образом, успешное нанесение покрытий зависит от серийного разбавления. Таким образом, вышеупомянутые методы остаются краеугольным камнем микробиологических исследований и экспериментов. Несмотря на простоту конструкции, коэффициенты разведения и техника нанесения покрытий могут быть изменены экспериментатором для улучшения результатов без ущерба для целостности каждого метода. Построение графиков четырех фаз роста бактерий может быть полезным при определении характеристик желаемых микробов. Эти фазы, запаздывающая, логарифмическая, стационарная и смертельная, характеризуются изменениями в репликации бактерий. Лаг-фаза характеризуется медленным ростом из-за физиологической адаптации, логарифмическая фаза - это период максимальной пролиферации с экспоненциальным ростом жизнеспособных клеток, затем достигается стационарная фаза из-за ограничений окружающей среды и накопления токсинов, прежде чем наступает фаза смерти, когда количество клеток начинает падать. Это может быть достигнуто путем последовательного разбавления (или 1-ступенчатого разбавления во избежание путаницы) раствора0 каждый час в течение 8 часов, начиная со времени0 (раствор0 следует возвращать в встряхивающий инкубатор после каждого разведения). Рассчитайте log10 КОЕ/мл для одного разбавителя со временем0 и построите график по оси Y. Повторите этот расчет для времениобразца 1 (убедитесь, что расчет выполнен с использованием того же коэффициента разбавления, что и для времени0). Повторяйте до тех пор, пока каждый раз (Time1-Time 8) не будет нанесен на ось X.

Серийные разведения и осаждение: микробиологическое перечисление

Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

Источник: Джонатан Ф. Блейз1, Элизабет Сутер1 и Кристофер П. Корбо1 
1 Факультет биологических наук, Колледж Вагнера, 1 Кампус Роуд, Статен-Айленд, Нью-Йорк, 10301
Количественная оценка прокариот может быть обременительной, учитывая их численность, склонность к экспоненциальному распространению, видовое разнообразие в популяции и специфические физиологические потребности. Эта проблема усугубляется четырехфазной природой, в которой размножаются бактерии (лаг, логарифм, стационар и смерть). Возможность точной оценки концентрации микроорганизмов необходима для успешной идентификации, выделения, культивирования и характеризации (6). Таким образом, микробиологи уже более ста лет используют серийное разведение и различные методы нанесения покрытий для надежной количественной оценки бактериальной и вирусной нагрузки в клинических, промышленных, фармацевтических и академических лабораторных условиях (2,4,6). Описания этой методологии впервые появились в 1883 году, когда немецкий ученый и врач Роберт Кох опубликовал свою работу о возбудителях инфекционных заболеваний (2). Часто упоминаемые как отцы современной бактериологии, вышеупомянутые методы Коха стали золотым стандартом для перечисления микроорганизмов, культивируемых или нет, во всем мире. 
Серийное разведение представляет собой систематическое восстановление известного или неизвестного объекта (растворенного вещества, организма и т.д.) путем последовательного повторного суспендирования исходного раствора (раствора0) в фиксированные объемы жидкого разбавителя (холостых частей). Эти заготовки обычно состоят на 0,45% из физиологического раствора, хотя состав может варьироваться (7). Хотя экспериментатор может выбрать любой объем для каждого разбавителя, чаще всего он кратен 10, что способствует логарифмическому уменьшению образца. Например, раствор0 содержит в общей сложности 100 E. coli клеток, взвешенных в 10 мл питательного бульона. Если удалить 1 мл раствора0 и добавить к 9 мл физиологического раствора (разбавитель1), то новый раствор (раствор1) будет содержать 1/10th} от первоначальной концентрации E. coli. В этом примере новое решение (solution1) будет содержать 10 E. coli. Повторение этого процесса путем удаления 1 мл раствора 1 и добавления его к другим 9 мл физиологического раствора (разбавителя2) приведет к получению раствора 2, содержащего только одну клетку E. coli. Поскольку каждый новый раствор (9 мл разбавителя + 1 мл раствора) содержит в общей сложности 10 мл, мы можем заключить, что коэффициент разбавления для этого снижения равен 10 или что это было 10-кратное серийное разведение (Рисунок 1). Поскольку в этом примере мы начали только со 100 ячеек и разбавляем в 10 раз, для достижения абсолютной минимальной концентрации в 1 ячейку требуется всего два шага. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig1.jpg"> 
Рисунок 1: Серийное разведение исходного раствора. 1 мл аликвоты исходного раствора (раствор0) добавляют в пробирку 1, которая содержит 9 мл 0,45% физиологического раствора (dilent1); Продуктом этой смеси является раствор1. Повторите, выделив 1 мл только что созданного раствора1 и добавив его в пробирку 2. Аликвотирование и ресуспендирование продолжаются таким образом до тех пор, пока не будет получена последняя пробирка, при этом концентрация материала разбавляется в 10 раз на каждом этапе. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. </a>
Серийное разведение является самым простым методом получения управляемых концентраций желаемого организма и дополняется полосами и распылением в чашке Петри, что является лишь двумя из многих методов нанесения покрытий, используемых микробиологами. Преимущество этого подхода заключается в том, что экспериментатор может собирать чистые штаммы одного вида или отдельные штаммы из смешанной популяции (7). Полосатость достигается путем введения организма в твердую среду (обычно состоящую из агарозы), на которой он будет расти при наличии соответствующих питательных веществ. Если аккуратно провести стерильной инокуляционной петлей по среде (так, чтобы осталась тонкая полоса) по жесткой синусоидальной схеме, организм будет распределен пропорционально частоте волны экспериментатора. Деление чашки Петри на три или четыре части (полоса квадранта) и уменьшение частоты каждой полосы по мере поступления в новую область чашки приведет к постепенному уменьшению количества микроорганизмов, которые могут занимать эту область, производя отдельные колонии вместо не поддающейся количественной оценке бактериальной лужайки. Раскладное покрытие дополнительно не разбавляет пробы; Стерильный стеклянный разбрасыватель используется для распределения аликвоты суспензионной среды по всей чашке Петри (Рисунок 2). Колонии, которые растут на разбрасываемой пластине, возникают из одной клетки, и каждая колония на чашке может быть подсчитана, чтобы оценить количество колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ) в данной суспензии, представленное как КОЕ/мл (6) (Рисунок 3) Мягкий агар и покрытие реплик являются вариациями вышеупомянутых методов и позволяют проводить скрининг бактериофагов и мутантов, соответственно (1,7). 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig2.jpg"> 
Рисунок 2: Полосы планшетов для подсчета бактерий и выделения штаммов. Пометьте дно чашки Петри идентификационной информацией (название бактерии, дата, носитель) и разделите на три части. После выбора соответствующего разведения исходного образца возьмите стерильную (одноразовую или пламенную) посевную петлю и погрузите в нее пробирку (в данном случае Т3). Слегка приподнимите крышку чашки Петри с одной стороны, чтобы только петля для прививки могла получить доступ к агару. Проведите петлей для прививки по верхней части фильтрующего материала зигзагообразным образом, стараясь не повредить агар. Поверните пластину примерно на 1/3rd (~118°) и уменьшите частоту зигзагообразного движения. Повернитесь в последний раз и еще раз уменьшите частоту зигзагов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. </a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig3.jpg"> 
Рисунок 3: Покрытие разворота. 1 г аэробной зоны ресуспендировали в Т1, а затем последовательно разбавляли. Стерильный стеклянный или пластиковый одноразовый стержень для распределения инокулюма по каждой посуде используется. Это повторялось с 1 г анаэробной зоны. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. </a>
Как и при серийных разведениях, для выражения концентрации в организме используется логарифмическая шкала. Количество колоний, выращенных в стандартных чашках Петри размером 100 мм х 15 мм, может быть подсчитано вручную (или автоматизировано с помощью вычислительной обработки) путем идентификации изолированных кластеров роста. Подсчеты, которые в сумме меньше 30 или больше 300, должны определяться как слишком малое для подсчета (TFTC) или слишком большое количество для подсчета (TNTC) соответственно. В последнем случае следует выполнить серийное разведение для снижения концентрации перед повторной обработкой новой чашки Петри. Усреднение числа автономных колоний, идентифицированных из трех отдельных чашек Петри, и умножение среднего на коэффициент разбавления даст КОЕ/мл; построение графика log10 КОЕ/мл в зависимости от времени покажет среднее время генерации организма (7).

Source: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1, and Christopher P. Corbo1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island ...

Иногда, чтобы идентифицировать и изучить бактерии, нам сначала нужно выделить и обогатить их из образца. Например, образцы, полученные из колонны Виноградского, являются смешанными, то есть содержат несколько видов или штаммов бактерий, поэтому изучение отдельной бактерии или перечисление различных присутствующих видов может быть сложной задачей. С этой целью обычно используются методы серийного разведения и гальванического покрытия для надежного количественного определения бактериальной нагрузки и выделения отдельных колоний. Серийное разведение представляет собой процесс, посредством которого концентрация организма, в данном примере бактерий, систематически снижается путем последовательной ресуспендирования в фиксированных объемах жидкого разбавителя. Обычно объем разбавителя кратен 10, чтобы облегчить логарифмическое восстановление организма образца. Например, один грамм осадка сначала удаляется из зоны интереса Виноградского и добавляется к 10 миллилитрам соответствующей жидкой среды. Затем один миллилитр этого первого разбавления добавляют в другую пробирку, содержащую девять миллилитров среды. Процесс можно повторять до тех пор, пока не будет получено несколько различных концентраций бактерий. Серийное разведение является ключом к перечислению бактерий в этом примере, поскольку смешанные образцы из колонки Виноградского содержат неизвестное, часто большое, количество бактерий. Далее, покрытие полосами и покрытие разброса позволяет изолировать и подсчитать бактерии в образце соответственно. Полосообразование осуществляется путем введения разведенного образца в один участок твердой среды с добавлением питательного вещества, который делится на три части. Затем этот инокулюм распределяется по каждой трети пластины зигзагообразно. Поскольку разные участки пластины испещрены, пересекаясь с предыдущим образцом только один раз, образец распределяется более тонким слоем. Это означает, что вам может понадобиться только серия от одного разведения, чтобы получить отдельные колонии на более поздних участках. После инкубации пластины с полосами позволяют наблюдать за морфологией колоний, информацию, которая может помочь дифференцировать различные виды бактерий. В качестве альтернативы, если основной целью является перечисление бактерий в образце, может быть использовано покрытие разворотом. При нанесении покрытия аликвота одного образца равномерно распределяется по всей поверхности твердой среды. Как правило, из-за того, что мы не знаем количество бактерий в смешанном образце, для каждого из разведений или репрезентативного образца для него изготавливается раскладная пластина. После инкубации перебор может быть выполнен с помощью этих раскладных планшетов. Любые пластины с числом колоний менее 30 следует отбраковывать, так как маленькие подсчеты подвержены большей погрешности. Точно так же любые подсчеты более 300 должны быть отброшены, потому что скученность и перекрытие колоний могут привести к недооценке численности колоний. Если количество колоний в каждой из этих оставшихся чаш записать и умножить на коэффициент разбавления, а затем разделить на объем пластины, то это даст колониеобразующие единицы, или КОЕ, на миллилитр суспензии. В этом видео вы узнаете, как качественно и количественно оценить образец, содержащий известную бактерию, и микробные сообщества, содержащиеся в различных областях колонны Виноградского, с помощью серийного разбавления, спредного покрытия и покрытия полос. Во-первых, наденьте все соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, перчатки и очки. Затем простерилизуйте рабочее место 70% этанолом и протрите поверхность. Далее соберите две колбы Эрленмейера объемом 500 миллилитров и пометьте одну бульоном, а другую агаром. Для приготовления раствора LB агара смешайте примерно 6,25 грамма LB агара, три грамма технического агара и 250 миллилитров дистиллированной воды в колбе с маркировкой агара. Затем приготовьте бульон LB, соединив 2. 5 грамм ЛБ среды и 100 миллилитров дистиллированной воды в колбе с маркировкой бульон. После автоклавирования колб с помощью термостойкой перчатки извлеките колбы из автоклава и поместите их на водяную баню при температуре от 40 до 50 градусов Цельсия. Как только колбы нагреются до 50 градусов по Цельсию, тщательно приготовьте три аликвоты по 100 миллилитров раствора бульона и пометьте каждый аликвотный раствор нулем. Далее соберите 10 стерильных чашек Петри и пометьте их датой, названием, типом используемой среды и зоной колонны Виноградского, из которой будут собираться организмы. Пипеткой нанесите по 15 миллилитров агара из агаровой колбы в каждую чашку Петри. Затем с помощью наконечника пипетки удалите любые пузырьки, установите на место крышки пластин и дайте им застыть на столе в течение ночи. На следующий день протрите столешницу 70% этанолом. Далее промаркируйте 10 пробирок объемом 20 миллилитров от Т1 до Т10 и поместите их в штативал. Пипеткой введите девять миллилитров 0,45% физиологического раствора в каждую пробирку. Теперь накройте каждую из 10 пробирок крышками и переложите их на штатив для пробирок, совместимый с автоклавом. После завершения цикла снимите солевые заготовки в термостойких перчатках и дайте им остыть. Храните пробирки при комнатной температуре, пока они не достигнут примерно 22 градусов по Цельсию. Чтобы культивировать известный целевой организм, E. coli в этом примере, инокулируйте 100 миллилитров нулевого раствора одной колонией из предварительно испачканной пластины. Затем накройте трубку крышкой и инкубируйте ее в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы оценить участки колонны Виноградского, добавьте к Т1 примерно один грамм материала из аэробной зоны и ресуспендируйте за счет вортексинга. Затем повторите этот процесс с одним граммом материала из анаэробной зоны. Извлеките из инкубатора пробирку, содержащую нулевой раствор, завезенный кишечной палочкой, и встряхните ее. Затем нанесите пипеткой один миллилитр раствора в пробирку Т1 и перемешайте вихрь. Удалите один миллилитр раствора из Т1 и переложите его в Т2, вортексируя для перемешивания. Повторите этот процесс через трубку Т10. Чтобы оценить аэробную и анаэробную зоны колонны Виноградского, удалите по одному миллилитру раствора из каждой из ранее подготовленных пробирок Т1 и перенесите его в соответствующие пробирки Т2. Затем продолжите последовательное разведение через пробирки T10, как было показано ранее. Чтобы распределить планшет, нанесите пипеткой 100 микролитров разведенного образца из каждой пробирки Т3 на соответствующую чашку Петри. Затем с помощью стерильного размазывающего стержня аккуратно распределите образец по чашке Петри и установите на место крышку тарелки. Повторите этот процесс для разведений Т6 и Т9, как было показано ранее. Инкубируйте планшеты, содержащие аэробные организмы, в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Инкубируйте планшеты, содержащие анаэробные организмы, в анаэробной камере, установленной при температуре 37 градусов Цельсия, в течение 24 часов. На следующий день снимите планшеты для разведения Т3, Т6 и Т9 из инкубатора и анаэробной камеры и перенесите их на столешницу. Работая с одной пластиной за раз, проведите стерильной инокуляционной петлей по верхней части носителя зигзагообразным образом. Затем установите на место крышку чашки Петри. Далее поверните пластину на 1/3 и простерилизуйте петлю, чтобы уменьшить частоту ранее сделанного зигзагообразного узора. Опять же, после стерилизации петли, поверните тарелку на 1/3, уменьшите частоту зигзагообразного узора в последний раз и установите крышку на место. Повторите этот метод полос для остальных пластин, как показано ранее. Затем поместите полосатые пластины, содержащие аэробные организмы, в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на ночь, а полосатые пластины, содержащие анаэробные организмы, в анаэробную камеру, установленную при температуре 37 градусов Цельсия, на ночь. Культура была собрана в аэробной и анаэробной зонах семидневной колонны Виноградского. Затем культуры последовательно разбавляли перед нанесением полос и рассыпанием на агаровых пластинах LB. Стрикинг выявил смешанную популяцию из каждой из оцененных зон Виноградского, и спредные пластины дали аналогичные результаты. Пластина, на которой образовалась полоса от смешанной популяции, приведет к появлению колоний бактерий разных форм, размеров, текстур и цветов. Напротив, испещренные и распростертые пластины, содержащие известный микроорганизм, E. coli, продемонстрировали гомологичную популяцию. Как правило, лучше всего рассчитывать КОЕ на миллилитр, используя среднее количество колоний из трех планшетов, распределенных с одной и той же пробой и коэффициентом разбавления. Умножьте среднее количество колоний на коэффициент разбавления и разделите на количество аликвот. Наконец, изолированные колонии, выбранные из каждой пластины, могут быть использованы в дальнейших анализах обогащения для определения видовой идентичности.

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Продвинутый курс биологии

Microbiology

Микробиология

counting bacteria with dilution plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs.

Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed volume of diluent, or blank, such as 0.45% saline. When 1 mL is transferred into 9 mL of saline, the sample is diluted 10-fold. Repeating that step again lowers the concentration even more, and only two steps are needed in the example of 100 E. coli cells to reach a single cell.

Plating methods help separate microorganisms and make colonies visible. Streaking uses a sterile inoculating loop on agar, a solid growth medium, to spread cells across the plate. In a quadrant streak, the plate is divided into thirds or fourths, and each new area is streaked less often so fewer cells land there. This can produce single colonies instead of a bacterial lawn and can help isolate a pure strain from a mixed sample.

Spread plating uses a sterile glass spreader to distribute an aliquot over the whole petri dish. This method does not add another dilution step. The colonies that grow are counted as colony forming units, or CFU, which are reported as CFU/mL. Soft agar and replica plating are related methods. They can be used for bacteriophage isolation and mutant screening.

Colony counts are usually done on standard 100 mm by 15 mm petri dishes. Isolated colonies can be counted by hand or with computer tools. Plates with fewer than 30 colonies are too few to count, or TFTC. Plates with more than 300 colonies are too numerous to count, or TNTC. If a plate is TNTC, another serial dilution should be done before restreaking a new plate.

To estimate CFU/mL, scientists average the number of colonies from three separate plates and multiply by the dilution factor. The same log scale used in dilution work also helps show how organism concentration changes over time. Plotting log10 CFU/mL against time can reveal the mean generation time of the organism.

Counting Bacteria with Dilution Plates

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

This collection demonstrates the key tools of microbiological investigation, including proper sterile technique and plating, how to use selective media and enrich samples, and culturing methods for mixed or pure samples. Additionally, it looks at common methods for identifying microbial isolates, as well as procedures for the genetic manipulation of bacteria.

Learn how serial dilution, streaking, and spread plating help scientists count bacteria, isolate colonies, and estimate CFU/mL in lab samples.

Counting Bacteria with Dilution Plates

Description

Transcript