Name: calcium chloride dna uptake in e. coli
Uploaded: 2023-04-30T07:10:31.000Z
Duration: 10 min 54 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Florida Department of Education

High School

Life Science

SC.912.L.16

SC.912.L.16.7

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

В этом протоколе описывается получение и трансформация компетентного E. coli DH5α с использованием адаптации метода хлорида кальция (12). 
1. Настройка
<ol>
	<li>Оборудование
	<ul>
		<li>Спектрофотометр</li>
		<li>Центрифуга Сорвал (или аналогичная)</li>
		<li>Настольная центрифуга</li>
		<li>Тепловой блок или водяная баня</li>
		<li>Орбитальный встряхиватель</li>
		<li>Стационарный инкубатор</li>
		<li>Лоток для литья геля</li>
		<li>Колодцы гребни</li>
		<li>Источник напряжения</li>
		<li>Гелевая коробка</li>
		<li>Источник ультрафиолетового излучения</li>
		<li>Микроволновая печь</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Растворы и реагенты
	<ul>
		<li>Бульон Лурии-Бертани (LB) (10 г казеинового ферментного гидролизата, 5 г дрожжевого экстракта и 5 г хлорида натрия в 1000 мл H2O)</li>
		<li>Супер оптимальный бульон с подавлением катаболитов (SOC): (2% (w/v) триптон, 0,5% (w/v) экстракт дрожжей, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, и 20 мМ глюкозы)</li>
		<li>CaCl2-MgCl2 (80 мМ MgCl2, 20 мМ CaCl2) раствор. </li>
		<li>M CaCl2 раствор (если клетки будут трансформироваться немедленно) или 0,1M раствор CaCl2, содержащий 10% (v/v) глицерина (если клетки будут заморожены для дальнейшего использования). </li>
		<li>Пластины для агара LB</li>
		<li>Селективные пластины из агара LB (для этого эксперимента, поскольку используемая плазмида обеспечивает устойчивость к ампициллину, использовали агаровые пластины LB, содержащие ампициллин 100 г/мл)</li>
		<li>E. coli штамм DH5α</li>
		<li>ДНК плазмиды pUC19 (100 пг/мкл)</li>
		<li>QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)</li>
		<li>Фермент рестрикции HindIII</li>
		<li>1 кб плюс лестница ДНК</li>
		<li>Низкая температура плавления Agarose</li>
		<li>1X буфер TAE (40 мМ трис основания, 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА)</li>
		<li>Бромид этидия (10 мг/мл)</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Общие указания по технике безопасности 
	E. coli DH5α классифицируется как уровень биобезопасности 1 (BSL1). Микробы этой категории практически не представляют угрозы инфицирования у здоровых взрослых. Однако требуются осторожные манипуляции с микроорганизмом. </li>
</ol>
ВАЖНО: Все шаги в этом протоколе должны выполняться с использованием асептических методов и при температуре льда или 4°C, если это не указано. 
2. Протокол
<ol>
	<li>Из замороженного бульона E. coli DH5α (замороженного в 20% глицерине из культуры, выращенной на ночь в LB) выделите бактерии для выделения на агаровой пластине LB. Инкубировать при температуре 37°C в течение ночи (16-20 часов). </li>
	<li>Внесите одну колонию в 3 мл бульона LB в пробирке. Растите встряхивание при 210 об/мин при 37°C в течение ночи (16-20 часов). </li>
	<li>Измерьте OD600 для ночной культуры. Используйте ночную культуру для инокуляции 100 мл LB бульона в 1-литровую колбу до OD600 = 0,01. Инкубируйте культуру, энергично встряхивая (210 об/мин) при 37°C, контролируя OD600 в спектрофотометре каждые 15-20 минут, до тех пор, пока культура не достигнет OD600=0,35 (примерно 3 часа). 
	ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы трансформация была эффективной, бактериальные клетки должны находиться в фазе среднего экспоненциального роста. Максимальное количество клеток должно составлять 108 клеток/мл, что для большинства штаммов E. coli соответствует OD600=0,4. Использование спектрофотометра позволяет измерить OD600, что позволяет определить, что клетки находятся на соответствующей стадии роста. Если этот протокол будет использоваться для других штаммов бактерий, для определения этого соотношения потребуется калибровка для определения количества колоний, образующих единицы при определенных значениях OD600. </li>
	<li>Перелейте по 50 мл культуры в каждую из 2 ледяных полипропиленовых бутылок центрифуги. Поставьте бутылки на лед на 20 минут, чтобы они остыли. </li>
	<li>Восстановите клетки центрифугированием при 2700g (4100 об/мин в роторе Sorval GSA) в течение 10 мин при 4°C. </li>
	<li>Удалите надосадочную жидкость. Слейте последние следы среды, поставив бутылку вверх дном на подушечку или бумажное полотенце. </li>
	<li>Ресуспендируйте каждую бактериальную гранулу в 30 мл CaCl2-MgCl2 (80 мМ MgCl2, 20 мМ CaCl2) ледяного раствора. Сначала добавьте 5 мл раствора, осторожно перемешайте до полного растворения гранулы, а затем добавьте оставшиеся 25 мл раствора. </li>
	<li>Повторите шаг 2.4. </li>
	<li>Повторите шаг 2.5. </li>
	<li>Если компетентные клетки собираются трансформироваться напрямую, повторно суспендируйте каждую бактериальную гранулу в 2 мл ледяного раствора CaCl2 (0,1 М), осторожно вращая пробирки. Если при этом методе гранула не подвергается ресуспендированию, повторно суспендируйте, осторожно пипетируя вверх и вниз (избегая образования пузырьков). 
	В качестве альтернативы компетентные клетки могут быть заморожены и сохранены для последующего использования. Чтобы получить замороженные запасы компетентных клеток, повторно суспендируйте гранулу в 2 мл 0,1М раствора CaCl2, содержащего 10% (v/v) глицерина. Это решение должно быть ледяным. Суспензия аликвотных клеток в ледяные полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл (160 мкл на пробирку). Немедленно заморозьте компетентные клетки в ванне с сухим льдом и этанолом. Переложите пробирки в морозильную камеру при температуре -70°C. </li>
	<li>Чтобы трансформировать клетки, обработанные CaCl2, перенесите 50 мл компетентных клеток в каждую из 2 полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл. Добавьте 1 мкл (100 пг) плазмидной ДНК pUC19 в одну из пробирок и оставьте вторую пробирку без ДНК (отрицательный контроль). Аккуратно перемешайте (не допускайте образования пузырьков). Выдерживать 30 минут на льду. 
	ПРИМЕЧАНИЕ: При преобразовании следует использовать не более 50 нг ДНК в объеме 10 мкл или менее. </li>
	<li>Перенесите трубки в нагревательный блок и инкубируйте при температуре 42°C ровно 45 с. 
	ПРИМЕЧАНИЕ: Тепловой шок является критическим этапом. Не превышайте температуру или время инкубации. </li>
	<li>Легко перекладывайте трубки на лед. Инкубировать в течение 2 мин.</li>
	<li>Добавьте 950 мкл среды SOC и инкубируйте пробирки в течение 1 часа при 37°C, чтобы позволить бактериям восстановиться и экспрессировать устойчивый к антибиотикам маркер, закодированный в плазмиде. </li>
	<li>Разведите 10 мкл клеточной суспензии в 1000 мкл в SOC (разведение 1/100) и 100 мкл клеточной суспензии в 1000 мкл в SOC (разведение 1/10). Нанесите 100 мкл разведений, а также контроль, на селективные планшеты и распределите с помощью шпателя. Как правило, осаждение на 100 мкл разведения 1/100 и 1/10 дает достаточное количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на пластину. В идеале это число должно находиться в пределах 30-300 КОЕ, чтобы было достаточно колоний, но отделенных друг от друга. Однако количество КОЕ будет зависеть от эффективности преобразования (см. раздел «Анализ данных и результаты»). </li>
	<li>Инкубируйте планшеты при 37°С. Трансформированные колонии должны появиться через 12-16 часов (этот диапазон будет зависеть от штамма клетки и метода отбора). Никакие колонии не должны расти в отрицательном контроле. </li>
	<li>Подсчитайте cfu/plate, полученные для преобразования (Таблица 1). </li>
	<li>Чтобы убедиться, что трансформанты содержат плазмиду pUC19, будет выполнен плазмидный препарат и последующее разложение. Для этого закаляйте одну колонию в 3 мл бульона LB в пробирке. Растите встряхивание при 210 об/мин при 37°C в течение ночи (16-20 часов). </li>
	<li>Приготовьте плазмидный препарат с помощью набора QIAprep Spin Miniprep Kit, согласно инструкции от производителя. </li>
	<li>Расщепите 1 г очищенного pUC19 с ферментом рестрикции HindIII при 37°C в течение 1 часа. 
	ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага можно использовать любой фермент, который разрезает сайт множественного клонирования pUC19. </li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Компонент</td>
			<td>Сумма</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X буфер дайджеста ограничений</td>
			<td>2.5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Плазмида pUC19</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>20,5 мкл (до 25 мкл)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="21">
	<li>Проведите молекулярно-массовую лестницу, расщепленную ДНК pUC19 и такое же количество непереваренной ДНК pUC19 в 1% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромида этидия, в течение 1 часа при 95 В. 
	ПРИМЕЧАНИЕ: время и напряжение будут варьироваться в зависимости от используемого оборудования. </li>
	<li>Визуализируйте гель под воздействием ультрафиолета. Сравните размер переваренной и непереваренной ДНК pUC19 (Рисунок 2) (см. раздел «Анализ данных и результаты»). 
	Выполните необходимые шаги, необходимые для проверки преобразования в соответствии с целью каждого конкретного эксперимента по преобразованию. </li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig2.jpg"> 
Рисунок 2: Расщепление восстановленной плазмидной ДНК из трансформированных клеток DH5α. Плазмидную ДНК извлекали из трансформированных клеток DH5α, расщепляли с помощью HindIII, запускали в 1% агарозном геле и визуализировали с помощью УФ-источника (шаги 2.19 - 2.22). 
3. Анализ данных и результаты
Для расчета эффективности трансформации, показателя того, насколько хорошо клетки усваивают внеклеточную ДНК, необходимо подсчитать колонии, полученные в результате трансформации:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Разбавление</td>
			<td>Cfu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/100</td>
			<td>34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/10</td>
			<td>246</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Таблица 1: Колониеобразующие единицы (КОЕ), подсчитанные по результатам эксперимента по трансформации. 
Эффективность трансформации (TE) — это мера количества КОЕ, полученного в результате преобразования 1 г плазмиды в заданный объем компетентных клеток. На эффективность трансформации влияют многие параметры: размер плазмиды, генотип клетки, стадия роста при подготовке компетенций, методы трансформации и т.д.). При расчете TE важно учитывать, какое разведение (если таковое было) было выполнено перед нанесением покрытия, и включить его в расчет общего количества КОЕ. Эффективность преобразования (TE) рассчитывается с помощью следующего уравнения:
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq1.jpg">
Сначала разделите КОЕ на μг ДНК, в данном примере 0,0001μg. Затем разделите полученный результат на коэффициент разбавления. В этом примере использовали разведение 1/10 и наносили 100 мкл раствора объемом 1 мл (разведение: 1/10 × 100 мкл /1000 мкл = 0,01). 
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq2.jpg">

Трансформация является мощным методом введения экзогенной ДНК в бактериальные клетки, который является ключом ко многим приложениям молекулярной биологии в лаборатории. Кроме того, он играет важную роль в природе, позволяя бактериальным клеткам обмениваться генетическим материалом, что может привести к увеличению генетической изменчивости и позволить приобрести различные полезные черты для выживания в широком диапазоне условий. Многие штаммы бактерий кодируют гены, необходимые для естественной компетентности. Тем не мене...

Трансформация клеток e. coli с использованием адаптированной процедуры с хлоридом кальция

Источник: Наталья Мартин1, Эндрю Дж. Ван Альст1, Рианнон М. ЛеВек1, и Виктор Дж. ДиРита1 
1 Факультет микробиологии и молекулярной генетики, Университет штата Мичиган
Бактерии обладают способностью обмениваться генетическим материалом (дезоксирибонуклеиновой кислотой, ДНК) в процессе, известном как горизонтальный перенос генов. Включение экзогенной ДНК обеспечивает механизм, с помощью которого бактерии могут приобретать новые генетические признаки, позволяющие им адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды, таким как наличие антибиотиков или антител (1) или молекул, найденных в естественной среде обитания (2). Существует три механизма горизонтального переноса генов: трансформация, трансдукция и конъюгация (3). Здесь мы сосредоточимся на трансформации, способности бактерий поглощать свободную ДНК из окружающей среды. В лаборатории процесс трансформации состоит из четырех основных этапов: 1) Подготовка компетентных клеток, 2) Инкубация компетентных клеток с ДНК, 3) Восстановление клеток и 4) Покрытие клеток для роста трансформантов (Рисунок 1). 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig1.jpg"> 
Рисунок 1: Общие этапы процесса трансформации. Процесс трансформации состоит из четырех основных этапов: 1) Подготовка компетентных клеток, 2) Инкубация с ДНК, 3) Восстановление клеток и 4) Подготовка клеток к росту трансформантов. 
Чтобы трансформация произошла, бактерия-реципиент должна находиться в состоянии, известном как компетентность. Некоторые бактерии обладают способностью становиться естественно компетентными в ответ на определенные условия окружающей среды. Однако многие другие бактерии не становятся компетентными естественным путем, или условия для этого процесса пока неизвестны. Возможность введения ДНК в бактерии имеет ряд исследовательских применений: для создания нескольких копий интересующей молекулы ДНК, для экспрессии большого количества белков, в качестве компонента в процедурах клонирования и другие. Из-за важности трансформации для молекулярной биологии, существует несколько протоколов, направленных на создание искусственно компетентных клеток, когда условия для естественной компетентности неизвестны. Для получения искусственно компетентных клеток используются два основных метода: 1) путем химической обработки клеток и 2) воздействие на клетки электрических импульсов (электропорация). Первый использует различные химические вещества в зависимости от процедуры для создания притяжения между ДНК и поверхностью клетки, в то время как второй использует электрические поля для создания пор в мембране бактериальной клетки, через которые молекулы ДНК могут проникать. Наиболее эффективным подходом для химической компетентности является инкубация с двухвалентными катионами, в первую очередь с кальцием (Ca2+) (4,5) Кальций-индуцированная компетентность - это процедура, которая будет описана здесь (6). Этот метод в основном используется для трансформации грамотрицательных бактерий, и это будет основным направлением данного протокола. 
Процедура химической трансформации включает в себя ряд этапов, в ходе которых клетки подвергаются воздействию катионов для индуцирования химической компетентности. За этими шагами следует изменение температуры - тепловой шок - который способствует поглощению чужеродной ДНК компетентной клеткой (7). Оболочки бактериальных клеток заряжены отрицательно. У грамотрицательных бактерий, таких как Escherichia coli, внешняя мембрана отрицательно заряжена из-за присутствия липополисахарида (ЛПС) (8). Это приводит к отталкиванию аналогично отрицательно заряженных молекул ДНК. При индукции химической компетентности положительно заряженные ионы кальция нейтрализуют это отталкивание, обеспечивая поглощение ДНК на поверхности клетки (9). Обработка кальцием и инкубация с ДНК производятся на льду. Затем проводится инкубация при более высоких температурах (42°C), тепловой шок. Этот температурный дисбаланс еще больше способствует поглощению ДНК. Бактериальные клетки должны находиться в среднеэкспоненциальной фазе роста, чтобы выдержать лечение тепловым шоком; На других стадиях роста бактериальные клетки слишком чувствительны к теплу, что приводит к потере жизнеспособности, что значительно снижает эффективность трансформации. 
Для трансформации можно использовать различные источники ДНК. Как правило, плазмиды, небольшие круглые двухцепочечные молекулы ДНК, используются для трансформации в большинстве лабораторных процедур у E. coli. Чтобы плазмиды сохранялись в бактериальной клетке после трансформации, они должны содержать источник репликации. Это позволяет им реплицироваться в бактериальной клетке независимо от бактериальной хромосомы. Не все бактериальные клетки преображаются во время процедуры трансформации. Таким образом, трансформация дает смесь трансформированных и нетрансформированных клеток. Чтобы различить эти две популяции, используется метод отбора для идентификации клеток, которые приобрели плазмиду. Плазмиды обычно содержат селективные маркеры, которые представляют собой гены, кодирующие признак, дающий преимущество для роста (например, устойчивость к антибиотикам или химическим веществам или спасение от ауксотрофии роста). После трансформации бактериальные клетки помещаются на селективную среду, которая позволяет только расти трансформированным клеткам. В случае клеток, трансформированных с помощью плазмиды, придающей устойчивость к данному антибиотику, селективной средой будет питательная среда, содержащая этот антибиотик. Несколько различных методов могут быть использованы для подтверждения того, что колонии, выращенные в селективной среде, являются трансформантами (т.е. инкорпорировали плазмиду). Например, плазмиды могут быть извлечены из этих клеток с помощью методов препарирования плазмид (10) и расщеплены для подтверждения размера плазмиды. В качестве альтернативы для подтверждения наличия интересующей плазмиды можно использовать ПЦР с колониями (11). 
Целью данного эксперимента является получение E. coli DH5α химически компетентных клеток, используя адаптацию метода с хлоридом кальция (12), и их трансформация с помощью плазмиды pUC19 для определения эффективности трансформации. Штамм E. coli DH5α является широко используемым штаммом в молекулярной биологии. Благодаря своему генотипу, в частности recA1 и endA1, этот штамм обеспечивает повышенную стабильность вставки и улучшает качество плазмидной ДНК в последующих препаратах. Поскольку эффективность трансформации снижается с увеличением размера ДНК, в этом протоколе была использована плазмида pUC19 из-за ее малого размера (2686 п.н.) (векторную карту см. в https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html). pUC19 придает устойчивость к ампициллину, и, таким образом, именно этот антибиотик использовался для селекции.

Несмотря на то, что ТЭ зависит от многих факторов, некоммерческие компетентные клеточные препараты, подобные этому, обычно дают от 106} до 107} трансформантов на микрограмм плазмиды. Таким образом, этот препарат с TE = 2,46 x 108 КОЕ/μг дал TE значительно выше ожидаемого диапазона. Существуют дополнительные протоколы для создания сверхкомпетентных ячеек, когда для данного приложения требуется более высокая эффективность преобразования (13)...

Трансформация клеток E. coli с использованием адаптированной процедуры с хлоридом кальция

Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, and Victor J. DiRita1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan ...

Бактерии удивительно легко приспосабливаются, и одним из механизмов, который способствует этой адаптации, является их способность поглощать внешние молекулы ДНК. Один из типов ДНК, который могут поглощать бактерии, называется плазмидой, кольцевым участком ДНК, который часто содержит полезную информацию, такую как гены устойчивости к антибиотикам. Процесс модификации бактерий с помощью новой генетической информации, полученной из внешнего источника, называется трансформацией. Трансформацию можно легко провести в лабораторных условиях с использованием кишечной палочки, или кишечной палочки. Для того, чтобы трансформироваться, клетки E. coli должны быть сначала сделаны компетентными, то есть способными поглощать молекулы ДНК из окружающей среды. Протокол для этого удивительно прост — короткая инкубация клеток в растворе хлорида кальция. Эта инкубация приводит к тому, что клетки становятся проницаемыми для молекул ДНК. После того, как клетки гранулируются центрифугированием, надосадочная жидкость удаляется. Теперь плазмидная ДНК добавляется к компетентным клеткам. После инкубации клеток с ДНК смесь кратковременно нагревают до 42 градусов Цельсия с последующим быстрым охлаждением на льду. Этот тепловой шок приводит к тому, что ДНК переносится через клеточную стенку и мембраны. Затем клетки инкубируются в свежих средах. Затем бактерии помещают под температурой 37 градусов, чтобы они могли повторно запечатать свои мембраны и экспрессировать устойчивые белки. Те клетки, которые впитали плазмиды, будут точно копировать ДНК и передавать ее своему потомству, а также экспрессировать любые белки, которые могут быть закодированы ею, включая медиаторы устойчивости к антибиотикам. Эти гены резистентности могут быть использованы в качестве селективных маркеров для идентификации бактерий, которые были успешно преобразованы, потому что клетки, не поглотившие плазмиду, не будут экспрессировать продукт гена резистентности. Это означает, что когда клетки помещаются в твердую среду, содержащую соответствующий антибиотик, будут расти только клетки, которые впитали плазмиду. Трансформация клеток в растущей колонии может быть дополнительно подтверждена путем культивирования этих клеток в жидких средах в течение ночи для увеличения выхода перед извлечением ДНК из образца. После того, как ДНК выделена, можно провести диагностическое расщепление фермента рестрикции. Поскольку ферменты рестрикции разрезают ДНК в предсказуемых местах, запуск этих расщеплений на геле должен показать предсказуемую картину, если желаемая плазмида была успешно преобразована. Например, если pUC19 получают и разрезают с помощью фермента рестрикции HindIII, на геле должна быть видна одна полоса из 2686 нуклеотидов. В этой лаборатории вы трансформируете штамм E. coli DH-5 Alpha с pUC19, а затем подтвердите успешную трансформацию с помощью гель-электрофореза ДНК. Перед началом процедуры наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, в том числе лабораторный халат и перчатки. Далее простерилизуйте рабочее место с помощью 70% этанола. Теперь подготовьте химически компетентные клетки, поместив петлю с бактериями на стерильную пластину из агара LB и заполнив бактерии новой петлей. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день снова простерилизуйте столешницу 70% этанолом и достаньте тарелку из инкубатора. Инокулируйте одну, хорошо изолированную колонию в 3 миллилитра бульона LB в пробирке со стерильной петлей. Затем выращивайте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи с встряхиванием при 210 оборотах в минуту. На следующий день измерьте оптическую плотность ночной культуры с помощью спектрофотометра. Затем добавьте 100 миллилитров бульона LB в литровую колбу и заквашите его ночной культурой при оптической плотности 0. 01. Теперь инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием и проверяйте OD600 каждые 15-20 минут, пока культура не достигнет среднеэкспоненциальной фазы роста. Примерно через три часа перелейте 50 миллилитров культуры в две ледяные полипропиленовые бутылки. Затем поставьте бутылки обратно на лед на 20 минут, чтобы они остыли. Затем восстановите клетки с помощью центрифугирования. Выбросьте надосадочную жидкость и поставьте флаконы вверх дном на бумажное полотенце. Затем повторно суспендируйте бактериальную гранулу в пяти миллилитрах ледяного раствора хлорида кальция и магния и осторожно взбейте до полного растворения гранулы. Затем добавьте еще 25 миллилитров раствора в растворенную бактериальную гранулу. Повторно суспендируйте другую бактериальную гранулу, как показано ранее. После этого повторите центрифугирование, и удалите надосадочную жидкость. Если компетентные клетки будут трансформироваться напрямую, ресуспендируйте каждую бактериальную гранулу в двух миллилитрах ледяного 0,1 молярного раствора хлорида кальция, осторожно вращая трубки. Чтобы начать процедуру трансформации, перенесите 50 микролитров компетентных клеток в две меченые полипропиленовые трубки объемом 1,5 миллилитров. Затем добавьте один микролитр плазмидной ДНК pUC19 в одну из пробирок. Аккуратно перемешайте, не допуская образования пузырьков, и инкубируйте обе пробирки в течение 30 минут на льду. После инкубации перенесите трубки в тепловой блок и инкубируйте при температуре 42 градуса Цельсия в течение 45 секунд. Сразу же переложите трубки в лед, и выдерживайте в течение двух минут. Теперь добавьте 950 микролитров среды SOC в каждую пробирку и инкубируйте их в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы позволить бактериям восстановиться и экспрессировать устойчивый к антибиотикам маркер, закодированный в плазмиде. Чтобы сделать разведение 1 к 100, добавьте в пробирку объемом 1,5 миллилитра 990 микролитров среды SOC и 10 микролитров клеточной суспензии. Затем сделайте разведение 1 к 10, добавив 900 микролитров среды SOC и 100 микролитров клеточной суспензии в 1,5 миллилитровую пробирку. Затем нанесите 100 микролитров разбавленных клеточных суспензий и 100 микролитров отрицательного контроля на отдельные селективные планшеты, содержащие ампициллин, с помощью разбрасывателя и инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12-16 часов. После инкубации подсчитайте колониеобразующие единицы, или КОЕ, на каждой пластине, полученной в результате преобразования, и запишите эти данные. Чтобы убедиться в том, что трансформанты содержат плазмиду pUC19, выберите одну, хорошо изолированную колонию из планшета со стерильной петлей и введите ее в пробирку, содержащую 3 миллилитра бульона LB. Затем инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение ночи. На следующий день используйте мини-набор для подготовки ДНК, чтобы выделить ДНК из 3 миллилитров культуры, согласно инструкциям производителя. После завершения подготовки ДНК расщепите 1 микрограмм очищенного pUC19 с помощью фермента рестрикции при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1 часа. Теперь загрузите 20 микролитров молекулярной лестницы, 1 микрограмм переваренной плазмидной ДНК и 1 микрограмм непереваренной плазмидной ДНК в последовательные лунки 1%-ного агарозного геля, содержащего 1 микрограмм на миллилитр бромида этидия. Затем запустите гель в течение 1 часа при напряжении 95 вольт. Наконец, визуализируйте гель с помощью ультрафиолетового осветителя. В этом эксперименте химически компетентные клетки E. coli DH5 Alpha были получены с использованием адаптации метода хлорида кальция, а затем трансформированы плазмидой pUC19 для определения эффективности трансформации. Чтобы рассчитать эффективность преобразования, используйте записанные значения КОЕ для разведений 1 из 100 и 1 из 10, а также любые другие разведения с числом КОЕ от 30 до 300. Во-первых, зарегистрированное количество КОЕ, 246 в этом примере, делится на количество ДНК, 0,0001 микрограмма, которая была нанесена. Затем это число делится на коэффициент разбавления, используемый для получения эффективности преобразования в КОЕ на микрограмм. В данном примере использовали разведение от 1 до 10 и наносили 100 микролитров раствора объемом 1 миллилитр, что давало итоговый коэффициент разбавления 0,01. В непереваренной плазмидной полосе кольцевая ДНК может проявляться в виде двух или трех различных полос различной яркости. Это связано с тем, что круглая, неразрезанная ДНК может существовать в нескольких различных конформационных состояниях, таких как суперспиральная, разомкнутая круга или более линейная, и каждое из них движется через гель с разной скоростью. Анализ расщепления ДНК восстановленной плазмиды показал, что используемая плазмида имеет ожидаемый размер ДНК pUC19, 2686 пар оснований.

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Продвинутый курс биологии

Microbiology

Микробиология

calcium chloride dna uptake in e. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency.

Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation. Transformation is the process in which bacteria take up free DNA from the environment. In the lab, it usually includes four steps: preparing competent cells, mixing cells with DNA, recovering the cells, and plating them so transformants can grow.

For transformation to occur, cells must be competent, which means they can take in DNA. Some bacteria become naturally competent under certain conditions. Others do not, or the conditions are not known. For that reason, scientists often make cells artificially competent. Two common approaches are chemical treatment and electroporation, which uses electric pulses to open pores in the cell membrane.

This protocol uses calcium ions, especially Ca2+, to create chemical competence. It is mainly used with Gram-negative bacteria. E. coli cells and their outer membrane carry negative charge, and DNA is also negatively charged. Calcium helps neutralize this repulsion so DNA can attach to the cell surface. The cells and DNA are kept on ice during this step, and then a heat shock at 42°C helps drive DNA into the cells.

The cells must be in mid-exponential growth phase before heat shock. At other growth stages, they are more sensitive to heat and may lose viability. That lowers transformation efficiency. The DNA used for transformation is usually a plasmid, which is a small circular double-stranded DNA molecule. To stay in the cell after transformation, the plasmid must have an origin of replication so it can copy itself independently of the bacterial chromosome.

Not every cell becomes transformed, so the result is a mix of transformed and non-transformed cells. To find the cells that received the plasmid, the procedure uses selection. Plasmids often carry selectable markers, such as antibiotic resistance genes or genes that rescue a growth need. After transformation, the cells are plated on selective media. In this case, the media contains ampicillin, which allows only the transformed cells to grow.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

This collection demonstrates the key tools of microbiological investigation, including proper sterile technique and plating, how to use selective media and enrich samples, and culturing methods for mixed or pure samples. Additionally, it looks at common methods for identifying microbial isolates, as well as procedures for the genetic manipulation of bacteria.

See how calcium chloride makes E. coli competent for DNA uptake, then use heat shock and ampicillin selection to identify transformants.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli | JoVE K12

Natalia Martin

Andrew J. Van Alst

Rhiannon M. LeVeque

Victor J. DiRita

Department of Microbiology and Molecular Genetics

Michigan State University

Concepts

Performing the Experiment

Results

Genetic Lingo

Overview

An organism is diploid if it inherits two variants, or alleles, of each gene, one from each parent. These two alleles constitute the genotype ...

Punnett Squares

Overview

A Punnett square displays the possible genotypes offspring can inherit from two parental genotypes. If a trait&#x2019;s inheritance pattern ...

Monohybrid Crosses

Overview

In the 1850s and 1860s, Gregor Mendel investigated inheritance by performing monohybrid crosses in pea plants. He crossed two plants that were ...

Dihybrid Crosses

Overview

To determine whether traits are inherited together or separately, Gregor Mendel crossed pea plants that differed in two traits. These parental ...

Law of Segregation

When crossing pea plants, Mendel noticed that one of the parental traits would sometimes disappear in the first generation of offspring, called the F1 ...

Law of Independent Assortment

While Mendel&#x2019;s Law of Segregation states that the two alleles for one gene are separated into different gametes, a different question of how ...

Test Cross

Alleles are different forms of the same gene. Humans and other diploid organisms inherit two alleles of every gene, one from each parent.

An allele is ...

Pedigree Analysis

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Use Mendel's laws of segregation and independent assortment to analyze patterns of inheritance.

SC.912.L.16.1

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

Multiple Allele Traits

Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

Lethal Alleles

Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

Discuss observed inheritance patterns caused by various modes of inheritance, including dominant, recessive, codominant, sex-linked, polygenic, and multiple alleles.

SC.912.L.16.2

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Describe the basic process of DNA replication and how it relates to the transmission and conservation of the genetic information.

SC.912.L.16.3

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

Mutations

Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

Mutation, Gene Flow, and Genetic Drift

In a population that is not at Hardy-Weinberg equilibrium, the frequency of alleles changes over time. Therefore, any deviations from the five conditions ...

Explain how mutations in the DNA sequence may or may not result in phenotypic change. Explain how mutations in gametes may result in phenotypic changes in offspring.

SC.912.L.16.4

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

RNA Structure

The basic structure of RNA consists of a string of ribonucleotides attached by phosphodiester bonds. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

Types of RNA

Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs perform diverse ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Bacterial RNA Polymerase

Eukaryotic RNA Polymerases

General Transcription Factors

Tissue-specific transcription factors contribute to diverse cellular functions in mammals. For example, the gene for beta globin, a major component of ...

RNA Polymerase II Accessory Proteins

Transcription Elongation Factors

pre-mrna-processing-modification-of-pre-mrna-ends

Pre-mRNA Processing: Modification of pre-mRNA Ends

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Pre-mRNA Processing: RNA Splicing

Transfer RNA Synthesis

Ribosomal RNA Synthesis

The Nucleolus

Additional Subnuclear Structures

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

Improving Translational Accuracy

Nonsense-mediated mRNA Decay

Molecular Chaperones and Protein Folding

The Proteasome

Regulated Protein Degradation

Proteins: From Genes to Degradation

Explain the basic processes of transcription and translation, and how they result in the expression of genes.

SC.912.L.16.5

Chromatin Structure and RNA Splicing

Alternative RNA Splicing

Nuclear Export of mRNA

Discuss the mechanisms for regulation of gene expression in prokaryotes and eukaryotes at transcription and translation level.

SC.912.L.16.6

Molecular Cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

Recombineering and Gene Targeting

One of the most widely used tools in modern biology is molecular cloning with restriction enzymes, which create compatible ends between DNA fragments that ...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

Bacterial Transformation: Electroporation

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

CRISPR

Bacterial Transformation

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

Bacterial Transformation
ExpandFirst, ensure that each student or student group has a filled ice bucket.
Then, set up a tube rack for each work station.
...

Bacterial Transformation
ExpandIMPORTANT: In addition to wearing the appropriate personal protective equipment, be sure to take care to keep your face ...

Describe how viruses and bacteria transfer genetic material between cells and the role of this process in biotechnology.

A. DNA stores and transmits genetic information. Genes are sets of instructions encoded in the structure of DNA.

B. Genetic information is passed from generation to generation by DNA in all organisms and accounts for similarities in related individuals.

C. Manipulation of DNA in organisms has led to commercial production of biological molecules on a large scale and genetically modified organisms.

D. Reproduction is characteristic of living things and is essential for the survival of species.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards