Name: dna extraction, quantification, and cutting
Uploaded: 2019-01-31T09:26:45.000Z
Duration: 4 min 46 s
Channel: JoVE

K12 Standards

north-carolina-k-12-science-standard-course-of-study

North Carolina K-12 Science Standard Course of Study

9-12

Biology

heredity-inheritance-and-variation-of-traits

Heredity- Inheritance and Variation of Traits

LS.Bio.8.1

dna-isolation-and-restriction-enzyme-analysis

DNA Isolation and Restriction Enzyme Analysis

Экстракция ДНК – это удаление и очистка ДНК из клеток. Во-первых, клетки лизируются - вскрываются - обычно с помощью комбинации физического разрушения и обработки химическими веществами, такими как моющее средство, которое растворяет клетку и ядерные мембраны. SDS или додецилсульфат натрия является широко используемым детергентом, который работает за счет солюбилизации белков и липидов, входящих в состав этих мембран. Затем содержимое может свободно плавать в окружающем растворе. 

Затем ДНК должна быть отделена от других присутствующих молекул. Добавленная в реакцию протеиназа К разрушает пептидные связи и переваривает загрязняющие белки. Затем в образец добавляют соль, которая стабилизирует отрицательно заряженные фосфатные группы в позвоночнике ДНК и после добавления ледяного спирта высаживает ДНК из раствора. Белый осадок собирается путем вращения его в центрифуге, где он оседает на дно пробирки. После промывки и ресуспендирования в буферном растворе извлеченная ДНК может быть использована в исследованиях или биотехнологиях. 

Некоторые биотехнологические приложения, такие как ДНК-дактилоскопия, которые могут идентифицировать новые паттерны в ДНК, специфичные для человека или людей, включают использование ферментов рестрикции. Ферменты рестрикции — это молекулы, которые взаимодействуют с ДНК и распознают определенные последовательности. Как только их конкретный участок идентифицирован, они разрезают ДНК. В результате прядь будет разрезана на одну или несколько линейных частей. Если выделенная ДНК была плазмидой, кольцевым участком ДНК, чаще всего встречающимся у бактерий, любые разрезы приведут к тому, что ДНК образует линейный фрагмент или фрагменты. Различные ферменты рестрикции распознают разные последовательности ДНК, поэтому использование их комбинации может привести к образованию отдельных фрагментов. 

При ДНК-дактилоскопии мы можем затем исследовать эти фрагменты с помощью метода, называемого ДНК или гель-электрофорезом. Для приготовления гелей порошкообразную агарозу смешивают с буфером и нагревают до растворения. Затем в теплую смесь добавляют нуклеотидное красило, а затем этот раствор заливают в литейную форму. Для формирования лунок вставляется гребень. После застывания гель перекладывается в гелевую коробку, заполненную буфером, и гребень удаляется. Эталонная смесь окрашенных фрагментов ДНК известной длины, лестница ДНК, добавляется в одну лунку, а окрашенные образцы ДНК, представляющие интерес, загружаются в остальные лунки. Коробка подключается к источнику питания, и включение питания индуцирует миграцию отрицательно заряженных фосфатных групп в нуклеотидах ДНК через гель к аноду, положительному концу. Более мелкие фрагменты движутся быстрее, чем более крупные фрагменты, которые мигрируют с трудом. 

Когда прогон завершен, гель подвергается воздействию ультрафиолетового света для визуализации нуклеотидного окрашивания в образцах ДНК. Их присутствие может быть подтверждено на основе их относительного расположения относительно лестничных лент. Поскольку ДНК с разными последовательностями будет иметь участки разреза в разных местах, это может привести к появлению новых полос или отпечатков пальцев, которые могут быть использованы для различения отдельных лиц или вариантов профилей ДНК. 

В этой лаборатории вы проведете экстракцию ДНК с использованием буфера с SDS и без него, чтобы оценить важность детергентов в выделении ДНК, а затем переварите плазмидную ДНК с различными ферментами рестрикции для изучения полученных профилей ДНК.

Выделение ДНК и анализ ферментов рестрикции

Открытие ДНК как наследственной молекулы во всех организмах привело к огромным научным и медицинским прорывам и значительно улучшило наше понимание себя и других организмов. Выделение и профилирование ДНК были фундаментальными первыми шагами для многих достижений прошлого века; от идентификации функции генов до революций в сельском хозяйстве и криминалистике.

<h4>Выделение ДНК из клеток</h4>

Выделение ДНК — довольно простая процедура, которая требует некоторых, но важных этапов: сбора клеток, лизиса, деградации белка и, наконец, осаждения ДНК. Как правило, ДНК может быть собрана из небольшого количества ткани, такой как один лист растения, волосяные фолликулы животных или эпителиальные клетки, которые могут быть легко отшелушены во рту с помощью простого физиологического раствора. Поскольку ДНК разделена внутри ядра или митохондрий в эукариотических клетках, ученые сначала разрушают клетку и ядерную мембрану, чтобы обнажить ДНК, что и делается на этапе лизиса. Однако, как только ДНК подвергается воздействию, она может разрушаться под действием ионов тяжелых металлов и экстремальных значений pH. Поэтому буферный раствор, содержащий детергент, используется не только для растворения клеточной мембраны, но и для защиты ДНК от деградации элементов в растворе. Кроме того, ДНК представляет собой необычно длинную молекулу, которая конденсируется внутри ядра за счет плотной упаковки вокруг специальных белков, называемых гистонами. Поэтому фермент под названием протеиназа К, который разрушает пептидные связи белков, добавляется, чтобы отделить ДНК от гистонов и других белков. Затем ученые отделяют ДНК от остальной части клеточного экстракта, используя его химические свойства. Благодаря отрицательно заряженной структуре нуклеиновых кислот ионы Na+ в растворе хлорида натрия связываются и интегрируются в запутанные нити ДНК. Как только ДНК слипается, ее можно наблюдать невооруженным глазом. ДНК нерастворима в спирте и легко выпадает в осадок при низких температурах, поэтому ученые добавляют холодный спирт для осаждения ДНК. Наконец, осажденная ДНК может быть растворена и храниться в деионизированной воде или мягком буфере, свободном от любых ферментов, которые могут разлагать нуклеиновые кислоты, до тех пор, пока она не будет использована.

<h4>Количественная оценка ДНК</h4>

Реакции, в которых используется ДНК, часто требуют высокой чистоты и точного количества ДНК. Поэтому после выделения ДНК ученые используют спектрофотометр для количественной оценки количества ДНК в образце, а также чистоты ДНК в образце. Спектрофотометр измеряет интенсивность светового луча, проходящего через образец, в зависимости от его длины волны. Нуклеиновые кислоты поглощают свет при длине волны 260 нм, в то время как белки поглощают свет при длине волны 280 нм. Измеряя интенсивность светового луча на длине волны 260 нм, ученые могут определить концентрацию ДНК. Кроме того, оценивая интенсивность света на длинах волн 260 нм и 280 нм, можно определить чистоту содержимого ДНК. В образце чистой ДНК соотношение 260/280 нм должно приближаться к значению 2.

<h4>Ферменты рестрикции</h4>

Для ряда анализов, таких как клонирование, секвенирование и картирование фрагментов ДНК и геномов, изолированную ДНК необходимо разрезать в определенных последовательностях с помощью ферментов рестрикции. Эти ферменты вырабатываются бактериями в качестве механизмов врожденного иммунитета против вторжения вирусной ДНК и функционируют как молекулярные ножницы. Следовательно, после того, как ферменты рестрикции идентифицируют вирусную ДНК, они начинают разбивать ее на сегменты, разрезая на сегменты в определенных нуклеотидных последовательностях, которые они распознают. Эти нуклеотидные последовательности часто имеют длину от шести до двенадцати нуклеотидов и, как правило, являются палиндромными, что означает, что они имеют одну и ту же последовательность нуклеотидов в направлениях 3'-5' и 5'-3'. Например, фермент рестрикции EcoRI разрезает ДНК в последовательности 3'... GAATTC...-5', который читается так же в направлении 5'-3'. Как и в случае с EcoRI, существуют сотни ферментов, которые соответствуют многим различным палиндромным последовательностям. После того, как ДНК разрезается этими ферментами, ученые могут загрузить ДНК на гель в камере электрофореза и пропустить электрический ток через гель. ДНК несет отрицательные заряды, что заставляет фрагменты ДНК мигрировать к аноду. Однако поры геля замедляют более крупные фрагменты ДНК по сравнению с меньшими последовательностями ДНК, поэтому кусочки разделяются в соответствии с их размером. После завершения электрофореза фрагменты ДНК могут быть визуализированы с помощью красителей, которые специфически связываются с молекулами ДНК.

Разрезание ДНК ферментами рестрикции и разделение фрагментов ДНК с помощью электрофореза позволяет исследователям идентифицировать размеры неизвестных фрагментов относительно стандартной лестницы. Эти представляющие интерес фрагменты затем могут быть дополнительно выделены и лигированы в плазмидный вектор для генетического клонирования. Благодаря этим методам генная инженерия и лабораторные анализы значительно улучшились. С помощью ДНК-профилирования ученые могут секвенировать геномы для лучшего понимания работы организмов, а также идентифицировать и охарактеризовать определенные гены.

Выделение и профилирование ДНК также практичны для событий, непосредственно влияющих на повседневную жизнь. Например, криминалисты регулярно анализируют образцы ДНК для предоставления доказательств по уголовным и гражданским делам. Аналогичным образом, медицинские работники извлекают и анализируют ДНК для проверки отцовства и генетических заболеваний. В последнее время стали популярными наборы для анализа родословной ДНК, позволяющие пользователям определить свою генетическую родословную, найти родственников и даже обнаружить их генетическую предрасположенность кразличным заболеваниям. Наконец, с развитием биотехнологии и генной инженерии, персонализированная медицина набирает обороты среди клинических исследователей для разработки методов лечения с использованием генетических данных человека, прокладывая путь к эффективному лечению пациентов без вредных побочных эффектов.

<h4>Ссылки</h4>

<ol class="ссылки">
	<li>Chambers, GK, et al. ДНК-дактилоскопия в зоологии: прошлое, настоящее, будущее. Investig Genet. 2014, Том 5, 3 doi: 10.1186/2041-2223-5-3.</li>
	<li>Roewer, L. ДНК-дактилоскопия в криминалистике: прошлое, настоящее, будущее. Investig Genet. . . 2013, Том 4, 22 doi: 10.1186/2041-2223-4-22.</li>
	<li>Киркпатрик, Б.Э. и Рашкин, М.Д. Тестирование родословной и практика генетического консультирования. J Gen Консультирование. 2016, Том 26, 1 (6-20).</li>
	<li>Гамбург, Массачусетс и Коллинз, Ф.С. Путь к персонализированной медицине. N Engl J Med . 2010; , Vol. 363, 301-304.</li>
</ol>

Открытие ДНК как наследственной молекулы во всех организмах привело к огромным научным и медицинским прорывам и значительно улучшило наши ...

Education

JoVE Lab Manual

Биология

Genetics

Генетика

dna extraction, quantification, and cutting

DNA extraction, quantification, and cutting are key steps in many biology labs. Scientists use these methods to study genes, prepare DNA for testing, and compare fragments for analysis.

DNA isolation starts with a small sample, such as a leaf, hair follicles, or epithelial cells from the mouth collected with a saline solution. The first steps are cell harvesting, lysis, protein degradation, and DNA precipitation. Lysis breaks open the cell and nuclear membranes so the DNA can be released from the nucleus or mitochondria in eukaryotic cells. A detergent-containing buffer helps dissolve membranes and also protects DNA from degrading conditions such as heavy metal ions and extreme pH.

After the DNA is exposed, Proteinase K is added. This enzyme breaks peptide bonds in proteins and helps separate DNA from histones and other proteins. The DNA is then mixed with sodium chloride, and Na+ ions help the tangled DNA strands clump together because nucleic acids carry negative charges. Cold alcohol is added next, since DNA does not dissolve in alcohol and will precipitate at low temperatures. The DNA can then be dissolved in deionized water or a mild buffer for storage, as long as the solution is free of enzymes that could break it down.

Once DNA is isolated, scientists often measure how much DNA they have and how pure it is. A spectrophotometer does this by sending light through the sample at specific wavelengths. DNA absorbs light at 260 nm, while proteins absorb light at 280 nm. The 260 nm reading shows DNA concentration, and the 260/280 ratio helps estimate purity. In a sample of pure DNA, that ratio should approach 2.

For cloning, sequencing, and mapping DNA fragments or genomes, scientists often need to cut DNA at specific sites. They use restriction enzymes, which are bacterial proteins that act like molecular scissors against invading viral DNA. These enzymes recognize short nucleotide sequences, often six to twelve bases long, and the sequences are usually palindromic, meaning they read the same in both directions. EcoRI is one example and cuts at the sequence GAATTC.

After cutting, the DNA fragments are loaded into a gel and separated by electrophoresis. DNA is negatively charged, so it moves toward the anode when an electric current is applied. Smaller fragments travel faster through the gel pores than larger ones, so the pieces separate by size. Dyes that bind to DNA make the fragments visible, and researchers compare them with a standard ladder to estimate fragment size. The fragments can then be isolated and ligated into a plasmid vector for genetic cloning.

These methods support many modern applications. Scientists use DNA profiling to sequence genomes and to identify and study genes. DNA analysis also helps in forensics for criminal and civil cases, in paternity testing, and in checks for genetic diseases. Ancestry kits use DNA to help people trace lineage, find relatives, and learn about possible health traits. These tools also support personalized medicine, where researchers use a person’s genetic data to design treatments with fewer harmful side effects.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting

dna-extraction-quantification-and-cutting

genetics of organisms

Mendelian Traits and Exceptions

Mendelian genetics explains how traits move from parents to offspring. Gregor Mendel studied pea plants in 1865 and showed that many visible traits are controlled by two alleles, or gene versions, with one inherited from each parent. He also found that some alleles are dominant and others are recessive. Mendel’s work was not widely accepted until 1900, and it took about 30 more years for Mendelian inheritance to fit into evolutionary theory. One reason for the delay was that real breeding...

dna isolation and restriction enzyme analysis

DNA extraction, quantification, and cutting are key steps in many biology labs. Scientists use these methods to study genes, prepare DNA for testing, and compare fragments for analysis. DNA isolation starts with a small sample, such as a leaf, hair follicles, or epithelial cells from the mouth collected with a saline solution. The first steps are cell harvesting, lysis, protein degradation, and DNA precipitation. Lysis breaks open the cell and nuclear membranes so the DNA can be released from...

bacterial transformation

Plasmid DNA Transfer in Bacteria

Plasmid DNA transfer in bacteria helped launch modern genetic engineering. The idea traces back to Frederick Griffith’s work on pneumonia-causing Streptococcus pneumoniae in the early 20th century. He studied a rough, non-virulent R strain and a smooth, virulent S strain with a protective polysaccharide capsule. When he injected mice with heat-killed bacteria of either strain, the mice survived. But when heat-killed S-strain bacteria were mixed with live R-strain bacteria, the mice died, and...

genetics

Learn how DNA is isolated, measured with a spectrophotometer, cut with restriction enzymes, and separated by gel electrophoresis for analysis.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting | JoVE K12

Подготовьтесь к преподаванию Выделение ДНК и анализ ферментов рестрикции с помощью этого 2-минутного руководства для преподавателей. Охватывает ключевые этапы подготовки для лаборатории Biology на JoVE Lab Manual.

Подготовка преподавателя по Выделение ДНК и анализ ферментов рестрикции в Biology - Более 14K просмотров | JoVE Lab Manual

Следуйте пошаговым процедурам Выделение ДНК и анализ ферментов рестрикции в этом 13-минутном видео студенческого протокола. Часть коллекции Biology на JoVE Lab Manual.

Студенческий протокол по Выделение ДНК и анализ ферментов рестрикции в Biology - Более 33K просмотров | JoVE Lab Manual

What is Meiosis?

Meiosis is the process by which diploid cells divide to produce haploid daughter cells. In humans, each diploid cell contains 46 chromosomes, half from ...

Meiosis I

Meiosis II

Meiosis vs. Mitosis

Crossing Over

Crossing over is the exchange of genetic information between homologous chromosomes during prophase I of meiosis I. Genetic recombination gives rise to ...

Nondisjunction

Nondisjunction is the failure of homologous chromosomes or sister chromatids to separate correctly and move to the opposite poles of the cells. This ...

Spermatogenesis

Spermatogenesis is the process by which haploid sperm cells are produced in the male testes. It starts with stem cells located close to the outer rim of ...

Oogenesis

In human women, oogenesis produces one mature egg cell or ovum for every precursor cell that enters meiosis. This process differs in two unique ways from ...

Fertilization

During fertilization, an egg and sperm cell fuse to create a new diploid structure. In humans, the process occurs once the egg has been released from the ...

Cleavage and Blastulation

After a large-single-celled zygote is produced via fertilization, the process of cleavage occurs while zygotes travel through the uterine tube. Cleavage ...

Gastrulation

Gastrulation establishes the three primary tissues of an embryo: the ectoderm, mesoderm, and endoderm. This developmental process relies on a series of ...

Neurulation

Neurulation is the embryological process which forms the precursors of the central nervous system and occurs after gastrulation has established the three ...

Cell Migration

Cell migration, the process by which cells move from one location to another, is essential for the proper development and viability of organisms ...

Determination

During embryogenesis, cells become progressively committed to different fates through a two-step process: specification followed by determination. ...

Use models to explain how DNA is passed from parents to offspring through the processes of meiosis and fertilization in sexual reproduction.

LS.Bio.6.1

Mutations

Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

genome-size-and-the-evolution-of-new-genes

Genome Size and the Evolution of New Genes

types-of-genetic-transfer-between-organisms

Types of Genetic Transfer Between Organisms

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Overview of DNA Repair

Base Excision Repair

Nucleotide Excision Repair

DNA Distortion and Damage
Cells are regularly exposed to mutagens&#8212;factors in the environment that can damage DNA and generate mutations. UV ...

Mismatch Repair

Organisms are capable of detecting and fixing nucleotide mismatches that occur during DNA replication. This sophisticated process requires identifying the ...

Fixing Double-strand Breaks

Homologous Recombination

Gene Conversion

Restarting Stalled Replication Forks

Construct an explanation to summarize how inheritable genetic variations may result from: new genetic combinations in meiosis, mutations during replication, or mutations caused by environmental factors.

LS.Bio.6.2

An Overview of Genetic Analysis

An organism&#8217;s physical traits, or phenotype, are a product of its genotype, which is the combination of alleles (gene variants) inherited from its ...

Genetic Crosses

To dissect genetic processes or create organisms with novel suites of traits, scientists can perform genetic crosses, or the purposeful mating of two ...

Punnett Squares

Monohybrid Crosses

Dihybrid Crosses

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Law of Independent Assortment

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

Pedigree Analysis

Multiple Allele Traits

Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

Lethal Alleles

Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

Use mathematics and computational thinking to predict the variation and distribution of expressed traits based on: Mendelian inheritance, co-dominance, incomplete dominance, multiple alleles, and sex-linked inheritance.

LS.Bio.7.1

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Probability Laws

Overview

The probability of inheriting a trait can be calculated using the sum and product rules. The sum rule is used to calculate the probability of ...

The Concept of Multiple Allelism

Multiple allelism describes genes that exist in three or more allelic forms. Although diploid organisms, like humans, ...

Analyze and interpret data to explain how polygenic traits result in a wide range of phenotypes.

LS.Bio.7.2

Pleiotropy

Pleiotropy is the phenomenon in which a single gene impacts multiple, seemingly unrelated phenotypic traits. For example, defects in the SOX10 gene cause ...

Nature and Nurture

Many human characteristics, like height, are shaped by both nature&mdash;in other words, by our genes&mdash;and by nurture, or our environment. For ...

Construct an explanation to summarize how traits result from interactions of genetic factors (multiple genes and/or alleles) and environmental factors.

LS.Bio.7.3

PCR: The Polymerase Chain Reaction

The polymerase chain reaction, or PCR, is a technique used to amplify DNA through thermocycling &#8211; cyles of temperature changes at fixed time ...

DNA Gel Electrophoresis

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

DNA Isolation

DNA isolation protocols can be fast and straightforward or complex and time-consuming depending on the type and quality of DNA required for further ...

Restriction Enzymes

Restriction enzymes are bacterial enzymes used to cut DNA in a sequence-specific manner. To cleave DNA, they bind to specific palindromic sequences called ...

DNA Agarose Gel Electrophoresis

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify ...

The revelation of DNA as the hereditary molecule in all organisms has led to enormous scientific and medical breakthroughs and significantly enhanced our ...

Preparation of Solutions and Materials
ExpandNOTE: For this lab to run smoothly, it is recommended to not exceed 12 samples per laboratory class.
First ...

DNA Isolation
ExpandNOTE: In this experiment you will perform DNA isolation under two experimental conditions: one using a buffer containing the detergent ...

Analyze and interpret data to compare DNA samples.

Transgenic Organisms

Reproductive Cloning

CRISPR

Synthetic Biology

Synthetic biology is an interdisciplinary science that involves using principles from disciplines such as engineering, molecular biology, cell biology, ...

Ribosome Profiling

Ribosome profiling or ribo-sequencing is a deep sequencing technique that produces a snapshot of active translation in a cell. It selectively sequences ...

Transgenic Plants

Recombinant DNA technology called transgenesis is often used to add a foreign gene or remove a detrimental gene from an organism. Such genetically ...

Gene Therapy

biofuels-producing-ethanol-from-cellulosic-material

Biofuels: Producing Ethanol from Cellulosic Material

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
In this experiment, cellulosic material (such as corn stalks, leaves, ...

Testing For Genetically Modified Foods

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
Genetic modification of foods has been a controversial issue due to debated ...

Obtain and communicate information that summarizes the impact of biotechnology applications on the individual, society, and the environment, including agriculture and medicine.

LS.Bio.8.2

Understand genetic mechanisms for variation.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards